線紋香茶菜及其變種種質資源芽期抗旱性鑒定與評價

劉 洋，孟爽爽3，邱佳佳3，劉軍民3，詹若挺

(1.廣州中醫(yī)藥大學中藥資源科學與工程研究中心，廣東 廣州 510006；2.嶺南中藥資源教育部重點實驗室(廣州中醫(yī)藥大學)，廣東 廣州 510006；3.廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣東 廣州 510006)

線紋香茶菜(Rabdosialophanthoides(R.lophanthoides))及其變種纖花線紋香茶菜(Rabdosialophanthoides(Buch.-Ham.Ex D.Don)var.Graciliflora(Benth.)Hara)、狹基線紋香茶菜(Rabdosialophanthoides(Buch.-Ham.Ex D.Don)var.Gerardianus(Benth.)Hara)為唇形科(Labiatae)香茶菜屬(Rabdosia)植物[1]，其干燥地上部分具有清熱利濕、涼血散瘀之功效，常在嶺南地區(qū)民間作藥用或茶飲，《廣東省中藥材標準》[2]和《云南省中藥材標準》[3]等收錄其為中藥“溪黃草”的基源植物，是消炎利膽片、膽石通膠囊等多種中成藥的組方原料。近年來，隨著市場需求量的日益增大，嶺南地區(qū)種植較為廣泛。線紋香茶菜及其變種野生狀態(tài)下常分布于溪邊、溝邊等水分充足的地方，其生長發(fā)育過程對水分的要求較高，一定程度上制約了其藥材生產的規(guī)?；l(fā)展。因此，亟需篩選挖掘抗旱性良好的種質類型用于藥材生產。目前，對線紋香茶菜及其變種的研究主要集中在化學成分和藥理藥效方面[4-7]，關于其干旱抗性方面的研究尚未見相關報道。因此，本試驗開展線紋香茶菜及其變種的芽期抗旱性研究，為其抗旱性育種研究提供科學依據(jù)。

高滲溶液模擬干旱脅迫法在芽期抗旱性鑒定中應用較多，其中PEG-6000高滲溶液因其操作簡單、可重復性好而被廣泛應用[8]。本研究擬通過PEG-6000高滲溶液模擬干旱脅迫，測定15份線紋香茶菜及其變種種質10項與抗旱性相關的萌發(fā)指標，采用抗旱系數(shù)、主成分分析、抗旱性度量值(D值)與聚類分析相結合的方法，以綜合評價其抗旱性，從而為線紋香茶菜及其變種抗旱種質鑒定篩選和抗旱育種提供方法和基礎材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

分別于廣東、江西等地收集15份不同居群種質，種植于廣州中醫(yī)藥大學時珍山線紋香茶菜種質資源圃，于果實成熟期采收種子，自然干燥后將種子置于4 ℃冰箱中密封保存。原植物經廣州中醫(yī)藥大學劉軍民教授鑒定為唇形科香茶菜屬植物線紋香茶菜、變種纖花線紋香茶菜及變種狹基線紋香茶菜。詳細信息見表1。

表1 15份線紋香茶菜及其變種種質信息

注：XW-02 、XH-01、XH-02、XH-06、XH-08為野生種質，其余均為栽培種質。

1.2 試驗方法

1.2.1種子的預處理

將精選后的種子先用75%乙醇消毒30 s，再用0.1%高錳酸鉀溶液消毒10 min，最后用蒸餾水沖洗5次，備用。

1.2.2芽期模擬干旱脅迫最適濃度

以XW-01、XJ-02、XH-02、XH-05等4份種質為材料，使用直徑10 cm的培養(yǎng)皿內鋪2張濾紙作萌發(fā)床，加入5 mL不同濃度的PEG-6000溶液，將50粒種子均勻置于濾紙上，蒸餾水萌發(fā)作對照。PEG-6000溶液設置5%、10%、15%、20%、25%不同濃度處理，置于光周期為14 h/10 h(晝/夜)，光照度為5 000 lx，溫度為25 ℃，濕度為60%的人工氣候箱中培養(yǎng)，每個處理3次重復，連續(xù)培養(yǎng)10 d，每天稱重補充消耗的蒸餾水以保持溶液濃度不變。

1.2.3芽期抗旱性鑒定及抗旱指標篩選

依照上述培養(yǎng)方法，以15份種質為材料，以最適 PEG-6000溶液模擬干旱脅迫，以蒸餾水進行相同處理作為對照，3次重復。

1.3 測定指標

萌發(fā)第4天測定發(fā)芽勢(GP)，萌發(fā)第10天測定發(fā)芽率(GR)以胚根露出種皮長度等于種子長度為發(fā)芽標準，第2天開始，每天統(tǒng)計發(fā)芽數(shù)，培養(yǎng)10 d后測量胚根長(RL)、下胚軸長(HL)、總芽長(TL)以及鮮重(FB)，70 ℃烘箱烘至恒重，稱量干重(DB)，并計算胚根/下胚軸指數(shù)(RL/HL)、發(fā)芽指數(shù)(GI)、活力指數(shù)(AI)。

胚根/下胚軸指數(shù)(RL/HL)=胚根長的抗旱系數(shù)/下胚軸長的抗旱系數(shù)

發(fā)芽指數(shù)=∑(Gt/Dt)(Dt為發(fā)芽日數(shù)；Gt為相對應的每日發(fā)芽數(shù))

活力指數(shù)=FB×GI(FB為幼芽鮮重；GI為發(fā)芽指數(shù))

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

差異顯著性分析方法采用dunnett檢驗[9]，進行5個不同濃度梯度PEG-6000溶液處理組與1個對照組的比較。

各指標的抗旱系數(shù)[10]和隸屬函數(shù)值[11]分別按式(1)和式(2)進行計算：

指標性狀的抗旱系數(shù)=脅迫下指標性狀值/對照下指標性狀值

……(1)

U(Xij)=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)

……(2)

式中，Xij為某一種質某指標的實測值，Xjmax為該指標的最大值，Xjmin為該指標的最小值。U(Xij)為i材料j性狀的隸屬值。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計與整理采用Excel 2010軟件，統(tǒng)計分析采用SPSS 22.0軟件。

2 結果與分析

2.1 芽期模擬干旱脅迫最適濃度

由表2可以看出：在PEG-6000濃度為5%、10%、15%時，XW-01、XJ-02、XH-02、XH-05等4份線紋香茶菜及其變種種質種子的發(fā)芽率與對照組相比基本無統(tǒng)計學意義。

當PEG-6000濃度升至20%及25%時，4份種質發(fā)芽率與對照相比均有統(tǒng)計學意義，但考慮到25%發(fā)芽率較低，可能淘汰掉發(fā)芽率低但其他萌發(fā)指標較優(yōu)的種質，故選擇濃度20%的PEG-6000為芽期脅迫的最適濃度。

2.2 干旱脅迫和對照條件下供試線紋香茶菜及其變種種質各指標的變化

20% PEG-6000濃度下，線紋香茶菜及其變種種子發(fā)芽勢為8.670 0%～0.000 0%，平均為2.266 7%，較對照下降66.577 8%；發(fā)芽率為83.330 0%～16.666 7%，平均為50.888 7%，較對照下降35.466 7%；其他指標也受到不同程度的抑制，其中芽鮮重、芽干重、胚根長、下胚軸長、總芽長均值較對照分別減少0.005 1 g、0.000 2 g、0.444 1 cm、0.036 4 cm、0.488 7 cm，活力指數(shù)和發(fā)芽指數(shù)分別下降8.287 6和0.111 9；相當于對照的44.736 8%、25%、39.021 1%、16.092 0%、36.141 1%、68.737 4%、81.798 2%。由此可知，旱脅迫對于線紋香茶菜及其變種種子萌發(fā)的抑制作用表現(xiàn)在多種性狀上，且抑制程度存在差異。發(fā)芽指數(shù)受抑制最大，下降達81.798 2%，活力指數(shù)次之，下降達68.737 4%，而下胚軸長受抑制最小，僅下降16.092 0%。此外，處理與對照相比，發(fā)芽勢、發(fā)芽率、鮮重、干重、發(fā)芽指數(shù)以及活力指數(shù)的變異系數(shù)均有不同程度的增加，而胚根長、下胚軸長及總芽長的變異系數(shù)出現(xiàn)不同程度的降低，其中發(fā)芽勢的變異系數(shù)最大，比對照增加了91.611 9%，是對照的2.54倍；下胚軸長的變異系數(shù)次之，比對照減少了62.748 2%，是對照的64.610 3%，說明不同品種的形態(tài)指標在干旱脅迫下差異更明顯。綜上所述，各指標對干旱脅迫反應的敏感性存在差異，直接采用各指標測定值很難鑒定供試種質的抗旱性，需對其進行綜合分析和評價。

表2 不同濃度PEG-6000溶液對線紋香茶菜及其變種種子發(fā)芽率的影響

注：“*”差異顯著(p<0.05))，“**”差異極顯著(p<0.01)。

2.3 線紋香茶菜及其變種種質抗旱相關10項萌發(fā)指標的抗旱系數(shù)

從表3可以看出：15份線紋香茶菜及其變種種質RE、GR、FB、DB、RL、HL、TL、RL/HL、GI、AI的抗旱系數(shù)均有較大變幅，變幅分別為0.00～0.10、0.26～0.86、0.32～0.73、0.22～1.60、0.35～2.28、0.4～1.34、0.35～1.79、0.32～2.37、0.12～0.40、0.04～0.29；種子萌發(fā)的10項指標對PEG-6000模擬干旱脅迫的敏感程度不同，敏感程度排序為GE>RL/HL>RL>TL>AI>DB>GR>GI>FB>HL；15份種質的10項指標平均值變幅在0.03～1.00之間，變異系數(shù)變幅在25.13%～124.60%之間。綜上所述，線紋香茶菜及其變種不同種質間的抗旱系數(shù)所反映的抗旱性不同，且同一種質各指標的抗旱系數(shù)差異較大，說明各指標對干旱脅迫的敏感性不同，直接采用這些指標會由于指標間信息重疊，很難客觀、準確地評價各種質的抗旱性，從而影響抗旱性鑒定結果。

2.4 主成分分析

主成分分析特征值中前3個成分的累計貢獻率達85.161%，且各成分特征值均大于1(表4)，根據(jù)主成分分析成分因子特征值大于1且累計貢獻率大于80%的原則，可認為此主成分分析的前3個成分代表了原始10個萌發(fā)指標的大部分信息。

表4 線紋香茶菜及其變種種質芽期抗旱相關10項萌發(fā)指標的抗旱系數(shù)

決定主成分1大小的主要是GE、GR、FB、DB、GI、AI的抗旱系數(shù)，主成分1 相當于4.682個原始指標的作用，反映了原始數(shù)據(jù)信息量的46.824%；決定主成分2大小的主要有RL、TL、RL/HL的抗旱系數(shù)，主成分2相當于2.733個原始指標的作用，反映了原始數(shù)據(jù)信息量的27.329%；決定主成分3大小的主要是HL的抗旱系數(shù)，主成分3相當于1.101個原始指標的作用，反映了原始數(shù)據(jù)信息量的11.008%。

2.5 抗旱性度量值分析

孟生旺認為，主成分分析中的第一主成分綜合原始數(shù)據(jù)信息的能力最強，在多指標綜合評價中，應以第一主成分確定各指標的權數(shù)[12]。根據(jù)抗旱系數(shù)計算15份種質指標的隸屬函數(shù)值(公式2)，以主成分1各指標的特征值作為各指標的權數(shù)與之相乘，分種質求和，即得到各種質的抗旱性度量值D(D值，表5)。

D值越大，抗旱性越強，反之越弱。15份種質的D值在0.647 2～5.493 7之間，其中，XJ-01的D值最高，為5.493 7，抗旱性最強；XH-011抗旱性度量值最小，為0.647 2，D值處于較低水平，抗旱性較弱。

2.6 抗旱系數(shù)與抗旱性度量值的相關性分析

15份線紋香茶菜及其變種種質10項指標的抗旱系數(shù)與D值相關性分析的結果(表6)表明：除GP、HL外，余下8項指標的抗旱系數(shù)都至少與1個其他指標的抗旱系數(shù)呈顯著或極顯著相關，說明除GP、HL外的8項指標間存在一定程度的相關性。

10項抗旱系數(shù)與D值的相關關系大小排序為AI>GI>GR>FB>GP>DB>HL>TL>RL>RL/HL；其中，GP、GR、FB、GI、AI的抗旱系數(shù)與D值呈極顯著相關，DB、HL、TL、RL、RL/HL的抗旱系數(shù)與D值的相關性均不顯著。

表5 線紋香茶菜及其變種各指標主成分的特征向量及貢獻率

注：“*”表示該指標在各主成分中的最大絕對值。

圖1 15份線紋香茶菜及其變種種質抗旱性度量值的聚類圖

表7 抗旱性系數(shù)與抗旱性度量值的相關性分析

2.7 15份線紋香茶菜及其變種抗旱性度量值的聚類分析

為了綜合評價線紋香茶菜及其變種種質的抗旱性，運用系統(tǒng)聚類法對15份種質的抗旱性度量值進行聚類分析，當平方歐氏距離為1時，其抗旱性可以分為4類(圖1)。

XH-07、XH-10、XH-03、XW-01、XH-06等5份種質聚為一類，為Ⅰ類；XH-02、XW-02、XH-05、XH-08、XJ-02等5份種質聚為一類，為Ⅱ類;XH-11、XH-04、XH-01等3份種質聚為一類，為Ⅲ類；XJ-01、XH-09等2份種質聚為一類，為Ⅳ類。根據(jù)15份種質的D值可以判斷4類線紋香茶菜及其變種種質的抗旱性強弱，依次為Ⅳ類>Ⅰ類>Ⅱ類>Ⅲ類，可劃分為高抗型、中抗型、抗型、抗性敏感型。

3 討論與結論

本研究使用PEG-6000溶液模擬干旱脅迫最適濃度篩選參照綠豆[13]等篩選芽期抗旱性鑒定的方法，此類糧食作物抗旱性研究眾多，方法應用較廣泛；在線紋香茶菜及其變種各種質抗性未知的情況下，選取線紋香茶菜、變種纖花線紋香茶菜、變種狹基線紋香茶菜等4份種質進行芽期抗旱最適PEG-6000濃度的探索，初步確定了芽期模擬抗旱鑒定的最適PEG-6000濃度為20%。此法存在一定誤差，可在后期得出芽期抗旱性鑒定結果后，再利用已知抗性種質進行芽期抗旱最適PEG-6000濃度的探索，以驗證初期濃度篩選結果。

種子萌發(fā)是植物生長過程中的重要階段，也是衡量植物抗旱性強弱的重要時期[14]。干旱脅迫下，線紋香茶菜及其變種種子萌發(fā)會做出響應，不同萌發(fā)指標對干旱脅迫的敏感度不同，通過單一指標對抗旱性進行評價存在片面性、局限性和不穩(wěn)定性；目前普遍認為，隸屬函數(shù)法、主成分分析法、聚類分析法等多指標多方法相結合的抗旱性綜合評價更加真實、可靠，采用多指標多方法結合綜合評價植物抗旱性已成為抗旱性鑒定方法的主流[15]，此法已應用在大豆[16]、谷子[17]、偃麥草[18]、棉花[19]、玉米[20]、甜瓜[21]等眾多作物抗旱研究上。故本研究選取與線紋香茶菜及其變種芽期抗旱相關的RE、GR、FB、DB、RL、HL、TL、RL/HL、GI、AI等10項萌發(fā)指標，基于抗旱系數(shù)，結合隸屬函數(shù)法、主成分分析法、抗旱性度量值法和聚類分析法綜合評價15份線紋香茶菜及其變種種質的抗旱性，其抗性強弱排序為XJ-01、XH-09>XH-07、XH-10、XH-03、XH-06、XW-01>XH-02、XW-02、XH-08、XH-05、XJ-02>XH-11、XH-04、XH-01。綜合評價結果將15份線紋香茶菜及其變種種質分為4個抗旱類型，初步篩選出XJ-01、XH-09共2份芽期抗旱性較強的種質，同時，篩選出GP、GR、FB、GI、AI作為線紋香茶菜及其變種芽期耐旱性評價指標。

從不同種質類型的角度分析，線紋香茶菜屬于柔弱草本，莖較柔軟，常匍匐于地面生長，而其2個變種的莖常直立生長，莖相對較壯碩；抗旱性鑒定結果顯示，抗旱性強的種質包括1份狹基香茶菜(XJ-01)和1份纖花香茶菜(XH-09)，說明線紋香茶菜對干旱脅迫的敏感程度相比其2個變種要強烈；本研究在前期種質資源調查收集的過程中發(fā)現(xiàn)，線紋香茶菜與狹基香茶菜的野生種群較少，而纖花香茶菜的野生資源則較為多見，推測可能與纖花香茶菜在野生狀態(tài)下遭GP、GR、FB、GI、AI遇水分脅迫時抗逆能力較強有關。遭受干旱脅迫時，植物抵抗逆境的方式有2種，分別是御逆性和耐逆性，其抗性強弱取決于遺傳潛力和抗逆鍛煉，抗逆鍛煉是指植物在逆境下形成對逆境適應和抵抗力的過程，即生產上的人工馴化過程。從不同生境類型來看，線紋香茶菜及其變種的野生種群常成叢生于河岸、溪旁、田邊、草叢、林下等陰濕處，泥土松軟含腐殖質多，生境地能供給植株生長所需水分且營養(yǎng)十分充足，而大田栽培種群多種植在寬闊的山下平地上，植物生長的水分來源主要依靠人工灌溉，大田種植的地塊多為黃土地，泥土較板實，生長期需定期施肥來提供營養(yǎng)；野生居群和栽培居群的植物根系特征相差也較大，前者根系不發(fā)達須根較少，后者根系發(fā)達須根較多；本研究結果表明，芽期抗旱性較強的XJ-01和XH-09分別來自廣州中藥研究所和清遠英德，是栽培多年的種群，它們生境地的水分條件均較野生種群的差，推測可能是XJ-01與XH-09在人工栽培過程中種質的抗旱性得以馴化增強；本實驗的野生種群種子的芽期抗旱性均較差，可能是由于它們長期生長在充足水分生境下，因而對干旱脅迫較敏感。綜上所述，這種野生資源分布及長勢上的差異性，推測有可能與其抗旱性特性的差異有關。今后可以結合苗期抗旱性鑒定與抗旱生理研究結果進一步分析探討線紋香茶菜及其變種的抗旱特性，為抗旱性優(yōu)良種質的篩選奠定基礎，還可進一步研究能否通過人工馴化增強線紋香茶菜及其變種的抗旱性。