甲基磺酸乙酯(EMS)對醉魚草種子萌發(fā)的影響

(中南林業(yè)科技大學風景園林學院，湖南 長沙 410004)

醉魚草(Buddlejalindleyana)又名“毒魚草”、“癢見消”，為馬錢科(Loganiaceae)醉魚草屬(BuddlejaLinn.)落葉灌木，花期4—10月，能“招蜂引蝶”，是園林中常用的優(yōu)質(zhì)觀花灌木[1]。醉魚草最早在《本草綱目》中有相關記載，由此可見，至少在公元 1578 年前，人們就已經(jīng)對醉魚草的藥用價值進行了研究應用[2]。醉魚草為多個省份的鄉(xiāng)土植物，其生境要求低，適應性強，具有一定的抗旱、耐鹽堿能力[3-5]，是改良土壤重金屬污染及鹽堿化的理想植物。實地調(diào)查發(fā)現(xiàn)，醉魚草花開于枝頂，花期長，貫穿三季，但株形開散，姿態(tài)觀賞性差，園林應用中常需對其進行不斷地修剪，而修剪往往會剪去萌蘗花芽，從而降低其觀賞效果。因而開展醉魚草的種質(zhì)創(chuàng)新和新品種選育對提高醉魚草的觀賞價值和改良土壤具有重要的意義。

甲基磺酸乙酯(EMS)誘變具有誘變頻率高、誘變范圍廣以及誘變效率高等優(yōu)點[6]。Klmark于1953年首次報道了EMS的誘導作用[7]。之后，EMS開始應用于植物、動物、真菌等多個領域[8-10]。據(jù)不完全統(tǒng)計，利用EMS誘變已育成了2 250個植物品種[11]。EMS作用后產(chǎn)生的顯性性狀比較多[12]，利用EMS進行物種誘變，是獲得抗性植株、葉色、花色、株形等性狀改變的重要手段[13-14]。目前，利用EMS誘變技術已在紫花苜蓿[15]、三角梅[16]、寒蘭[17]、杉木[18]、白三葉[19]等植株上進行了研究，均取得了一定的成效。

當前，國內(nèi)關于醉魚草的研究主要集中在藥用、抗逆性及扦插繁殖技術等方面[20-22]。國外學者對醉魚草同屬植物大葉醉魚草進行了大量的雜交及誘變處理，已培育出眾多新品種,如“SUMMER SKIES[23]”、“miss ruby[24]”、“Blue Chip[25]”等。醉魚草分布范圍廣，遍布于我國12個省份[1]，但對于醉魚草的品種改良及新品種的創(chuàng)制研究幾乎處于空白階段。因此，本實驗利用EMS的不同濃度及處理時間對醉魚草種子進行處理，以確定適宜的誘變濃度和時間，為醉魚草的性狀改良及種質(zhì)創(chuàng)新提供基礎材料，為日后大規(guī)模構建醉魚草EMS誘變?nèi)后w提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及試劑

醉魚草種子于2018年12月底采自湖南省洋湖濕地公園，自然干燥后于4 ℃下保存，千粒重約0.037 5 g。

1.2 實驗方法

1.2.1實驗設計

選取顆粒飽滿的醉魚草種子6 300粒，50 ℃溫水下預浸5 min后，加蒸餾水于25 ℃環(huán)境下浸種12 h。吸干種子表面水分，用0.1 mol·L-1，pH=7.0的磷酸緩沖液依次配制濃度為0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%，3.0%等共6個梯度的EMS溶液，設置12、24、48 h共3個時間梯度，pH=7.0的磷酸緩沖液處理作為對照，處理完成后用蒸餾水沖洗3次，每組處理重復3次。將沖洗后的種子均勻地鋪在墊有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，濾紙下方鋪有吸水棉以保濕，于22～25 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱中進行種子發(fā)芽處理，光照1 200 lx。

1.2.2發(fā)芽指標測定

播種后每日09：00統(tǒng)計種子發(fā)芽數(shù)至發(fā)芽數(shù)不變，以胚根突破種皮作為發(fā)芽成功的標準。發(fā)芽結束后，各處理隨機抽取5株幼苗，直尺測定其根長、芽長。各發(fā)芽相關指標計算公式如下：

種子發(fā)芽率(%)=(各處理種子發(fā)芽數(shù)/各處理種子總數(shù))×100%；

相對發(fā)芽率(%)=(各處理種子發(fā)芽總數(shù)/對照組發(fā)芽總數(shù))×100%；

相對致死率(%)=[(對照組發(fā)芽總數(shù)-各處理種子發(fā)芽總數(shù))/對照組種子發(fā)芽總數(shù)]×100%。

1.2.3數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件對原始數(shù)據(jù)進行記錄，SPSS 19.0軟件對不同濃度和時間處理種子的發(fā)芽率、相對發(fā)芽率、相對致死率等指標進行單因素方差分析及多重比較，采用Origin 2017軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 不同濃度EMS處理12 h對醉魚草種子萌發(fā)的影響

由表1可知，種子浸泡處理12 h，不同濃度EMS誘變劑對種子的始發(fā)芽日、種子發(fā)芽率、相對發(fā)芽率、相對致死率均具有顯著性影響，且呈現(xiàn)規(guī)律性變化。醉魚草種子經(jīng)EMS處理后于第3天開始發(fā)芽，當EMS溶液濃度達到1.2%時，種子的萌發(fā)時間明顯延緩。與對照相比，除0.4%濃度外，醉魚草種子的發(fā)芽率、相對發(fā)芽率均隨EMS濃度的升高而降低，且濃度越高，發(fā)芽率下降速率越大。其濃度在2.0%～3.0%梯度下，相對發(fā)芽率下降6.0%，下降速率最快。當EMS濃度為0.8%～1.6%時，發(fā)芽率、相對發(fā)芽率與對照相比具有顯著差異，當EMS濃度為2.0%和3.0%時，差異極顯著。

2.2 不同濃度EMS處理24 h對醉魚草種子萌發(fā)的影響

由表2可知，與12 h處理相同，高濃度EMS溶液對種子的發(fā)芽具有抑制作用，且隨著EMS濃度的升高，種子的發(fā)芽率具有增加的趨勢。當誘變劑濃度為0.4%、1.2%時，發(fā)芽率分別為73.33%和74.33%，均大于對照組。濃度在2.0%～3.0%范圍內(nèi)，發(fā)芽率、相對發(fā)芽率下降，相對致死率上升，與其他組相比均具有顯著差異。其中濃度為3.0%時，發(fā)芽率最低，為53%，與對照相比下降了19%。0.4%～1.6%范圍內(nèi)，與對照組相比，發(fā)芽率、相對發(fā)芽率和相對致死率均不存在顯著差異，不具統(tǒng)計學意義，其中濃度為3.0%時相對致死率最高，為26.62%，未達到LD50。

表1 不同濃度EMS溶液在12 h條件下醉魚草種子的發(fā)芽情況

注：表中不同小寫字母表示差異達顯著水平。下同。

表2 EMS溶液在24 h條件下醉魚草種子的發(fā)芽情況

2.3 不同濃度EMS處理48 h對醉魚草種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

由表3可知，48 h處理下，高濃度EMS抑制種子發(fā)芽，且隨著濃度的不斷升高，發(fā)芽率、相對發(fā)芽率逐漸下降，相對致死率逐漸上升。濃度為0.8%或更高時，種子的發(fā)芽率、相對發(fā)芽率及相對致死率與對照組相比均具有顯著差異。當EMS濃度為3.0%時，種子的發(fā)芽率為30.33%，以半致死量為參照，該濃度為48 h處理下最佳誘變劑量。

2.4 不同濃度EMS和時間誘變處理對醉魚草種子萌發(fā)的影響

由圖1可見，在3個不同時間(12、24、48 h)及不同濃度的EMS處理下，醉魚草種子的發(fā)芽率整體均呈下降趨勢，且同一濃度下，處理48 h后的發(fā)芽率明顯低于其他2個處理時間(12、24 h)。12 h和48 h處理下，發(fā)芽率變化趨勢基本一致，而在24 h處理下，EMS濃度在0.8%～1.2%范圍內(nèi)時發(fā)芽率呈明顯的增高趨勢。濃度為2.0%～3.0%時，3個時間處理下發(fā)芽率均顯著下降，其中48 h處理下種子的發(fā)芽率下降速度最快，對種子的毒害作用最大。24 h處理下，當EMS濃度為1.6%～2.0%時，發(fā)芽率的下降速率最快。12 h處理時，0.4%～0.8%濃度范圍下，發(fā)芽率的下降速率最快。EMS濃度為1.2%和1.6%時，24 h處理條件下發(fā)芽率最高，為分別為74.33%和72%，顯著高于24 h和12 h處理。3.0%EMS濃度下，各處理發(fā)芽率均取得了最低值，依次為27.36%、26.62%、49.90%。

表4 不同時間和濃度處理對醉魚草種子發(fā)芽及幼苗生長的影響

表3 EMS溶液處理48 h條件下醉魚草種子的發(fā)芽情況

圖1 不同濃度EMS溶液對醉魚草種子發(fā)芽率的影響

2.5 不同濃度EMS和時間誘變處理對醉魚草幼苗生長的影響

從圖2可見，隨EMS濃度的升高，不同時間處理下，幼苗長度均呈不斷下降的趨勢。12 h處理下，2.0%和3.0%兩濃度處理后幼苗長度與對照和0.4%濃度比較，存在顯著差異，其中0.4%和0.8%處理下幼苗長度下降0.25 mm,下降幅度最大，且該濃度范圍內(nèi)種子的發(fā)芽率下降速率較其他組間也最快(見表1)。24 h處理下，各濃度間幼苗長度無顯著變化，3.0%濃度下，幼苗長度最低，為0.97 mm,與對照組長度僅相差0.27 mm,差異不大。48 h處理下，3.0%濃度處理后幼苗長度與對照及其他濃度處理相比存在顯著差異。同一濃度處理條件下，除0.4%濃度在12 h處理下幼苗長度高于其他2個處理時間，其他濃度處理下，幼苗的長度均表現(xiàn)為，24 h處理下幼苗長度最高，其次為12 h處理，最短為48 h處理。

圖2 不同濃度EMS溶液對醉魚草幼苗生長的影響

2.6 不同濃度EMS和時間誘變處理對醉魚草種子萌發(fā)及幼苗生長的方差分析

從表4可知，不同時間對醉魚草種子發(fā)芽率、幼苗長度影響極顯著(p<0.01)，不同濃度處理對發(fā)芽率也存在極顯著影響。濃度和時間相互作用時，發(fā)芽率呈現(xiàn)顯著差異，對幼苗長度無顯著影響。由此可見，時間、濃度以及時間和濃度的相互作用是影響醉魚草種子發(fā)芽率的主體因素，濃度、時間是影響幼苗生長的主體因素。

3 討 論

研究結果表明，不同濃度和時間對醉魚草種子發(fā)芽時間、發(fā)芽率及幼苗生長均具有顯著的影響，經(jīng)EMS處理后，醉魚草種子的發(fā)芽起始時間和進程延緩，且低濃度對種子發(fā)芽率有一定的促進作用，云娜等[26]對蒙紅種子的研究中也得出了相同的結論，而隨著濃度不斷增高，種子的發(fā)芽普遍會受到抑制，發(fā)芽率會顯著降低，這與楊楠等[27]對知母(Anemarrhenaasphodeloides)種子的研究、張玥等[28]對無芒雀麥(Bromusinermis)種子的研究結果一致。EMS是通過溶解產(chǎn)生有機酸從而對種子產(chǎn)生毒害作用，低濃度情況下則作用效果弱[29]。濃度和時間是決定誘變效果的關鍵因素，研究顯示，不同物種對EMS的敏感度不同，這可能與種子的結構、種皮的透水性、種子的大小及種子內(nèi)部的休眠機制有關。慎家輝等[30]用EMS對杜梨(Pyrusbetulifolia)種子進行處理，結果表明0.4%體積濃度處理誘變效果最好。臧輝等研究發(fā)現(xiàn),1.5%濃度為EMS誘變羊草(Leymuschinensis)種子的優(yōu)化體系[31]。本次試驗結果表明，EMS濃度為3.0%，處理48 h,種子相對發(fā)芽率為50.10%，最接近半致死濃度，所以該組合為EMS誘變醉魚草的半致死劑量。

研究發(fā)現(xiàn)，醉魚草種子細小、種皮堅硬，外被細絨毛，能在土壤中建立種子庫，這些特征都是自然演變下利于其種子自然生存繁衍的有利進化。由此說明，種子具有一定的抵抗外界侵害的能力。對誘變處理后的醉魚草幼苗進行長度的測定，與其他兩組處理時間比較，24 h處理下并未呈現(xiàn)出處理時間越長，幼苗長度越短的態(tài)勢，且0.8%～3.0%范圍內(nèi)，24 h時間處理幼苗長度均高于12 h處理組，當濃度為1.2%和1.6%時，種子發(fā)芽率明顯高于其他時間處理組，原因可能是該時間處理下，醉魚草種子內(nèi)的多種類黃酮物質(zhì)[32-33]開始結合植物毒素、調(diào)控基因表達，保護植物器官，從而降低了EMS對幼苗生長的損害[34]。植物種子萌發(fā)受相關萌發(fā)基因控制，EMS可能激發(fā)抑制植物種子萌發(fā)的基因或改變植物種子萌發(fā)基因的表達[35]。不同植物基因的表達在不同的時期及組織具有非常復雜的調(diào)控模式，但其具體調(diào)控機制還有待進一步研究。

本試驗通過對3個時間段下，不同濃度的EMS溶液對醉魚草種子進行誘變處理，通過對各組發(fā)芽率、幼苗長等指標進行分析研究，最終得到了在EMS處理下醉魚草種子各指標的變化規(guī)律，并確定了EMS誘變醉魚草種子的半致死組合，結果可為醉魚草的誘變體庫建立及誘變育種提供參考。