胺脫氫酶催化合成手性胺的機(jī)遇與挑戰(zhàn)

陳飛飛，汪東浩，許建和，鄭高偉

(華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200237)

手性胺廣泛存在于各種生物活性分子中，是合成藥物、天然產(chǎn)物、農(nóng)藥、精細(xì)化學(xué)品等產(chǎn)品的重要手性中間體。近年來，美國FDA批準(zhǔn)上市的化學(xué)藥物分子中約40%含有手性胺的結(jié)構(gòu)(圖1)，正所謂“無氮不成藥”[1]。此外，手性胺還被作為手性拆分劑、手性配體等用于各種手性化合物的制備。手性胺的合成已經(jīng)引起學(xué)術(shù)界和工業(yè)界的廣泛關(guān)注，其中酮的不對(duì)稱還原胺化，在2007年由美國化學(xué)會(huì)與輝瑞等十余家全球制藥巨頭企業(yè)聯(lián)合召開的圓桌會(huì)議上，被認(rèn)定為制藥工業(yè)中第二理想的反應(yīng)[2]，這是因?yàn)橥牟粚?duì)稱還原胺化制備手性胺具有只生成副產(chǎn)物H2O、使用廉價(jià)的氨作為氨基供體、產(chǎn)品分離過程簡單等優(yōu)勢。然而大多數(shù)化學(xué)合成途徑需要高溫高壓等苛刻的反應(yīng)條件、使用有毒有害的試劑和重金屬催化劑、多步結(jié)晶提升產(chǎn)品的光學(xué)純度，這些限制了它們?cè)诠I(yè)中的廣泛應(yīng)用[3]。因此亟待研究開發(fā)更加綠色的途徑替代這些不可持續(xù)的生產(chǎn)工藝。

圖1 含有手性胺結(jié)構(gòu)的藥物分子Fig.1 Pharmaceuticals contain a chiral amine moiety

隨著定向進(jìn)化等蛋白質(zhì)工程技術(shù)的發(fā)展，酶催化已成為替代藥品、精細(xì)化學(xué)品和農(nóng)用化學(xué)品等化學(xué)合成途徑的重要手段，特別是對(duì)于手性化學(xué)品的合成[4-6]，這主要是因?yàn)樗哂辛Ⅲw選擇性高、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。已報(bào)道的用于合成手性胺的酶主要有脂肪酶[7]、轉(zhuǎn)氨酶[8-10]、胺氧化酶[11-13]、氨裂解酶[14-15]、亞胺還原酶[16-19]和還原胺化酶[20]等。其中，近年來開發(fā)的胺脫氫酶(amine dehydrogenase,AmDH)為手性胺的合成提供了更理想的合成途徑。它能夠以NAD(P)H為輔因子催化酮與氨發(fā)生不對(duì)稱還原胺化反應(yīng)，合成相應(yīng)的手性胺，該過程使用比較廉價(jià)的氨作為氨基供體，所生成的副產(chǎn)物只有H2O，因此被認(rèn)為是更加綠色的合成途徑(圖2)。

圖2 胺脫氫酶催化酮不對(duì)稱還原胺化反應(yīng)Fig.2 Asymmetric reductive amination of ketones to chiral amines by amine dehydrogenases

自從2012年美國佐治亞理工學(xué)院的Abrahamson等[21]首次通過分子進(jìn)化創(chuàng)制出工程胺脫氫酶以來，對(duì)胺脫氫酶的研究引起了全球的廣泛關(guān)注。目前已有多個(gè)胺脫氫酶被報(bào)道(表1)，不僅包括開發(fā)出的多種工程胺脫氫酶，也含有鑒定出的天然胺脫氫酶。通過蛋白質(zhì)工程技術(shù)拓展了酶的底物譜，利用固定化、反應(yīng)介質(zhì)設(shè)計(jì)等傳統(tǒng)手段強(qiáng)化了酶的催化效率和生產(chǎn)強(qiáng)度，特別是利用新開發(fā)的胺脫氫酶，設(shè)計(jì)構(gòu)建一系列多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)途徑，為從廉價(jià)原料到高附加值手性胺的高效簡潔合成提供了可行性。本文中，筆者主要綜述胺脫氫酶近些年來取得的一些重要研究進(jìn)展，并預(yù)測其未來面臨的發(fā)展機(jī)遇與挑戰(zhàn)。

表1 文獻(xiàn)報(bào)道的胺脫氫酶

1 天然胺脫氫酶的發(fā)現(xiàn)

1999年，日本富山縣立大學(xué)的Itoh等[22]首次從自然界中鑒定出了一個(gè)來源于Streptomycesvirginiae的NADH依賴型胺脫氫酶SvAmDH。該酶具有廣泛的催化底物范圍，可催化醛類、酮類、酮醇類及酮酸類化合物的還原胺化及甲胺、正己烷、絲氨醇等胺類化合物的氧化脫氨反應(yīng)(圖3)，但是其存在活力較低、對(duì)映體選擇性較差等缺點(diǎn)，且其核酸和蛋白質(zhì)序列信息至今尚未報(bào)道。

圖3 SvAmDH催化的反應(yīng)類型Fig.3 Reductive amination reactions catalyzed by SvAmDH

2016年，Vergne-Vaxelaire課題組的Mayol等[23]通過基因挖掘和對(duì)構(gòu)建的酶庫進(jìn)行功能篩選，獲得了能夠催化4-氧代戊酸不對(duì)稱還原胺化生成(S)-4-氨基戊酸的天然胺脫氫酶AmDH4，其對(duì)4-氧代戊酸的催化比酶活可達(dá)50 mU/mg，且在60 ℃下的半衰期長達(dá)65 h。該酶可以高效催化高達(dá)500 mmol/L的4-氧代戊酸不對(duì)稱還原胺化生成(S)-4-氨基戊酸，產(chǎn)品得率達(dá)88%，光學(xué)純度(對(duì)映體過量值e.e.)達(dá)99.5%以上(圖4)，表現(xiàn)出了極好的應(yīng)用潛力。

圖4 胺脫氫酶催化的4-氧代戊酸不對(duì)稱還原胺化反應(yīng)Fig.4 Reductive amination of 4-oxopentanoic acid to (S)-4-aminopentanoic acid catalyzed by AmDH4

在上述研究的基礎(chǔ)上，最近Vergne-Vaxelaire課題組的Mayol等[30]通過進(jìn)一步基因挖掘得到一系列可催化酮不對(duì)稱還原胺化的天然胺脫氫酶(nat-AmDH)。該家族的胺脫氫酶與之前報(bào)道的催化還原胺化反應(yīng)的酶如工程胺脫氫酶、亞胺還原酶和還原胺化酶均非同一家族。為探明該家族胺脫氫酶的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，他們解析了3種代表性酶的晶體結(jié)構(gòu)(圖5)。在此基礎(chǔ)上，對(duì)AmDH4底物結(jié)合口袋附近的極性氨基酸突變?yōu)槭杷园被?，最終構(gòu)建的四點(diǎn)組合突變體AmDH4N135V/N163V/R161M/H264L對(duì)原本難以催化的疏水型底物2-戊酮表現(xiàn)出良好的催化性能，比酶活可達(dá)104.8 mU/mg。此外，對(duì)此類天然胺脫氫酶家族2 000多條序列進(jìn)行了分析，揭示了該家族酶系的進(jìn)化與聚類關(guān)系。此酶家族分為5個(gè)亞家族，G1、G2、G3和G4進(jìn)化關(guān)系相對(duì)較近，其中G1亞家族的酶不具有2,4-二氨基庚二酸脫氫酶的活性，而G2亞家族的酶(包含AmDH4)具有此種活性。G3和G4亞家族中均發(fā)掘出天然胺脫氫酶，G5亞家族的進(jìn)化關(guān)系相對(duì)其他4個(gè)亞家族較遠(yuǎn)。此研究為后續(xù)此類胺脫氫酶的進(jìn)化與應(yīng)用研究提供了一定的研究基礎(chǔ)。

(a)AmDH4與輔酶NAD+的結(jié)構(gòu) (b) CfusAmDH與輔酶NADP+的結(jié)構(gòu) (c)MsmeAmDH與輔酶NADP+的結(jié)構(gòu)圖5 3種nat-AmDH家族胺脫氫酶的晶體結(jié)構(gòu)Fig.5 Structures of three native amine dehydrogenases

2 工程胺脫氫酶的開發(fā)

2.1 基于亮氨酸脫氫酶改造的胺脫氫酶

氨基酸脫氫酶(amino acid dehydrogenase,AADH)是一類以NAD(P)H為輔因子的氧化還原酶，它能夠可逆地催化氨基酸的氧化脫氨和α-酮酸的不對(duì)稱還原胺化。2012年，Abrahamson等[21]以天然存在的Bacillusstereothermophilus亮氨酸脫氫酶為模板，通過多輪的分子進(jìn)化，首次創(chuàng)制出了新穎的非天然胺脫氫酶，將酶活性口袋中與天然底物羧基結(jié)合的2個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)K68和N261由親水性殘基突變?yōu)槭杷詺埢?8S和261L之后，其催化的底物類型由脂肪族氨基酸改變?yōu)椴缓然闹就惢衔?圖6)，這也表明K68和N261是以氨基酸脫氫酶為模板創(chuàng)制工程胺脫氫酶的關(guān)鍵突變位點(diǎn)。

圖6 天然氨基酸脫氫酶(a)與工程胺脫氫酶(b) 催化的反應(yīng)Fig.6 Asymmetric reductive amination of keto acid by amino acid dehydrogenase (a) and ketone by amine dehydrogenase (b)

2.2 基于苯丙氨酸脫氫酶改造的胺脫氫酶

2013年，Abrahamson等[24]又以來源于Bacillusbadius的苯丙氨酸脫氫酶結(jié)構(gòu)為進(jìn)化模板，對(duì)與羧基結(jié)合的兩個(gè)關(guān)鍵殘基K77和N276進(jìn)行組合飽和突變，通過篩選獲得了底物譜改變的突變體K77S/N276L，其催化的底物由苯丙氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)闊o羧基的苯基丙酮類似物，從而創(chuàng)制出了苯丙胺類胺脫氫酶，它能夠催化芳香酮的不對(duì)稱還原胺化，與通過亮氨酸脫氫酶改造而來的胺脫氫酶，在底物譜上形成了互補(bǔ)，彌補(bǔ)了亮氨酸脫氫酶來源的胺脫氫酶難以催化芳香酮化合物還原胺化的不足。將該酶應(yīng)用于芳香酮底物4-氟苯基丙酮的不對(duì)稱還原胺化，合成了(R)-4-氟-α-甲基苯乙胺，產(chǎn)品e.e.值高達(dá)99.8% (圖7)，進(jìn)一步證明通過對(duì)氨基酸脫氫酶的分子進(jìn)化創(chuàng)制胺脫氫酶是可行的。隨后，該課題組將亮氨酸脫氫酶和苯丙氨酸脫氫酶進(jìn)化而來的兩種胺脫氫酶通過domain shuffling構(gòu)建成了一個(gè)“雜合”的胺脫氫酶，該酶表現(xiàn)出與原來兩種胺脫氫酶均不同的底物特異性[25]。

圖7 胺脫氫酶催化的4-氟苯基丙酮不對(duì)稱還原胺化Fig.7 AmDH-catalyzed asymmetric reductive amination of p-fluorophenylacetone

受此結(jié)果啟發(fā)，隨后多個(gè)課題組陸續(xù)報(bào)道了通過分子改造苯丙氨酸脫氫酶創(chuàng)制苯丙胺類胺脫氫酶的成功案例。例如，新加坡國立大學(xué)的Li課題組的Ye等[26]通過定向進(jìn)化將來源于Rhodococcussp.M4的苯丙氨酸脫氫酶突變?yōu)楸奖奉惏访摎涿窽M-pheDH，該酶不僅能夠以4-氟苯基丙酮為底物，還能催化4-苯基-2-丁酮的不對(duì)稱還原胺化(圖8)，進(jìn)一步拓寬了苯丙胺類胺脫氫酶的催化底物譜。2017年，Schell課題組的Pushpanath等[27]也通過對(duì)嗜熱菌Caldalkalibacillusthermarum來源的苯丙氨酸脫氫酶進(jìn)行進(jìn)化，獲得了一個(gè)熱穩(wěn)定好(Tm83.5 ℃)的胺脫氫酶Cal-AmDH，該酶對(duì)苯丙酮類似物如4-氟苯基丙酮、2-氟苯基丙酮、4-甲基苯基丙酮及苯氧基丙酮等底物均顯示出較高的催化活力，并且在兩相反應(yīng)體系中實(shí)現(xiàn)了高達(dá)400 mmol/L苯氧基丙酮的不對(duì)稱還原胺化，表現(xiàn)出了一定的實(shí)用前景。

圖8 胺脫氫酶TM-pheDH催化的4-苯基-2-丁酮 不對(duì)稱還原胺化Fig.8 Asymmetric reductive amination of 4-phenyl- 2-butanone catalyzed by amine dehydroge- nase TM-pheDH

2.3 基于L-賴氨酸ε-脫氫酶改造的胺脫氫酶

最近，荷蘭阿姆斯特丹大學(xué)的Mutti課題組的Tseliou等[28]以L-賴氨酸ε-脫氫酶作為模板，對(duì)活性位點(diǎn)周圍殘基進(jìn)行突變，獲得了具有不對(duì)稱還原胺化功能的胺脫氫酶(LE-AmDH-v1)，該酶不僅具有非常高的熱穩(wěn)定性，而且具有較寬的底物譜，對(duì)醛酸、酮酸、醛、脂肪酮和芳香酮等化合物都顯示出一定的胺化活性。

2.4 胺脫氫酶的分子改造

工程胺脫氫酶都是由天然氨基酸脫氫酶改造而來的，它們能催化的化合物都是天然底物的類似物，存在底物譜偏窄的問題，這極大地限制了它們?cè)谑中园泛铣芍械膽?yīng)用范圍。例如，由亮氨酸脫氫酶改造而來的胺脫氫酶，其底物脂肪酮的鏈長通常小于6個(gè)碳原子。筆者所在課題組[29]利用自主研發(fā)的氨基酸脫氫酶作為模板，通過生物分子工程手段開發(fā)出了3個(gè)新的胺脫氫酶，并針對(duì)其底物譜較窄的問題，采用計(jì)算機(jī)輔助的蛋白質(zhì)工程技術(shù)，確定了酶活性口袋中影響酶與大位阻底物結(jié)合的關(guān)鍵殘基(Ala113與Thr134)，通過將其突變成分子最小的甘氨酸(Gly)，所構(gòu)建的突變體LfAmDH(A113G/T134G)實(shí)現(xiàn)了對(duì)活性口袋的“容積拓展”(圖9)，從而將該酶所催化的底物范圍由最長6個(gè)碳鏈長的脂肪酮拓展至長達(dá)10個(gè)碳鏈長的脂肪酮(如2-庚酮、2-辛酮和2-壬酮)，顯著拓寬了該酶催化的底物范圍。此外，這兩個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基的突變?cè)诹硗?個(gè)同源胺脫氫酶的改造中也具有類似的效果，這為其他不同胺脫氫酶的底物譜拓展提供了有益參考。

圖9 胺脫氫酶LfAmDH與其突變體的底物結(jié)合口袋對(duì)比Fig.9 Illustration of the substrate-binding pockets of LfAmDH and its mutant (A113G/T134G) with docked substrate 2-heptanone

最近，筆者所在課題組[31]又對(duì)來源于Lysinibacillusfusiformis的氨基酸脫氫酶進(jìn)行分子改造，創(chuàng)制出了能夠催化α-羥基酮不對(duì)稱還原胺化的胺脫氫酶(圖10)，并通過進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)改造，拓展了底物結(jié)合口袋的空間，拓寬了其催化的底物范圍。最優(yōu)突變體可以高立體選擇性地不對(duì)稱還原胺化不同鏈長α-羥基酮，合成相應(yīng)的(S)-鄰位氨基醇，該酶也已成功用于抗結(jié)核藥乙胺丁醇前體的合成。該工作將胺脫氫酶的底物譜由酮類化合物拓展到羥基酮類化合物，為手性藥物中間體鄰位氨基醇的合成提供了新穎的生物催化劑。

圖10 胺脫氫酶催化的α-羥基酮不對(duì)稱 還原胺化合成手性鄰位氨基醇Fig.10 Asymmetric reductive amination of α-hydroxy ketones catalyzed by amine dehydrogenase for chiral vicinal amino alcohols synthesis

3 反應(yīng)工程調(diào)控

3.1 兩相反應(yīng)體系

開發(fā)有機(jī)相/水相兩相反應(yīng)體系是生物催化的一種重要策略，可以解決底物或產(chǎn)物對(duì)于酶的動(dòng)力學(xué)抑制作用，或者在熱力學(xué)上促進(jìn)反應(yīng)向著產(chǎn)物生成的方向進(jìn)行。胺脫氫酶催化的大多數(shù)底物都是水不溶性的羰基化合物，導(dǎo)致較低的生產(chǎn)效率，而常規(guī)添加助溶劑的策略經(jīng)常導(dǎo)致胺脫氫酶的失活。為了解決這一問題，Au等[32]開發(fā)了庚烷/緩沖液兩相介質(zhì)反應(yīng)體系(圖11)，顯著提升了手性胺的合成效率，也實(shí)現(xiàn)了對(duì)在水相中水相溶解性差底物(如1-金剛烷基甲基甲酮等)的不對(duì)稱還原胺化。

圖11 胺脫氫酶兩相反應(yīng)體系實(shí)現(xiàn)疏水性酮 底物的不對(duì)稱胺化還原Fig.11 A biphasic reaction system for asymmetric reductive amination of hydrophobic ketone substrates using AmDH

Pushpanath等[27]針對(duì)產(chǎn)物對(duì)胺脫氫酶存在抑制的問題，也開發(fā)了乙酸異戊酯/銨鹽緩沖液雙相反應(yīng)體系，有效解決了高濃度底物/產(chǎn)物導(dǎo)致的胺脫氫酶Cal-AmDH失活問題，實(shí)現(xiàn)了高達(dá)400 mmol/L苯氧基丙酮的高效生物轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生的(R)-1-苯氧基-2-丙胺的e.e.值達(dá)99%以上。

由此可見，反應(yīng)介質(zhì)的設(shè)計(jì)也能有效提升胺脫氫酶高效合成手性胺的效率，未來研究中可以嘗試其他反應(yīng)介質(zhì)，如反膠束、離子液體等。

3.2 酶的固定化

酶的固定化是提升酶穩(wěn)定性的常用策略，有利于酶的回收及循環(huán)利用。胺脫氫酶的固定化研究也已經(jīng)被報(bào)道，如Liu等[33]成功實(shí)現(xiàn)了胺脫氫酶在磁性納米顆粒上的固定化，他們將含有組氨酸標(biāo)簽的重組蛋白與鎳-次氮基三乙酸功能化的納米顆粒通過親和吸附實(shí)現(xiàn)固定化，利用共固定化的胺脫氫酶與葡萄糖脫氫酶作為催化劑，實(shí)現(xiàn)了40 mmol/L 4-苯基-2-丁酮的不對(duì)稱還原胺化，底物轉(zhuǎn)化率達(dá)74%，產(chǎn)物e.e.值達(dá)99%。2016年，Ren等[34]報(bào)道了利用TiO2納米顆粒對(duì)胺脫氫酶進(jìn)行固定化，該研究首先利用聚乙烯亞胺包裹胺脫氫酶為酶創(chuàng)造親水的微環(huán)境，再利用處理后的酶作為模板誘導(dǎo)鈦前體物質(zhì)的水解和凝縮，從而形成納米固定化酶顆粒，顯著提升了酶的熱穩(wěn)定性。此外，在實(shí)際的應(yīng)用中，酶的固定化不僅有利于酶的回收再利用，也可以降低生產(chǎn)成本。因此，胺脫氫酶固定化技術(shù)的探索將會(huì)促進(jìn)該酶在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用。

4 多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)

4.1 胺脫氫酶/醇脫氫酶催化的雙酶“借氫”級(jí)聯(lián)

醇的不對(duì)稱胺化是化學(xué)合成中的重要路線，但是存在選擇性差、使用過渡金屬等問題[35]。2015年，Turner課題組的Mutti等[36]利用胺脫氫酶與醇脫氫酶(ADH)耦聯(lián)構(gòu)建了催化醇轉(zhuǎn)化為手性胺的雙酶“借氫”級(jí)聯(lián)途徑(圖12)。該級(jí)聯(lián)反應(yīng)途徑首先利用醇脫氫酶(來源于Aromatoleumsp.、Lactobacillussp.、Bacillussp.等)實(shí)現(xiàn)芳香族或脂肪族伯醇或外消旋仲醇的氧化，生成相應(yīng)的醛或甲基酮中間產(chǎn)物，再通過第二步胺脫氫酶催化的胺化還原反應(yīng)，將中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為胺產(chǎn)物。第一步氧化反應(yīng)產(chǎn)生的還原性氫(NADH)可以被第二步胺化反應(yīng)所利用，因此該級(jí)聯(lián)反應(yīng)是一個(gè)氧化還原力自給自足的過程，通過“借氫”實(shí)現(xiàn)醇到胺的轉(zhuǎn)化，是一個(gè)原子經(jīng)濟(jì)性高的綠色轉(zhuǎn)化過程。利用該級(jí)聯(lián)反應(yīng)將伯醇轉(zhuǎn)化為相應(yīng)胺產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率高達(dá)99%；將仲醇轉(zhuǎn)化為相應(yīng)R型手性胺產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率高達(dá)96%，e.e.值高達(dá)99%。

圖12 由醇到胺的雙酶“借氫”級(jí)聯(lián)反應(yīng)路徑Fig.12 A two-enzyme “hydrogen-borrowing” cascade for amination of alcohols

幾乎同時(shí)，筆者所在課題組[37-38]同樣報(bào)道了胺脫氫酶與醇脫氫酶耦聯(lián)實(shí)現(xiàn)外消旋仲醇到手性胺轉(zhuǎn)化的相同研究思路，利用來源于Exiguobacteriumsibiricum的亮氨酸脫氫酶自主改造而來的胺脫氫酶EsAmDH與通過基因挖掘獲取的來源于Streptomycescoelicolor的一株醇脫氫酶ScCR分別實(shí)現(xiàn)醇的氧化和隨后的胺化過程，將一系列脂肪族仲醇和苯乙醇轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的手性胺產(chǎn)物，胺的得率最高達(dá)97%，手性胺的e.e.值>99%。值得一提的是，相對(duì)于Turner課題組的報(bào)道，筆者獨(dú)立開發(fā)的該級(jí)聯(lián)路徑所使用的醇脫氫酶ScCR對(duì)于外消旋仲醇的對(duì)映選擇性較弱，因此可以將外消旋仲醇中的兩種異構(gòu)體同時(shí)氧化，避免了同時(shí)添加兩種對(duì)映選擇性互補(bǔ)的醇脫氫酶。另外，該級(jí)聯(lián)反應(yīng)路徑無需對(duì)兩步所用的酶進(jìn)行純化，使用粗酶粉可以實(shí)現(xiàn)較高的轉(zhuǎn)化效率，簡化了反應(yīng)操作過程。在筆者課題組和Turner課題組提出此雙酶級(jí)聯(lián)概念基礎(chǔ)上，不同課題組通過對(duì)醇脫氫酶輔酶依賴性的改造[39]、使用固定化酶技術(shù)[40]或采用全細(xì)胞催化[41-42]，使該級(jí)聯(lián)體系的應(yīng)用性研究得以拓展。

4.2 P450/醇脫氫酶/胺脫氫酶級(jí)聯(lián)催化碳?xì)滏I胺化

對(duì)烷烴化合物進(jìn)行C—H鍵不對(duì)稱胺化是合成手性胺的一條新穎的路徑，但是化學(xué)法實(shí)現(xiàn)該路徑面臨著反應(yīng)條件苛刻、使用過渡金屬催化劑、選擇性差等問題。2015年，Both等[43]實(shí)現(xiàn)C—H鍵胺化的全細(xì)胞催化體系，通過利用P450單加氧酶/醇脫氫酶/轉(zhuǎn)氨酶三酶共表達(dá)的全細(xì)胞作為催化劑，實(shí)現(xiàn)了乙苯及其幾種衍生物的C—H鍵胺化(e.e.值97.5%)。鑒于胺脫氫酶催化的胺化還原過程具有較高的原子經(jīng)濟(jì)性，筆者所在課題組[44]構(gòu)建了P450單加氧酶/醇脫氫酶/胺脫氫酶耦聯(lián)的級(jí)聯(lián)的反應(yīng)路徑(圖13)，該級(jí)聯(lián)反應(yīng)路徑同樣利用P450單加氧酶催化烷烴的羥化，再利用醇脫氫酶ScCR和胺脫氫酶EsAmDH分別實(shí)現(xiàn)醇的脫氫和酮的胺化。利用構(gòu)建的P450單加氧酶、木糖脫氫酶(NADPH依賴性，用于與P450單加氧酶實(shí)現(xiàn)輔酶循環(huán))、醇脫氫酶、胺脫氫酶共表達(dá)的全細(xì)胞，分別實(shí)現(xiàn)了2種烷烴化合物(環(huán)己烷、乙苯)的C—H鍵胺化，其中環(huán)己胺的濃度14.9 mmol/L，(R)-α-氨基苯乙胺的濃度2.2 mmol/L (e.e.值>99%)。

圖13 多酶催化烷烴C—H鍵胺化的級(jí)聯(lián)反應(yīng)路徑Fig.13 A multi-enzymatic cascade for C-H amination of alkanes

4.3 甲酸銨驅(qū)動(dòng)的三酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)催化酮R-選擇性胺化

R選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶一般需要價(jià)格昂貴的D-丙氨酸作為氨基供體，而且存在反應(yīng)平衡的問題，需要去除體系中產(chǎn)生的副產(chǎn)物以實(shí)現(xiàn)反應(yīng)平衡向胺產(chǎn)物生成的方向移動(dòng)[45-46]。為解決上述問題，筆者所在課題組[47]開發(fā)了ω-轉(zhuǎn)氨酶/胺脫氫酶/甲酸脫氫酶三酶耦聯(lián)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)體系(圖14)。在該體系中，甲酸脫氫酶消耗溶液中的甲酸根產(chǎn)生還原力NADH，胺脫氫酶可以利用溶液中的氨分子和還原力NADH將輔底物酮(如2-戊酮、2-己酮等)胺化為相應(yīng)的胺產(chǎn)物，接著，R-選擇性的ω-轉(zhuǎn)氨酶使用上述產(chǎn)生的胺產(chǎn)物作為氨基供體實(shí)現(xiàn)目標(biāo)酮底物的胺化。利用該反應(yīng)系統(tǒng)，可以實(shí)現(xiàn)一系列酮底物(如4-苯基-2-丁酮、西他列汀前手性酮等)的R型胺化，轉(zhuǎn)化率高達(dá)99%，e.e.值>99%。

因此，上述多酶級(jí)聯(lián)體系可以利用甲酸銨作為氨基供體和還原劑，即可實(shí)現(xiàn)R-選擇性的ω-轉(zhuǎn)氨酶介導(dǎo)的R型胺化過程，且副產(chǎn)物僅為H2O和CO2，是一個(gè)簡易、經(jīng)濟(jì)、綠色的R型生物催化胺化體系。

圖14 甲酸銨驅(qū)動(dòng)的三酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)路徑實(shí)現(xiàn)酮的R型胺化Fig.14 An ammonium formate driven trienzymatic cascade for ω-transaminase mediated R-amination

4.4 胺脫氫酶/轉(zhuǎn)氨酶級(jí)聯(lián)催化外消旋胺拆分

通過對(duì)外消旋體進(jìn)行不對(duì)稱拆分是制備特定對(duì)映體的常用生物催化策略。最近，韓國建國大學(xué)的Yoon等[48]構(gòu)建了胺脫氫酶和S選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶級(jí)聯(lián)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)(圖15)，通過控制胺脫氫酶和S選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶的反應(yīng)方向，可以分別實(shí)現(xiàn)R-型和S-型手性胺對(duì)映體的合成，分析得率高達(dá)100%，e.e.值>99%。利用該級(jí)聯(lián)反應(yīng)體系分別實(shí)現(xiàn)了(R)-2-庚胺和(S)-2-庚胺的制備級(jí)合成，分離得率分別為53%和75%，證明了該體系在手性胺制備合成中的實(shí)用性。此外，該課題組還構(gòu)建了胺脫氫酶和丙氨酸脫氫酶耦聯(lián)的級(jí)聯(lián)路徑[49]，通過胺脫氫酶對(duì)外消旋胺進(jìn)行氧化拆分可以實(shí)現(xiàn)S-型手性胺的制備，在該體系中，丙氨酸脫氫酶對(duì)丙酮酸進(jìn)行還原胺化以實(shí)現(xiàn)NAD+的循環(huán)再生。

圖15 胺脫氫酶/ω-轉(zhuǎn)氨酶級(jí)聯(lián)拆分 外消旋胺合成光學(xué)純手性胺Fig.15 AmDH/ω-transaminase cascade systems catalyzing deracemization of racemic amines to chiral amines

5 結(jié)論與展望

近年來，由于胺脫氫酶可以利用廉價(jià)的氨水作為胺供體催化酮不對(duì)稱還原胺化合成手性胺，對(duì)其研究引起了國內(nèi)外學(xué)者的極大興趣，也取得了顯著的進(jìn)展。但是相對(duì)轉(zhuǎn)氨酶、脂肪酶、胺氧化酶等合成手性胺的酶系，對(duì)于該類酶的研究仍處于初始階段，目前胺脫氫酶的種類還很少，高活性的酶還未見報(bào)道。因此，未來在新酶的開發(fā)、酶的催化性能提升、酶的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系等方面還值得深入研究和探索，此外，該類酶也存在著極大的挑戰(zhàn)，如其底物譜較窄、活性較低，如何突破這些限制，實(shí)現(xiàn)其在工業(yè)上的廣泛應(yīng)用，是值得深入研究的?？傊磥淼难芯恐攸c(diǎn)應(yīng)該是開發(fā)滿足工業(yè)應(yīng)用環(huán)境的胺脫氫酶催化劑，加速其在工業(yè)上的應(yīng)用。