微生物合成丙二酰輔酶A衍生物的代謝工程

王凱峰，丁 穎，紀(jì)曉俊

(南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇南京211800)

FAS—脂肪酸合成酶；MCR—丙二酰輔酶A還原酶；TAL—酪氨酸氨裂解酶；4CL—4-香豆酸酯輔酶 A連接酶;CHS—查爾酮合酶；CHI—查爾酮異構(gòu)酶；PAL—苯丙氨酸氨裂解酶；6-MSAS—6-甲基水楊酸合成酶；PHLD—Ⅲ型聚酮化合物合酶；2-PS—2-吡喃酮合酶圖1 丙二酰輔酶A衍生物的合成途徑Fig.1 Synthetic pathways of malonyl-CoA derivatives

綠色生物制造利用可再生的生物質(zhì)資源為原料，將其綠色轉(zhuǎn)化為具有更高附加值的生物基產(chǎn)品，是一種新型的工業(yè)可持續(xù)發(fā)展的模式，微生物作為其中重要的角色，對(duì)可再生資源的催化轉(zhuǎn)化能力一直是制約綠色生物制造發(fā)展的關(guān)鍵因素[1]。隨著代謝工程技術(shù)的不斷發(fā)展，人工構(gòu)建的微生物細(xì)胞工廠在綠色生物制造中發(fā)揮了重要作用。通過在微生物細(xì)胞中重構(gòu)目標(biāo)化合物的代謝途徑，可以實(shí)現(xiàn)利用可再生的生物質(zhì)原料合成多種高附加值化合物，如燃料、藥物、食品和化學(xué)品等[2-4]。

在眾多的生物制造產(chǎn)品體系中，以微生物胞內(nèi)的丙二酰輔酶A(malonyl-CoA)為前體的衍生物已經(jīng)成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)(圖1)。在微生物中，乙酰輔酶A在乙酰輔酶A羧化酶(ACC)的催化下轉(zhuǎn)化為丙二酰輔酶A，而丙二酰輔酶A作為一種關(guān)鍵的代謝中間體，對(duì)于微生物而言至關(guān)重要，主要表現(xiàn)為能夠維持細(xì)胞膜的完整以及細(xì)胞能量代謝的平衡[5]。丙二酰輔酶A衍生物是以丙二酰輔酶A為前體衍生而來，主要包括脂肪酸類化合物、生物基化學(xué)品和植物源黃酮及聚酮類天然產(chǎn)物等。脂肪酸類化合物除了可用于生產(chǎn)潤(rùn)滑劑、表面活性劑等工業(yè)產(chǎn)品外[6]，還可應(yīng)用于化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)[7]。此外，由于脂肪酸類化合物具有吸濕性低、能量密度高、能與石油基燃料混溶等特點(diǎn)[8]，有望替代傳統(tǒng)化石燃料，解決全球化石燃料枯竭的問題。以3-羥基丙酸為代表的丙二酰輔酶A衍生物可以作為一種應(yīng)用廣泛的生物基化學(xué)品生產(chǎn)多種化工產(chǎn)品，如丙二酸、丙烯酸、1,3-丙二醇和生物可降解聚合物聚3-羥基丙酸(P[3-HP])[9]。另一類丙二酰輔酶A衍生物為植物源天然產(chǎn)物，包括黃酮類和聚酮類化合物。黃酮類化合物具有抗炎、清除有害活性氧、抗細(xì)胞毒性、抗腫瘤活性等功效，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)[10-14]。聚酮類化合物具有抗腫瘤生物學(xué)活性以及抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、抗寄生蟲和免疫抑制等特性，亦有重要的醫(yī)藥價(jià)值[15]。

目前，上述丙二酰輔酶A衍生物主要是通過化學(xué)法和植物提取法生產(chǎn)?；瘜W(xué)法依賴于石油為原料，具有不可持續(xù)性。如3-羥基丙酸由石油來源的3-羥基丙腈通過化學(xué)反應(yīng)生成，不僅原料來源受限，而且催化反應(yīng)過程具有高毒性、高成本等不利因素[16]。而脂肪酸類化合物主要從油料植物中提取獲得，黃酮類和聚酮類化合物也主要依賴各種稀有植物資源。植物提取法不僅目標(biāo)產(chǎn)物含量低，而且提取工藝復(fù)雜、受季節(jié)因素影響較大。為了應(yīng)對(duì)上述兩種常規(guī)生產(chǎn)方法過程中存在的問題，人們?cè)噲D利用代謝工程的手段構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠，以其胞內(nèi)丙二酰輔酶A為前體合成這些丙二酰輔酶A衍生物。在微生物中，乙酰輔酶A在ACC的催化下轉(zhuǎn)化為丙二酰輔酶A，然后在脂肪酸合成酶(FAS)的作用下合成系列脂肪酸[8]。其中，丙二酰輔酶A作為脂肪酸合成的限速底物，對(duì)于維持細(xì)胞膜的完整性和細(xì)胞能量代謝至關(guān)重要[5]。但丙二酰輔酶A的細(xì)胞內(nèi)濃度始終處于較低水平，這就為在微生物中構(gòu)建非天然的丙二酰輔酶A衍生物的代謝途徑帶來了障礙。因此，如何有效提高胞內(nèi)丙二酰輔酶A含量并使其精確導(dǎo)向目標(biāo)代謝產(chǎn)物顯得尤為重要。

目前，為了提高丙二酰輔酶A衍生物的合成而改善胞內(nèi)丙二酰輔酶A積累的代謝工程策略主要包括：強(qiáng)化丙二酰輔酶A的供應(yīng)，降低丙二酰輔酶A的消耗以及基于生物傳感器自動(dòng)調(diào)節(jié)丙二酰輔酶A生成和消耗的精細(xì)調(diào)控。

1 強(qiáng)化丙二酰輔酶A的供應(yīng)

ACC是催化乙酰輔酶A生成丙二酰輔酶A的關(guān)鍵酶，其催化的反應(yīng)是微生物中丙二酰輔酶A衍生物合成的限速步驟。ACC是一種多結(jié)構(gòu)域酶，包含生物素羧化酶(BC)域、羧基轉(zhuǎn)移酶(CT)域和生物素羧基載體蛋白(BCCP)域。真核生物的ACC還包含2個(gè)非催化區(qū)域：中央結(jié)構(gòu)域(CD)和BC-CT相互作用結(jié)構(gòu)域(BT)[17]。目前，強(qiáng)化丙二酰輔酶A供應(yīng)的主要手段是過表達(dá)ACC和突變ACC以增加其酶活(圖2)。

圖2 強(qiáng)化丙二酰輔酶A供應(yīng)和降低丙二酰輔酶A 消耗關(guān)鍵代謝途徑Fig.2 Key metabolic pathway for strengthening the malonyl-CoA supply and reducing the compe- titive malonyl-CoA branch consumption

1.1 過表達(dá)乙酰輔酶A羧化酶

最常見的基因過表達(dá)手段包括利用強(qiáng)啟動(dòng)子表達(dá)目的基因以及增加目的基因的拷貝數(shù)兩種。針對(duì)合成丙二酰輔酶A的限速酶ACC，過表達(dá)能夠推動(dòng)乙酰輔酶A生成丙二酰輔酶A，有利于丙二酰輔酶A衍生物的生產(chǎn)。Davis等[18]在低拷貝質(zhì)粒中利用 T7啟動(dòng)子過表達(dá)大腸桿菌ACC的4個(gè)亞基，使丙二酰輔酶A的含量相比于原始菌提高了100倍，目標(biāo)產(chǎn)物游離脂肪酸也提高了6倍。Wattanachaisaereekul等[19]在釀酒酵母中，用相對(duì)較強(qiáng)的啟動(dòng)子TEF1代替天然ACC的啟動(dòng)子，使聚酮化合物6-甲基水楊酸(6-MSA)的產(chǎn)量增加了60%。

除了上述模式微生物外，解脂耶氏酵母作為一種非常規(guī)的產(chǎn)油酵母，具有獨(dú)特的檸檬酸穿梭途徑，因而胞內(nèi)具有很高的乙酰輔酶A含量。Tai等[20]為了提高解脂耶氏酵母中脂質(zhì)含量，利用強(qiáng)啟動(dòng)子hp4d控制ACC編碼基因，以推動(dòng)脂肪酸合成的第一步，使脂質(zhì)含量提高了2倍。過表達(dá)解脂耶氏酵母自身ACC還有利于生產(chǎn)聚酮化合物——三乙酸內(nèi)酯[21-22]。Markham等[21]在解脂耶氏酵母中首次鑒定解脂耶氏酵母丙酮酸旁路途徑可提高三乙酸內(nèi)酯產(chǎn)量，在TEF啟動(dòng)子中插入16個(gè)UAS1B序列構(gòu)建強(qiáng)啟動(dòng)子UAS1B16-TEF來過表達(dá)丙酮酸脫羧酶(PDC)、乙醛脫氫酶(ALD)、乙酰輔酶A合成酶(ACS)以及ACC，使三乙酸內(nèi)酯產(chǎn)量提高64.7%。

Liu等[22]在解脂耶氏酵母中表達(dá)能夠轉(zhuǎn)化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A合成三乙酸內(nèi)酯的Ⅲ型聚酮化合物合酶(2-PS)，該酶表達(dá)后能夠生成0.5 g/L的三乙酸內(nèi)酯。為了進(jìn)一步強(qiáng)化丙二酰輔酶A供應(yīng)以提高三乙酸內(nèi)酯產(chǎn)量，他們使用TEFin強(qiáng)啟動(dòng)子過表達(dá)自身的ACC，使三乙酸內(nèi)酯產(chǎn)量提高至0.66 g/L。

除了過表達(dá)微生物自身的ACC外，表達(dá)異源的ACC也能提高胞內(nèi)丙二酰輔酶A含量。Zha等[23]在大腸桿菌中利用高拷貝數(shù)質(zhì)粒和T7啟動(dòng)子過表達(dá)谷氨酸棒桿菌來源的ACC的2個(gè)亞基，使胞內(nèi)丙二酰輔酶A濃度增加了3倍，丙二酰輔酶A衍生物間苯三酚濃度也因此提高了2.7倍，有趣的是，他們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)大腸桿菌自身的ACC并不能提高間苯三酚的產(chǎn)量。

1.2 突變乙酰輔酶A羧化酶

盡管在一些微生物胞內(nèi)過表達(dá)ACC有利于各種丙二酰輔酶A衍生物的合成，但研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)天然ACC，其活性增加并不明顯，這是因?yàn)锳CC的轉(zhuǎn)錄和翻譯在胞內(nèi)受到嚴(yán)格調(diào)控[24-25]。例如，釀酒酵母中ACC會(huì)受到轉(zhuǎn)錄激活因子Ino2和Ino4以及負(fù)調(diào)控因子Opi1的調(diào)控[26]，另外還受到蛋白激酶Snf1的負(fù)調(diào)控。Snf1在葡萄糖(<0.5 g/L)的限制條件下會(huì)使ACC磷酸化，從而降低酶活[27]。

Feng等[28]試圖敲除釀酒酵母的Snf1來解除對(duì)ACC的抑制，敲除后發(fā)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物1-十六烷醇的產(chǎn)量沒有提高，但是在Δsnf1菌株中過表達(dá)ACC使1-十六烷醇產(chǎn)量提高了50%。這是因?yàn)镾nf1除了調(diào)節(jié)ACC以外，還是碳代謝、β氧化和應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控因子[29]。敲除Snf1會(huì)引起細(xì)胞代謝失衡而無(wú)法提高丙二酰輔酶A衍生物的產(chǎn)量。

突變ACC的磷酸化位點(diǎn)可以解除Snf1對(duì)其的抑制，從而提高ACC的酶活。Li等[30]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)ACC并不能顯著提高釀酒酵母脂肪酸產(chǎn)量，他們利用靶向性實(shí)驗(yàn)方法(MIDAS)[31]鑒定了蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中ACC的14個(gè)磷酸化位點(diǎn)，并指出通過突變這些磷酸化位點(diǎn)來解除Snf1對(duì)ACC的抑制具備一定的可行性。

Choi等[32]將Rattusnorvegicus(rat)與釀酒酵母的ACC比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，1 157位的Ser(絲氨酸)是新的磷酸化位點(diǎn)。因此，將其突變?yōu)锳la(丙氨酸)后提高了ACC的酶活，并有利于丙二酰輔酶A的衍生物6-甲基水楊酸和脂肪酸的合成。

Shi等[24]在釀酒酵母中通過比對(duì)ACC的磷酸化識(shí)別基序(Hyd-X-Arg-XX-Ser-XXX-Hyd)鑒定了2個(gè)受Snf1調(diào)控的磷酸化位點(diǎn)，分別是659位和1 157位的Ser，同時(shí)將這2個(gè)位點(diǎn)突變?yōu)锳la，使得ACC的酶活增加了3倍，并提高了2種丙二酰輔酶A衍生物脂肪酸乙酯和3-羥基丙酸的產(chǎn)量。

Chen等[33]利用MIDAS進(jìn)一步推測(cè)出ACC可能存在15個(gè)磷酸化位點(diǎn)，進(jìn)一步構(gòu)建了利用熒光強(qiáng)度響應(yīng)丙二酰輔酶A濃度的丙二酰輔酶A傳感器，以檢測(cè)每個(gè)磷酸化位點(diǎn)突變?yōu)锳la后對(duì)丙二酰輔酶A濃度的影響，最終預(yù)測(cè)到新的磷酸化位點(diǎn)686位的Ser。同時(shí)將上述3個(gè)磷酸化位點(diǎn)突變?yōu)锳la后，發(fā)現(xiàn)丙二酰輔酶A含量顯著提升，并且丙二酰輔酶A衍生物3-羥基丙酸的產(chǎn)量比兩位點(diǎn)突變提高更為明顯。由于Snf1對(duì)ACC磷酸化調(diào)控的復(fù)雜性，可以預(yù)見，未來更多新的磷酸化位點(diǎn)將被發(fā)現(xiàn)，同時(shí)對(duì)其調(diào)控機(jī)制的進(jìn)一步挖掘?qū)⒂欣诟玫馗脑霢CC。

2 降低丙二酰輔酶A的消耗

丙二酰輔酶A在微生物胞內(nèi)的直接去路是在脂肪酸合成酶的催化下生成系列脂肪酸。異源引入的丙二酰輔酶A衍生物合成途徑會(huì)與脂肪酸合成途徑競(jìng)爭(zhēng)消耗丙二酰輔酶A。因此，降低脂肪酸合成將有利于生產(chǎn)非脂肪酸類的丙二酰輔酶A衍生物。目前，銅綠素、三氯生和淺藍(lán)菌素等化學(xué)物質(zhì)已經(jīng)被證明能夠有效抑制微生物體內(nèi)的脂肪酸合成[18,34]，但這些化合物成本高、細(xì)胞毒性強(qiáng)等因素限制了其在工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用[18]。

為了通過基因工程手段在大腸桿菌中抑制脂肪酸合成，Carbonell等[35]敲除了脂肪酸合成酶的關(guān)鍵基因fabf(編碼3-氧?；?(?；d體蛋白)合酶Ⅱ)。在引入苯丙氨酸氨裂解酶(PAL)、查爾酮合酶(CHS)、查爾酮異構(gòu)酶(CHI)和4-香豆酸酯輔酶A連接酶(4CL)的基礎(chǔ)上，菌株能夠利用L-苯丙氨酸和丙二酰輔酶A合成88 mg/L的黃酮類化合物生松素。

在微生物中，天然的脂肪酸屬于直鏈脂肪酸。在生產(chǎn)支鏈脂肪酸時(shí)，天然的脂肪酸競(jìng)爭(zhēng)消耗了丙二酰輔酶A。2種脂肪酸的合成都需要fabh(編碼β-酮酰基-ACP合酶Ⅲ)，它負(fù)責(zé)催化丙二?；?ACP和短鏈酰基輔酶A之間的初始縮合反應(yīng)，Jiang等[36]通過敲除大腸桿菌自身的fabh，導(dǎo)入來自金黃色葡萄球菌中對(duì)支鏈?；o酶A有特異性的safabh，使更多的丙二酰輔酶A流向支鏈脂肪酸的合成，最終支鏈脂肪酸產(chǎn)量提高了81倍。

然而，完全敲除脂肪酸合成基因?qū)τ谖⑸锛?xì)胞生長(zhǎng)來說是致命的，而抑制脂肪酸合成基因既可以降低丙二酰輔酶A的消耗，又能緩解對(duì)細(xì)胞帶來的損傷。所以通過抑制脂肪酸合成基因能夠平衡丙二酰輔酶A衍生物合成和細(xì)胞生長(zhǎng)，更有利于積累丙二酰輔酶A衍生物(圖2)。

轉(zhuǎn)錄激活因子Ino2負(fù)責(zé)激活參與磷脂生物合成相關(guān)基因(acc、fas1和fas2)的轉(zhuǎn)錄。Chen等[37]敲除釀酒酵母ino2以降低丙二酰輔酶A的消耗，從而使3-羥基丙酸產(chǎn)量提高18倍。然而敲除ino2會(huì)使脂肪酸過度減少進(jìn)而影響磷脂合成，使細(xì)胞生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制。為了緩解細(xì)胞生長(zhǎng)，針對(duì)ino2基因的激活域和DNA結(jié)合域進(jìn)行了改造，試圖篩選較低活性的Ino2，使其對(duì)脂肪酸合成途徑的轉(zhuǎn)錄激活效果降低，適當(dāng)?shù)販p少對(duì)丙二酰輔酶A流向脂肪酸的合成，平衡分配丙二酰輔酶A用于細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成。

此外，人工構(gòu)建的基因抑制工具也被用于抑制脂肪酸合成途徑。反義RNA可通過與靶mRNA互補(bǔ)結(jié)合來破壞mRNA的翻譯并加快其降解，因此被廣泛用作基因抑制工具。在大腸桿菌中利用反義RNA抑制脂肪酸合成基因fabd(編碼丙二酰輔酶A:ACP轉(zhuǎn)酰酶)能使丙二酰輔酶A 的含量提高4.5倍。同樣地抑制其他脂肪酸合成基因fabh、fabf(編碼β-酮?；?ACP合酶Ⅱ)、fabb(編碼β-酮酰基-ACP合酶Ⅰ)，均能提高丙二酰輔酶A衍生物4-羥基香豆素的產(chǎn)量[38]。同樣，Wu等[39]在大腸桿菌中利用反義RNA抑制fabb和fabf，使得丙二酰輔酶A濃度增加了8.8倍，(2S)-柚皮素最終質(zhì)量濃度提高了431%，達(dá)到了391 mg/L。

除了反義RNA外，另一種是基于分子伴侶Hfq和支架MicC的基因抑制工具Hfq-MicC。MicC支架包含可以與特定mRNA結(jié)合的反義RNA以及與Hfq結(jié)合的部分。Hfq作用是促進(jìn)反義RNA和靶mRNA結(jié)合、促進(jìn)RNA酶水解mRNA以及保護(hù)反義RNA不被水解。

Sun等[40]在藍(lán)細(xì)菌中利用Hfq-MicC抑制fabh、fabf和fabd3個(gè)脂肪酸合成基因，使胞內(nèi)丙二酰輔酶A含量提高了41%。呂永坤[41]選擇解脂耶氏酵母，基于CRISPRi技術(shù)，利用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制sgRNA的表達(dá)來靶向脂肪酸合成基因fas1和fas2，最終有效抑制了脂肪酸合成，從而提高了黃酮類化合物黃衫素的產(chǎn)量。

3 細(xì)胞內(nèi)丙二酰輔酶A含量的精細(xì)調(diào)控

微生物胞內(nèi)過量的丙二酰輔酶A雖然有利于其衍生物的合成，但也會(huì)損害其細(xì)胞生長(zhǎng)[19]，因此，需要開發(fā)一種精細(xì)控制胞內(nèi)丙二酰輔酶A含量的方法。2種丙二酰輔酶A 生物傳感器先后被開發(fā)用于監(jiān)測(cè)胞內(nèi)丙二酰輔酶A含量，并使其在一定范圍內(nèi)可調(diào)被用來精細(xì)調(diào)控丙二酰輔酶A。

最常見的丙二酰輔酶A 生物傳感器是基于天然脂肪酸生物合成轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控而設(shè)計(jì)，這種轉(zhuǎn)錄調(diào)控存在于很多革蘭氏陽(yáng)性菌中，如枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等[42-43]。該傳感器由脂肪酸合成的操縱子上的順式調(diào)控元件fapO和FapR轉(zhuǎn)錄阻遏物模塊組成。FapR會(huì)以蛋白質(zhì)-DNA作用與啟動(dòng)子fapO區(qū)域結(jié)合，從而形成FapR-fapO復(fù)合物，該復(fù)合物在空間上阻礙RNA聚合酶從而阻止下游脂肪酸合成基因的轉(zhuǎn)錄。而丙二酰輔酶A會(huì)以代謝物-蛋白質(zhì)作用與FapR結(jié)合以削弱FapR-fapO的作用，減少對(duì)RNA聚合酶的阻遏[34,44-45]。

Liu等[46]利用這一原理設(shè)計(jì)了一個(gè)利用負(fù)反饋調(diào)節(jié)丙二酰輔酶A相關(guān)途徑基因表達(dá)的傳感器。高水平的丙二酰輔酶A會(huì)解除FapR-fapO抑制促進(jìn)lacI表達(dá)，從而關(guān)閉ACC的表達(dá)；相反，低水平的丙二酰輔酶A會(huì)使 ACC持續(xù)表達(dá)以補(bǔ)充丙二酰輔酶A，以此實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)自動(dòng)監(jiān)管丙二酰輔酶A的合成(圖3(a))。最終脂肪酸濃度和生產(chǎn)速率分別提高了34%和33%。

與T7啟動(dòng)子不同，GAP啟動(dòng)子會(huì)被FapR激活。根據(jù)此原理，Xu等[45]設(shè)計(jì)了丙二酰輔酶A雙響應(yīng)啟動(dòng)子傳感器，它利用GAP和T7啟動(dòng)子動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)胞內(nèi)丙二酰輔酶A的合成和消耗。當(dāng)體內(nèi)丙二酰輔酶A含量低時(shí)，F(xiàn)apR激活GAP啟動(dòng)子并且與fapO結(jié)合，抑制T7啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，即激活A(yù)CC啟動(dòng)丙二酰輔酶A 的合成，同時(shí)抑制FAS阻止丙二酰輔酶A合成脂肪酸，使丙二酰輔酶A逐步積累。相反，高水平的丙二酰輔酶A會(huì)與FapR結(jié)合抑制上述調(diào)節(jié)，即關(guān)閉丙二酰輔酶A的合成，同時(shí)開啟丙二酰輔酶A合成脂肪酸(圖3(b))。最終，丙二酰輔酶A的濃度會(huì)呈現(xiàn)出振蕩狀態(tài)，即積累至上限濃度時(shí)會(huì)被及時(shí)消耗，消耗到下限濃度時(shí)又會(huì)重新啟動(dòng)積累，避免了丙二酰輔酶A的過度累積而影響細(xì)胞的代謝平衡。最終改造后的大腸桿菌脂肪酸產(chǎn)量提高了15.7倍。

在釀酒酵母中，David等[47]在啟動(dòng)子TEF1堿基序列中插入FapR結(jié)合位點(diǎn)，將其改造為能夠響應(yīng)丙二酰輔酶A濃度的啟動(dòng)子并啟動(dòng)來自Chloroflexusaurantiacus中合成3-羥基丙酸的關(guān)鍵基因mcrCa(編碼丙二酰-CoA還原酶)，同時(shí)利用葡萄糖響應(yīng)型啟動(dòng)子HXT1啟動(dòng)脂肪酸合成酶FAS1，雙節(jié)點(diǎn)控制丙二酰輔酶A流向3-羥基丙酸和脂肪酸的合成，最終實(shí)現(xiàn)了工程菌株生產(chǎn)與生長(zhǎng)平衡，3-羥基丙酸產(chǎn)量提高了10倍，達(dá)到1.0 g/L。

此外，丙二酰輔酶A生物傳感器還被設(shè)計(jì)成能夠通過結(jié)合熒光報(bào)告基因來檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的丙二酰輔酶A濃度，進(jìn)而可作為一個(gè)篩選高丙二酰輔酶A生產(chǎn)菌的工具。Li等[48]將該生物傳感器和攜帶全基因組過表達(dá)盒的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化釀酒酵母構(gòu)建全基因組的過表達(dá)文庫(kù)。通過三輪熒光激活的細(xì)胞分選，鑒定出具有最高熒光強(qiáng)度的轉(zhuǎn)化菌落，并鑒定出2個(gè)影響丙二酰輔酶A含量的靶標(biāo)——pmp1(編碼質(zhì)膜蛋白脂)和tpi1(編碼磷酸三糖異構(gòu)酶)。最終，過表達(dá)靶基因tpi1后，3-羥基丙酸的產(chǎn)量提高了20%。Ferreira等[49]在釀酒酵母中將基于CRISPR/dCas9的gRNA文庫(kù)與丙二酰輔酶A傳感器結(jié)合起來，經(jīng)過多輪熒光激活的細(xì)胞分選和文庫(kù)測(cè)序后，最終篩選出能顯著提高丙二酰輔酶A產(chǎn)量的gRNA，這將指導(dǎo)代謝工程改造釀酒酵母以提高3-羥基丙酸產(chǎn)量。

最近，Yang等[50]開發(fā)了另一種不同的丙二酰輔酶A傳感器，利用一種Ⅲ型聚酮化合物合酶RPPA，催化丙二酰輔酶A生成紅色產(chǎn)物丙二醛輔酶A，紅色物質(zhì)可以間接反映出丙二酰輔酶A濃度。利用該丙二酰輔酶A傳感器和全基因組sRNA抑制文庫(kù)篩選出了高丙二酰輔酶A的大腸桿菌用于生產(chǎn)6-甲基水楊酸、柚皮素等丙二酰輔酶A衍生物[51]。

圖3 基于生物傳感器精細(xì)調(diào)控微生物胞內(nèi) 丙二酰輔酶A含量[52]Fig.3 Fine-turning the intracellular malonyl-CoA content based on the biosensor[52]

除了以上綜述的針對(duì)丙二酰輔酶A及不同的衍生物的改造策略以提高其產(chǎn)量外，還有利用乙酰輔酶A的研究，因它為是除丙二酰輔酶A之外另一重要的前體。過表達(dá)過氧化物酶體基質(zhì)蛋白PEX10增強(qiáng)β氧化[21,52]、表達(dá)丙酮酸脫氫酶(PDH)催化丙酮酸氧化脫羧為乙酰輔酶A[22]能夠強(qiáng)化乙酰輔酶A的供應(yīng)，均有利于生產(chǎn)三乙酸內(nèi)酯。本文總結(jié)了現(xiàn)有提高丙二酰輔酶A衍生物合成的代謝工程策略(表1)。

4 結(jié)論與展望

利用微生物合成丙二酰輔酶A衍生物包括脂肪酸類化合物、生物基化學(xué)品、黃酮及聚酮類化合物等有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，不僅原料再生，而且過程綠色。為了進(jìn)一步提高微生物合成這些丙二酰輔酶A衍生物的產(chǎn)量，除了文中所述精準(zhǔn)控制丙二酰輔酶A含量的代謝工程操作外，還要根據(jù)不同的衍生產(chǎn)物對(duì)后續(xù)的人工代謝途徑進(jìn)行合理設(shè)計(jì)及改造。然而，目前人們對(duì)微生物胞內(nèi)丙二酰輔酶A含量精準(zhǔn)控制的代謝工程操作策略主要是通過抑制或激活特定酶和代謝途徑，這勢(shì)必會(huì)導(dǎo)致代謝網(wǎng)絡(luò)不平衡。因此，為了平衡細(xì)胞自身代謝與產(chǎn)物合成，可以通過建立細(xì)胞對(duì)產(chǎn)物的自動(dòng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)來維持代謝系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，基于丙二酰輔酶A傳感器控制的動(dòng)態(tài)調(diào)控策略可以很好地平衡丙二酰輔酶A的相關(guān)代謝。另外，利用丙二酰輔酶A傳感器檢測(cè)丙二酰輔酶A的濃度，結(jié)合適應(yīng)性進(jìn)化、CRISPR/dCas9技術(shù)和基因轉(zhuǎn)座技術(shù)等可在全基因組規(guī)模篩選胞內(nèi)影響丙二酰輔酶A含量的基因靶標(biāo)，以構(gòu)建合成丙二酰輔酶A衍生物的優(yōu)良宿主?？梢韵嘈?，隨著代謝工程操作方法發(fā)展，結(jié)合高通量的篩選方法鑒定的新靶標(biāo)基因可以促進(jìn)丙二酰輔酶A精準(zhǔn)導(dǎo)向目標(biāo)產(chǎn)物，這將有助于推動(dòng)廣泛應(yīng)用于能源、化工和醫(yī)藥等領(lǐng)域的丙二酰輔酶A衍生物的高效微生物合成，加快綠色生物制造的快速發(fā)展。

表1 微生物合成丙二酰輔酶A衍生物的代謝工程策略