N-氨甲酰谷氨酸對豬胎盤滋養(yǎng)層細胞增殖及基因表達的影響

韋尚麗，馬文清，白佳樺，許曉玲，田見暉，劉 彥，馮 濤

(1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術學院，蘭州 730070； 2. 北京市農(nóng)林科學院畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100097；3. 甘肅省平?jīng)鰴C電工程學校，靜寧 743400； 4. 中國農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術學院，北京 100193)

在生豬養(yǎng)殖過程中產(chǎn)(活)仔數(shù)和仔豬初生重是影響母豬繁殖生產(chǎn)效率的主要因素。初生重變異大導致宮內(nèi)發(fā)育遲緩(Intrauterine growth retardation，IUGR)仔豬(體重低于1.1 kg)的比例升高，目前IUGR仔豬占到總產(chǎn)仔數(shù)的25%左右，約76%的IUGR仔豬在斷奶前死亡[1]，存活下來的IUGR仔豬也普遍存在次級肌纖維發(fā)育畸形和延遲成熟的情況[2]。研究發(fā)現(xiàn)在妊娠后期日糧中添加營養(yǎng)因子可以改善IUGR現(xiàn)象，調(diào)控仔豬初生重及其變異，這些營養(yǎng)因子主要有氨基酸或蛋白質(zhì)、能量(來源)和功能性添加劑等[3-5]。N-氨甲酰谷氨酸(N-carbamylglutamate，NCG)是一種新型飼料添加劑，在妊娠日糧中添加可以提高多胎動物(豬和鼠)窩產(chǎn)仔數(shù)和初生重[6]，近期有研究表明，妊娠后期日糧中添加一定劑量的NCG可提高仔豬初生個體均重、胎盤均重并降低窩內(nèi)體重變異[5]，但前期研究僅觀察到現(xiàn)象，NCG調(diào)控仔豬重量、胎盤發(fā)育的機理尚不清楚。

胚胎滋養(yǎng)層是發(fā)揮胎盤屏障等胎盤功能的主要部位，胚胎滋養(yǎng)層細胞是研究胎盤功能的主要模型之一。胎盤是由胚胎配模和母體子宮內(nèi)膜聯(lián)合長成組織結(jié)合器官，在胎兒發(fā)育過程中發(fā)揮物質(zhì)轉(zhuǎn)運、免疫屏障、內(nèi)分泌等重要生理作用，這些功能與胎盤滋養(yǎng)層細胞的特性密切相關[7-8]。對于哺乳動物繁殖過程中營養(yǎng)因子調(diào)控胎兒生長發(fā)育的相關研究而言，由于胎盤生理功能的特殊性以及對胎兒正常發(fā)育的關鍵影響作用，體內(nèi)實時探索胎盤生理變化的難度較大；胎盤滋養(yǎng)層細胞是構成胎盤絨毛結(jié)構的主要組成部分，是母體和胎兒進行營養(yǎng)物質(zhì)交換的主要組織部位，因此闡述滋養(yǎng)層細胞的生理影響機制對反映胎盤正常功能具有重要意義[9-10]。本研究利用豬胎盤滋養(yǎng)層細胞系(Placenta trophoblast cells，pTr)為模型，體外研究NCG對豬pTr細胞增殖及其胎盤功能相關基因表達的影響，以期初步解釋NCG促進胎盤發(fā)育的機理。

1 材料和方法

1.1 豬pTr細胞培養(yǎng)

本試驗所用豬pTr為中國農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院惠贈。將豬pTr從液氮取出后，37 ℃水浴快速解凍后放在超凈臺中用PBS重懸洗滌2次，1000 r/min離心5 min棄上清，加入DMEM/F12完全培養(yǎng)液(含有10%胎牛血清FBS、1%的ITS和1%青鏈霉素雙抗)，重懸后接種于25 cm2的細胞培養(yǎng)瓶(Corning公司)，置于細胞培養(yǎng)箱(37 ℃、飽和濕度、5% CO2)無菌培養(yǎng)，每隔24 h更換新的完全培養(yǎng)液。顯微鏡觀察pTr細胞融合度超過70%后，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌2次后用胰酶(Try-EDTA，0.25%)37 ℃消化約2 min，顯微鏡觀察待細胞開始從培養(yǎng)瓶壁上掉落漂浮在消化液中時，使用含有血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)液終止消化，1000 r/min離心5 min，棄上清用完全培養(yǎng)液重懸后接入新的75 cm2培養(yǎng)瓶傳代。pTr傳代3次以上且細胞形態(tài)正常、狀態(tài)穩(wěn)定，傳代時經(jīng)細胞計數(shù)測定數(shù)量滿足實驗要求便可開展下一步研究，本試驗所用pTr在3～12代之間[11-12]。

1.2 NCG處理豬pTr

傳代時得到的pTr細胞懸液用細胞計數(shù)儀測定密度(方法詳見1.3)，根據(jù)細胞密度用DMEM/F12完全培養(yǎng)液稀釋至0.5×106個/mL的濃度均勻接種至12孔板中，每孔2 mL，按照1.1中的條件培養(yǎng)。待細胞融合至70%以上時，無菌操作輕輕吸去培養(yǎng)液，PBS洗滌(1 mL/孔)2遍以去除血清對處理的干擾，吸盡PBS后每孔接入2 mL不同濃度的NCG溶液(用無血清DMEM/F12配制終濃度為0、1、10和25 mmol/L)，重新置于二氧化碳培養(yǎng)箱并計時。本研究中每個處理至少3個重復。

1.3 豬pTr細胞計數(shù)及收集

豬pTr培養(yǎng)48 h后從培養(yǎng)箱中取出，吸取細胞培養(yǎng)液并收集細胞。使用胰蛋白酶消化法收集細胞沉淀(方法詳見1.1)，用200 μL的DMEM/F12完全培養(yǎng)液終止消化后，將吹打混勻的細胞懸液全部轉(zhuǎn)移至RNase-free的離心管，充分重懸后吸取1 μL至99 μL無血清培養(yǎng)基中，再次重懸后吸取10 μL用細胞計數(shù)儀(Bio-Rad公司)進行計數(shù)。剩余的細胞懸液300 r/min離心4 min后棄上清并加入細胞裂解液，震蕩混勻后立即提取RNA或存儲于-80 ℃冰箱。

1.4 細胞總RNA提取

1.3中細胞裂解液總RNA的提取使用離心柱型“RNAprep Pure培養(yǎng)細胞/細菌總RNA提取試劑盒”(天根公司)，按照使用說明在室溫下操作，RNA的收集和濃度測定參考陳志龍等[11]的方法進行。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄cDNA

采取“TIANGEN Quantscript RT Kit Quant cDNA第一鏈合成試劑盒” (天根公司)進行反轉(zhuǎn)錄，根據(jù)RNA濃度計算反轉(zhuǎn)錄體系中各組份的添加量。反轉(zhuǎn)錄步驟參考陳志龍等[11]進行。反轉(zhuǎn)錄體系如下：10×RT Mix、Super pure dNTPs、Oligo-(dT)15各2.0 μL，RNA模板根據(jù)濃度計算體積，用水補齊總體積20.0 μL。

1.6 Real-time PCR

采用FastFire qPCR PreMix(SYBR Green)快速熒光定量PCR預混試劑盒(天根公司)，參照說明書進行基因熒光定量表達檢測，以GAPDH為內(nèi)參基因，引物序列參考已發(fā)表文獻(表1)。

PCR反應采用20.0 μL體系，包括上下游Primer各0.5 μL、2×FastFire qPCR PreMix 10.0 μL、cDNA 1.0 μL、ddH2O 8.0 μL。95 ℃預變性1 min； 95 ℃變性 5 s，62 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s, 40個循環(huán)。使用熒光定量軟件Bio-Rad CFX Manager 3.1讀取熒光信號記錄Ct值。

表1 本研究所用Real-time PCR引物序列

GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; CDK4: cyclin-dependent kinase 4; CCND1: Cyclin D; SLC2A1: Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 1; CAT: catalase

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

基因表達根據(jù)熒光定量軟件自動讀取的Ct值(熒光信號到達閾值的循環(huán)數(shù))，采用2-△△Ct法計算對照組和試驗組檢測基因的相對表達水平[13]。

本試驗所有結(jié)果采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析，差異顯著時使用Tukey法進行多重比較，所有數(shù)值以平均值±標準誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 NCG對豬pTr細胞增殖的影響

培養(yǎng)基中添加1～25 mmol/L的NCG培養(yǎng)豬pTr 48 h，細胞增殖情況如圖1所示，NCG對豬pTr細胞增殖存在劑量依賴性促進關系(P<0.05)，基因表達試驗選擇10 mmol/L的濃度進行。

“*”表示與其他組存在顯著差異(P<0.05)

圖1不同濃度NCG對豬胎盤滋養(yǎng)層細胞增殖的影響

Figure 1 Effect of different concentrations of NCG on pTr cell proliferation

2.2 NCG對豬pTr相關基因表達的影響

NCG處理豬pTr 48 h相關基因表達情況如圖2所示：體外用10 mmol/L的NCG處理可上調(diào)豬pTrCDK4、CCND1、SLC2A1和CAT基因表達(P<0.05)。

A:CDK4; B:CCND1; C:SLC2A1; D:CAT; “*”表示與對照組比存在顯著差異(P<0.05)

圖2NCG對豬胎盤滋養(yǎng)層細胞基因表達的影響

Figure 2 Effect of NCG on related gene expression in pTr cell

3 討論

3.1 NCG對豬pTr細胞增殖的影響

體外培養(yǎng)測定細胞數(shù)量變化是評價細胞生長的最佳方法[14]。利用體外培養(yǎng)的方法，我們發(fā)現(xiàn)NCG可呈劑量依賴性促進豬pTr細胞增殖，隨著培養(yǎng)濃度的增加，細胞增殖1.2～1.5倍。NCG又稱之為精氨酸Raiser，大量研究都證實了NCG添加能夠提高豬和大鼠血液中精氨酸的濃度[15-17]，并增加血漿中鳥氨酸和脯氨酸的含量[17-18]。在胚胎發(fā)育過程中，氨基酸轉(zhuǎn)運載體SL7CA1可運送精氨酸到子宮腔中，為胚胎的生長發(fā)育提供營養(yǎng)支持[19]。在體外，豬pTr對一些營養(yǎng)因子較為敏感。含葡萄糖(4 mmol/L)和果糖(4 mmol/L)的培養(yǎng)基體外處理豬pTr 48 h或96 h可顯著促進細胞增殖1.5～5.0倍[20]。亮氨酸(1 mmol/L)體外培養(yǎng)豬pTr 24 h可顯著促進細胞增殖[21]。另外，NCG體外對細胞增殖也有促進作用。1.0 mmol/L的NCG處理12 h可促進小鼠下丘腦GnRH細胞系GT1-7細胞增殖[12]，2.0 mmol/L的NCG處理48 h可顯著促進牛卵泡顆粒細胞增殖[22]。IUGR仔豬形成的一個主要原因就是胎盤生長發(fā)育受損[1, 23-24]，前期研究表明妊娠后期添加NCG可能是通過促進母豬胎盤發(fā)育繼而調(diào)控仔豬的初生重[5]。本研究結(jié)果顯示體外NCG添加可促進豬pTr細胞增殖，說明NCG促進母豬胎盤發(fā)育的營養(yǎng)調(diào)控作用可能是通過促進pTr細胞增殖實現(xiàn)的。

3.2 NCG對豬pTr細胞功能的影響

本研究選取10 mmol/L的NCG進行基因表達研究的原因是高濃度NCG可以顯著刺激細胞增殖，但對細胞分泌活性存在一定的抑制作用[12, 22]。

在細胞周期分裂的過程中，CDK4可以和CCND1特異性結(jié)合，從而促進細胞周期從G1期到S期的過度[25]。劉煬[21]體外用亮氨酸(1 mmol/L)處理豬pTr 24 h，發(fā)現(xiàn)G0-G1期細胞所占百分比升高，將有更少的細胞周期發(fā)展至S期。但他發(fā)現(xiàn)CDK4基因的表達量沒有顯著變化，而高濃度的亮氨酸(10 mmol/L)抑制了豬pTr細胞增殖和CDK4基因的表達，細胞周期檢測顯示pTr細胞周期停滯在了G0-G1期，減少向S期轉(zhuǎn)化細胞的數(shù)量。在心外膜祖代細胞增殖研究中發(fā)現(xiàn)，CCND1基因mRNA表達水平升高時，CCK-8檢測顯示細胞增殖能力明顯增強，流式細胞周期檢查則提示G1期細胞數(shù)量減少，S/G2期細胞明顯增多[26]?？梢?，CDK4、CCND1基因表達水平與細胞增殖密切相關。本研究發(fā)現(xiàn)NCG體外刺激豬pTr后CDK4和CCND1基因mRNA表達水平顯著增加，表明細胞增殖能力旺盛，也暗示了NCG可通過上調(diào)細胞周期相關蛋白的表達促進豬pTr細胞增殖。

SLC2A1和SLC2A3是主要的葡萄糖轉(zhuǎn)運載體，這兩個基因mRNA和蛋白表達異常將降低胎盤的營養(yǎng)轉(zhuǎn)運效率[27]。敖政[28]在研究克隆豬和人工授精豬胎盤功能的差異時發(fā)現(xiàn)，部分克隆豬胎盤組織中SLC2A1基因表達水平顯著降低，說明了胎盤的營養(yǎng)供給異常是導致克隆豬初生重小和產(chǎn)后存活率低的一個主要原因。Lin等[29]研究日糧能量水平對IUGR仔數(shù)的影響時發(fā)現(xiàn)，在低脂低纖維妊娠日糧條件下，盡管仔豬胎兒體重降低但母豬胎盤SLC2A1基因表達水平升高，說明在能量水平低下的情況下，母體胎盤會通過上調(diào)SLC2A1基因表達來補償仔豬生長發(fā)育所需的葡萄糖。母體營養(yǎng)主要通過調(diào)控胎盤脂質(zhì)和能量代謝以及養(yǎng)分的轉(zhuǎn)運等提高胎盤效率，繼而影響胎兒的初生重，即高能量飼糧能夠增加仔豬初生重，并有效降低初生窩內(nèi)體重變異[30]。研究發(fā)現(xiàn)NCG能夠上調(diào)豬pTrSLC2A1基因表達提高葡萄糖等能量物質(zhì)的轉(zhuǎn)運效率，從而增強胎盤功能。

CAT主要作用是催化H2O2分解為H2O和O2，使得H2O2不能與O2在鐵鰲合物作用下反應生成有害的OH離子。在大鼠母體營養(yǎng)不良的情況下，添加褪黑素可提高胎盤效率并補償胎兒的初生重，機理研究發(fā)現(xiàn)褪黑素通過提升 Mn-SOD和CAT蛋白表達水平增強胎盤的抗氧化能力[31]。近年研究發(fā)現(xiàn)，NCG在體內(nèi)也具有抗氧化作用[5, 32-33]。本研究發(fā)現(xiàn)NCG在體外也具有抗氧化的功能，具體表現(xiàn)在可上調(diào)豬pTrCAT基因的表達。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)體外10～25 mmol/L的NCG可以促進豬pTr細胞增殖，這種作用是通過上調(diào)細胞周期相關基因CDK4和CCND1、葡萄糖轉(zhuǎn)運相關基因SLC2A1和抗氧化應激相關基因CAT的表達實現(xiàn)的。