脂肪酶的生物學改造研究進展

葉 純，王玉娟

(1. 中國科學院 強磁場科學中心，合肥 230031； 2. 中國科學技術(shù)大學，合肥 230026)

脂肪酶作為工業(yè)生產(chǎn)中重要的生物催化劑[1]，具有催化特異性高、反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少及環(huán)境友好等特點，但是脂肪酶制劑價格昂貴、酶與底物難分離、多余游離脂肪酶難回收等問題制約了其工業(yè)應(yīng)用。因此，對天然脂肪酶進行針對性改造是當前本領(lǐng)域研究熱點。本文將在簡介脂肪酶的分子結(jié)構(gòu)、催化機理等基本信息的基礎(chǔ)上，綜述利用定向進化等生物技術(shù)對其進行改造的研究現(xiàn)狀，展望脂肪酶生物學改造的發(fā)展趨勢，助益同行學者開展相關(guān)研究。

1 脂肪酶的概述

脂肪酶(Lipase，E.C. 3.1.1.3)又稱?；视退饷?，廣泛來源于多種動植物及微生物。它能夠催化水解、酯化、醇解等生化反應(yīng)[2]。脂肪酶在催化反應(yīng)中具位點選擇性、立體選擇性及化學選擇性的特點，催化過程不需要輔因子，且具有高催化活性[3]。

1.1 脂肪酶結(jié)構(gòu)

1990年，Brad等解析了米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucormieheilipase，RML)的晶體結(jié)構(gòu)[4]，到目前為止，已經(jīng)有數(shù)百種脂肪酶的結(jié)構(gòu)被解析出來。脂肪酶結(jié)合底物不同，或者所處溶劑環(huán)境不同，都可能呈現(xiàn)出不同的構(gòu)象狀態(tài)。不同物種的脂肪酶一級結(jié)構(gòu)(氨基酸序列)相似度很低，且蛋白分子量也相差甚遠，從16.25 ku(Rhizomucororyzaede的脂肪酶)[5]到116.6 ku(人體的激素敏感脂肪酶)[6]，但它們的活性中心在二級和三級結(jié)構(gòu)上相對保守，都具有相似的α/β水解酶折疊結(jié)構(gòu)，是一個催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)(由絲氨酸、組氨酸、天冬氨酸組成)[2]。

1.2 脂肪酶的催化機理

脂肪酶的催化過程主要分為4個階段，如圖1所示：1)疏水性底物進入反應(yīng)體系時，脂肪酶由α螺旋組成的蓋子打開并暴露反應(yīng)活性位點，底物進入活性中心，與脂肪酶結(jié)合。2)脂肪酶活性中心上的絲氨酸被活化，羥基氧原子對底物酯鍵上的羰基進行親核攻擊，羰基雙鍵斷裂，4種不同原子與該羰基碳原子鍵合，形成四面體中間復合物。3)四面體中間復合物發(fā)生扭轉(zhuǎn)，活性中心的組氨酸將其從絲氨酸上獲得的質(zhì)子傳遞給底物酯鍵上的羥基，底物酯鍵斷裂，生成的醇羥基部分脫離中間復合體，羰基部分與活性中心的絲氨酸形成新的酯鍵，酶與底物形成了一種?；?酶共價中間復合體形式。4)脫?；?。活性中心的組氨酸失去質(zhì)子以后，從底物分子水或醇中獲取質(zhì)子，底物分子水和醇被活化，攻擊絲氨酸上的碳原子，絲氨酸與底物結(jié)合的酯鍵斷裂，釋放其羧基部分的產(chǎn)物(水解釋放酸，醇解釋放酯)，同時脂肪酶完成了去?；^程[2,7]。

圖1 脂肪酶催化機理[2]

2 脂肪酶的生物學改造

由于酶催化的底物分子專一性強，且受pH、溫度等反應(yīng)條件的限制，限制了其工業(yè)應(yīng)用。因此，利用生物學技術(shù)改善酶的工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用性能，成為近年來的研究熱點。目前，計算機模擬、序列分析、基因突變與合成以及蛋白質(zhì)工程等技術(shù)交叉融合，發(fā)展出定向進化、理性設(shè)計、從頭設(shè)計和蛋白質(zhì)表面修飾及固定化技術(shù)，使酶改造進入了主動時代，對脂肪酶催化特性的改造更具有針對性[7]。

2.1 定向進化

定向進化是在體外的實驗環(huán)境中來模擬生物體自然進化的實驗手段，通過隨機突變氨基酸，構(gòu)建突變重組文庫，再進行定向篩選，以得到預期的目的蛋白，定向進化在不了解酶蛋白的結(jié)構(gòu)及催化機制的條件下，也可以有目的地獲得具有特定催化性能的突變體酶蛋白[8]。在定向進化中，構(gòu)建突變重組文庫的手段主要包括易錯PCR[9]、DNA改組[10]、寡聚核苷酸重組(Assembly of designed oligonucleotides，ADO)[11]等，例如黃瑛[12]利用該技術(shù)對來源于短小芽孢桿菌的脂肪酶基因BpL進行定向進化，獲得了BpL1-7和BpL2-1369兩種突變菌株，其催化活力較野生型分別提高了2倍和6倍。蘇宏飛等[13]利用DNA改組技術(shù)對脂肪酶Lip98進行定向改造，獲得兩個突變體F92A和I199F，其熱穩(wěn)定性與野生型相比分別提高了1.5和3.5倍。常用的高通量篩選方法主要有瓊脂平板篩選、特異性酶產(chǎn)物篩選、表面展示技術(shù)等，例如Emmanuel等[14]利用脂肪酶催化水解反應(yīng)，生成一種穩(wěn)定性的熒光基團傘形酮的特性，觀察產(chǎn)物熒光強度的變化來反映脂肪酶酶活，從而篩選出高酶活脂肪酶。定向進化方法高度依賴于完善的突變重組文庫以及高效的高通量的定向篩選方法，存在著無效突變多、篩選困難及工作量大等問題。

2.2 理性設(shè)計

酶的理性設(shè)計是根據(jù)脂肪酶的已知結(jié)構(gòu)信息及催化機理，對脂肪酶的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系進行分析，找出影響酶的穩(wěn)定性、催化活性、折疊方式等的主要位點，然后對其進行針對性的修飾或替換，以改變脂肪酶的相應(yīng)性狀[15]。傳統(tǒng)的理性設(shè)計方法主要基于實驗以及序列分析，近年來，計算機輔助設(shè)計被廣泛應(yīng)用于脂肪酶的理性設(shè)計中。通過序列比對分析氨基酸序列的保守性，利用同源建模方法對未知蛋白進行模型構(gòu)建，得到蛋白結(jié)構(gòu)的理論模型[27]。同時根據(jù)蛋白質(zhì)與配體之間的柔性對接以及剛性對接，發(fā)展出分子對接的計算分析方法，分析蛋白質(zhì)與配體的結(jié)合自由能變化，以評價蛋白質(zhì)的配體選擇性。通過分子動力學模擬對蛋白質(zhì)與配體結(jié)合體進行分析和預測，分析環(huán)境體系等因素對其結(jié)構(gòu)及相互作用的影響，得到新型酶蛋白的相關(guān)催化活性、穩(wěn)定性以及底物選擇性等理論數(shù)據(jù)，從而選擇最合適的突變體并指導實驗，得到目標酶蛋白[17]。

2.3 半理性設(shè)計

由于隨機突變的定向進化技術(shù)構(gòu)建出的突變體文庫數(shù)量巨大，篩選困難，而理性設(shè)計需要對脂肪酶結(jié)構(gòu)、催化機理以及功能有深入的了解，限制了脂肪酶的改造?；谏鲜鰞煞N改造方法建立的半理性設(shè)計,即先用理性設(shè)計的思路，利用生物信息學手段對目標脂肪酶已有信息進行分析，將定向進化的突變位點鎖定在有限幾個氨基酸上，大大縮小了突變體文庫的數(shù)量，且有效突變率大大增高[18]。例如，Reetz課題組基于脂肪酶有義突變主要集中在催化活性位點附近這一機理，提出了迭代飽和突變法(Iterative saturation mutagenesis，ISM)[19]，先分析酶的結(jié)構(gòu)、序列信息，選取活性中心關(guān)鍵位點，分別對這些位點進行飽和突變，從中篩選有義突變，對這些突變體再進行飽和突變，通過這樣的多輪迭代飽和突變，找到最適突變體。

2.4 蛋白修飾

為了彌補氨基酸定點突變只能選擇19種氨基酸對其進行替換的不足，蛋白質(zhì)修飾方法被應(yīng)用于酶蛋白改造中，使酶蛋白在目標位點上的改造更多樣。脂肪酶蛋白的表面修飾主要通過對主鏈的剪切、連接以及對側(cè)鏈氨基酸殘基或者某個官能團進行化學修飾來實現(xiàn)。通過對酶蛋白進行表面修飾，可以增強其在不利催化環(huán)境中的穩(wěn)定性及催化活力。如Abuchowski等的研究表明，聚乙二醇(PEG)可以通過改變脂肪酸的主鏈結(jié)構(gòu)或側(cè)鏈基團對其修飾，使脂肪酶在有機溶劑中更穩(wěn)定，溶解性更強[20]。

2.5 固定化

在自然條件下，游離酶極易失活且回收困難，所以脂肪酶通常需要進行固定化操作才能應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中，固定化的酶具有更高的環(huán)境耐受性及穩(wěn)定性[21]，利于回收再利用。目前工業(yè)生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用的脂肪酶固定方法主要有4種：交聯(lián)法、包埋法、吸附法以及共價法[22]。新型固定化技術(shù)，如納米載體固定化利用納米載體，包括納米片、納米纖維、納米管等，對脂肪酶進行固定化(表1)[22]。定向固定化技術(shù)通過使酶蛋白活性位點遠離固定化載體，使底物更容易與脂肪酶結(jié)合，提高了催化效率[7]。例如Godoy等[23]突變了來源于Geobacillusthermocatenulatus的脂肪酶BTL2，突變體φ-BTL2-S334C通過引入的半胱氨酸與固定載體上的醛基反應(yīng)，將酶固定在二硫化物-醛支持物上(圖2)，使其在水解中具有幾乎完全的選擇性。

3 幾種改造技術(shù)比較

通過對目前脂肪酶主要改造策略進行分析，總結(jié)了幾種策略的主要技術(shù)特點。如表1所示，每種技術(shù)都有自己一定的局限性，多種技術(shù)相結(jié)合對脂肪酶進行改造成為未來研究的重要方向。

圖2 φ-BTL2-S334C定向固定化流程[23]

表1 幾種重要脂肪酶改造技術(shù)的比較

4 總結(jié)與展望

隨著大量的研究，人們對脂肪酶的結(jié)構(gòu)、功能和催化機理的了解越來越深入，為脂肪酶改造提供了理論支持。計算機硬件及相關(guān)軟件越來越完善，為脂肪酶的改造提供了方向上的指導，提高了改造效率。本文總結(jié)了現(xiàn)有用于脂肪酶改造的生物技術(shù)，包括定向進化、理性設(shè)計、蛋白修飾、固定化等，并系統(tǒng)地分析了相關(guān)技術(shù)的優(yōu)劣勢。展望未來，現(xiàn)有多種技術(shù)相結(jié)合，優(yōu)勢互補以及各種新型改造技術(shù)的開發(fā)和運用將會極大地促進脂肪酶改造研究的發(fā)展。