韃靼忍冬和疏花薔薇組培快繁體系的建立研究

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與園藝學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆特克斯縣林業(yè)局，新疆 特克斯縣 835500)

韃靼忍冬(LoniceratataricaL.)別名新疆忍冬、桃色忍冬，為忍冬科忍冬屬落葉灌木，在新疆主要分布于西天山海拔1 100～1 800 m的山谷、溝谷、河谷及河岸邊[1]。疏花薔薇(RosalaxaRatz.)是薔薇科、薔薇屬的落葉灌木，在新疆主要分布于西天山海拔500～1 150 m的山谷、溝谷、河谷及河岸邊[2]。韃靼忍冬和疏花薔薇作為西天山野果林中極具特色的伴生種，具有較高的抗逆性和觀(guān)賞價(jià)值。新疆地處西北干旱區(qū)，由于環(huán)境條件相對(duì)惡劣，導(dǎo)致城市綠地生態(tài)系統(tǒng)種類(lèi)相對(duì)單一、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性差，缺乏地域特色等現(xiàn)象[3]。因此，研究和開(kāi)發(fā)利用野生觀(guān)賞植物資源，對(duì)于豐富新疆園林綠化植物種類(lèi)、提高植物抗性、培育新品種、塑造具有地方特色的園林景觀(guān)具有重要的意義。在實(shí)際生產(chǎn)中，韃靼忍冬和疏花薔薇多采用種子和扦插繁殖方法進(jìn)行繁殖，扦插雖能夠快速體現(xiàn)出觀(guān)賞植物的觀(guān)賞價(jià)值，但長(zhǎng)期采用扦插繁殖易致種質(zhì)退化，且種子繁殖困難，相對(duì)比較植物組織培養(yǎng)技術(shù)具有繁殖速度快、取材少、保持母株優(yōu)良遺傳特性等優(yōu)點(diǎn)，更適合于優(yōu)良樹(shù)種的大量繁殖[4]。李翔等通過(guò)研究華南忍冬組織培養(yǎng)的無(wú)菌體系建立發(fā)現(xiàn)，初代培養(yǎng)腋芽萌發(fā)較適宜的培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg·L-1,萌發(fā)率為63.3%；繼代增殖較適宜培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.7 mg·L-1，平均每叢叢芽增加芽數(shù)為10.7個(gè)[5]；葉立濤等研究灰氈毛忍冬組織培養(yǎng)與快繁技術(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：最適初代培養(yǎng)基為 N 6+1.0 mg·L-1BA+0.1 mg·L-1NAA；最佳增殖培養(yǎng)基為N 6+1.5 mg·L-1BA+ 0.5 mg·L-1NAA，增殖系數(shù)高達(dá) 5.2；最佳生根培養(yǎng)基為 1/2 MS+1.5 mg·L-1IBA+ 1%活性炭最好[6]；李斌認(rèn)為,培養(yǎng)基1/2 MS+0.50 mg·L-1TDZ+0.02 mg·L-12,4-D+5.0 mg·L-1AgNO3適用于無(wú)籽刺梨葉柄的分化培養(yǎng)，分化率為 50.0%；適用于無(wú)籽刺梨增殖的培養(yǎng)基為MS+0.50 mg·L-16-BA+0.10 mg·L-1NAA，增殖倍數(shù)達(dá)5.56；在1/2 MS+0.10 mg·L-1IBA+0.20 mg·L-1NAA+0.30 g·L-1活性炭的培養(yǎng)基上，無(wú)籽刺梨的生根率為 92.5%[7]。以天山野果林韃靼忍冬和疏花薔薇帶芽莖段為試驗(yàn)材料，采用不同培養(yǎng)基、不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理方法進(jìn)行組織培養(yǎng)試驗(yàn)，期望為韃靼忍冬和疏花薔薇的引種、繁殖及育種工作提供技術(shù)支持和科學(xué)依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以韃靼忍冬和疏花薔薇具有腋芽的莖段為材料，材料為種植于新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園藝學(xué)院實(shí)驗(yàn)室的一年生幼苗。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1外植體的消毒

將枝條截成2～3 cm長(zhǎng)帶1～2個(gè)節(jié)的莖段，用飽和洗衣粉溶液浸泡30 min，然后用自來(lái)水沖洗干凈，并用流水沖洗2 h左右。然后在超凈工作臺(tái)上，用75%酒精浸泡20 s，1 g·L-1升汞溶液消毒5 min，再用無(wú)菌水沖洗5次，期間不斷搖動(dòng)，然后將莖段取出置于接種盤(pán)中備用。

1.2.2誘導(dǎo)培養(yǎng)

選擇MS和B5培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，同一附加1.5 mg·L-16-BA和0.5 mg·L-1IBA；在超凈工作臺(tái)上，將已消毒的外植體材料剪去兩端已被消毒劑損傷的組織，留取長(zhǎng)1.5～2.0 cm的莖尖或具腋芽的節(jié)間，接種于已準(zhǔn)備好的基本培養(yǎng)基上，每瓶培養(yǎng)基接3個(gè)外植體材料，每種培養(yǎng)基20瓶，重復(fù)3次。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)污染率和腋芽誘導(dǎo)率。所有培養(yǎng)基的蔗糖濃度均為30 g·L-1，瓊脂濃度均為7 g·L-1，pH=5.8。培養(yǎng)溫度(24±2)℃，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx，光照時(shí)間12 h·d-1。

腋芽誘導(dǎo)率(%)=(萌芽的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù))×100%；

污染率(%)=(污染的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù))×100%。

1.2.3增殖培養(yǎng)

將外植體誘導(dǎo)所得叢生芽進(jìn)行剪切，以2～4個(gè)芽為一叢進(jìn)行分割后，接種到增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加6-BA( 1.0 mg·L-1、1.5 mg·L-1、2.0 mg·L-1)、NAA(0.2 mg·L-1、0.5 mg·L-1) 和GA3(0 mg·L-1、1.0 mg·L-1)，總12個(gè)處理；每種培養(yǎng)基接種7瓶，每瓶3株，30 d后統(tǒng)計(jì)不定芽的增殖情況，計(jì)算增殖系數(shù)。所有培養(yǎng)基的蔗糖濃度均為30 g·L-1，瓊脂濃度均為7 g·L-1，pH=5.8。培養(yǎng)溫度(24 ± 2)℃，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx，光照時(shí)間12 h·d-1。

增殖系數(shù)=總芽數(shù)/接種芽數(shù)。

1.2.4生根培養(yǎng)

將株高2 cm以上、帶有4個(gè)以上葉片的無(wú)根壯苗，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上，1/2 MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加NAA(0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、1.5 mg·L-1)、6-BA(0.05 mg·L-1、0.1 mg·L-1) 和AC(0 g·L-1、1.0 g·L-1)，總12個(gè)處理；每種培養(yǎng)基接種7瓶，每瓶3株，進(jìn)行生根培養(yǎng)，20 d觀(guān)察統(tǒng)計(jì)生根率。所有培養(yǎng)基的蔗糖濃度均為30 g·L-1，瓊脂濃度均為7 g·L-1，pH=5.8。培養(yǎng)溫度(24 ± 2)℃，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx，光照時(shí)間12 h·d-1。

表2 不同激素配比對(duì)韃靼忍冬和疏花薔薇增殖培養(yǎng)的影響

注:同列數(shù)據(jù)后標(biāo)有不同小寫(xiě)字母分別表示差異極顯著(p<0.5)。

生根率(%)=(生根苗數(shù)/接種苗數(shù))× 100%。

1.2.5移栽煉苗

生根培養(yǎng)20 d后,打開(kāi)瓶口,使生根苗逐漸與外界接觸,以提高其適應(yīng)能力。保持較高的空氣濕度,氣溫高時(shí)注意遮陰,煉苗5 d。取苗前24～36 h,培養(yǎng)瓶注入干凈的自來(lái)水,以不淹沒(méi)小苗為標(biāo)準(zhǔn)。取苗時(shí),將注水軟化的培養(yǎng)基直接傾倒至塑料盆中,拾取小苗,洗凈根部的培養(yǎng)基,用1%的高錳酸鉀溶液浸泡小苗5～10 min,然后分別移入珍珠巖、珍珠巖+蛭石(1∶1)、珍珠巖+園土(1∶1)和蛭石+園土(1∶1)的基質(zhì)中,置于相對(duì)濕度80%～90%、溫度35～30 ℃的塑料拱棚培養(yǎng)，移栽30 d后統(tǒng)計(jì)成活率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010軟件和SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析和顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘導(dǎo)培養(yǎng)

由表1可以看出，MS培養(yǎng)基中的韃靼忍冬和疏花薔薇腋芽誘導(dǎo)率高于B5培養(yǎng)基。MS培養(yǎng)基上的韃靼忍冬和疏花薔薇腋芽誘導(dǎo)率分別為99.12%和100%，而B(niǎo)5培養(yǎng)基上的韃靼忍冬和疏花薔薇腋芽誘導(dǎo)率分別為96.43%和94.74%。而且MS培養(yǎng)基中的外植體愈傷組織多、叢生芽粗壯、生長(zhǎng)快；MS培養(yǎng)基中的韃靼忍冬和疏花薔薇、B5培養(yǎng)基中的韃靼忍冬和疏花薔薇污染率分別為0、0、0和5%。由此可見(jiàn)，韃靼忍冬和疏花薔薇莖段適宜的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基。

2.2 增殖培養(yǎng)

生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA、NAA和GA3的不同濃度組合對(duì)韃靼忍冬和疏花薔薇的增殖影響不同。由表2可知，其他因素不變的情況下，韃靼忍冬和疏花薔薇增殖系數(shù)隨著NAA濃度的增加逐漸降低。隨著6-BA濃度的增加韃靼忍冬的增殖系數(shù)逐漸提高，而疏花薔薇的增殖系數(shù)隨著6-BA濃度的增加而降低；添加GA3處理的增殖系數(shù)高于沒(méi)有添加GA3處理。培養(yǎng)基MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+GA31.0 mg·L-1上的韃靼忍冬叢生芽增殖數(shù)最多，增殖系數(shù)高達(dá)5.37，為韃靼忍冬最佳的繼代增殖培養(yǎng)基。而疏花薔薇增殖數(shù)最多的是MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+GA31.0 mg·L-1培養(yǎng)基，增殖系數(shù)為3.0。

表1 不同培養(yǎng)基對(duì)韃靼忍冬和疏花薔薇誘導(dǎo)率的影響

2.3 生根培養(yǎng)

2.3.1不同激素處理對(duì)韃靼忍冬和疏花薔薇生根率的影響

將經(jīng)過(guò)增殖培養(yǎng)30 d后，株高達(dá)2 cm以上的健壯韃靼忍冬和疏花薔薇組培苗植株轉(zhuǎn)接入含有不同濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的1/2 MS培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。由表3可知，3種激素對(duì)韃靼忍冬和疏花薔薇組培苗生根的影響程度不同。在其他因素不變的情況下，韃靼忍冬組培苗生根率隨著NAA濃度的提高先降后升，而隨著6-BA濃度的增加而降低；添加活性炭的培養(yǎng)基中，韃靼忍冬組培苗生根率明顯高于沒(méi)有活性炭的組培苗。疏花薔薇組培苗生根率隨著NAA和6-BA濃度的增加而提高；活性炭對(duì)疏花薔薇的影響與韃靼忍冬相似。因此，適合韃靼忍冬組培苗生根的最佳培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 1.5 mg·L-1+6-BA 0.05 mg·L-1+ 活性炭1.0 g·L-1，生根率為100%；而疏花薔薇組培苗生根最佳的培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 1.5 mg·L-1+6-BA 0.1 mg·L-1+ 活性炭1.0 g·L-1，生根率為66.67%。

表3 不同激素處理對(duì)韃靼忍冬和疏花薔薇生根率的影響

注:同列數(shù)據(jù)后標(biāo)有不同小寫(xiě)字母分別表示差異極顯著(p<0.5)。

注：A為不同激素處理對(duì)平均根數(shù)量的影響；B為不同激素處理對(duì)平均根長(zhǎng)度的影響；C為不同激素處理對(duì)平均根粗度的影響。圖1 不同激素處理對(duì)韃靼忍冬和疏花薔薇組培苗根質(zhì)量的影響

2.3.2不同激素處理對(duì)韃靼忍冬和疏花薔薇不定根質(zhì)量的影響

從圖1可以看出，各處理對(duì)韃靼忍冬和疏花薔薇組培苗不定根質(zhì)量影響的變化趨勢(shì)規(guī)律性不明顯。平均根數(shù)量方面，韃靼忍冬在培養(yǎng)基1/2 MS+NAA 1.0 mg·L-1+6-BA 0.1 mg·L-1+活性炭1.0 g·L-1中達(dá)到最高點(diǎn)，平均根數(shù)量為7.5條；而疏花薔薇的最高根數(shù)量出現(xiàn)在培養(yǎng)基1/2 MS+NAA 1.5 mg·L-1+ 6-BA 0.1 mg·L-1+活性炭1.0 g·L-1中，平均根數(shù)量為4.5條；在平均根長(zhǎng)度方面，韃靼忍冬和疏花薔薇都在培養(yǎng)基1/2 MS+NAA 1.0 mg·L-1+ 6-BA 0.05 mg·L-1+活性炭1.0 g·L-1中達(dá)到最高平均根長(zhǎng)度，分別為39.5 mm和29.1 mm；而平均根粗度方面，韃靼忍冬和疏花薔薇都在培養(yǎng)基1/2 MS+NAA 1.5 mg·L-1+6-BA 0.1 mg·L-1+活性炭1.0 g·L-1中達(dá)到最高的平均根粗度，分別為0.74 mm和1.01 mm。

2.4 移栽練苗

將生根的韃靼忍冬和疏花薔薇組培苗在濕度為80%～90%的環(huán)境中煉苗5 d后，用鑷子取出，用自來(lái)水沖洗干凈根系，然后移栽至4種基質(zhì)中(表4)，每種基質(zhì)20株，1個(gè)月后統(tǒng)計(jì)成活率。由表4可知，移栽珍珠巖中的韃靼忍冬和疏花薔薇組培苗成活率均高于其他3種基質(zhì)，成活率分別為90.00%和75.00%；而蛭石+園土(體積比1∶1)基質(zhì)中組培苗的成活率最低，韃靼忍冬和疏花薔薇成活率為20.00%和25.00%；4種基質(zhì)中韃靼忍冬和疏花薔薇組培苗最佳移栽基質(zhì)為單獨(dú)的珍珠巖。

表4 不同基質(zhì)處理對(duì)韃靼忍冬和疏花薔薇移栽苗成活率的影響

3 討 論

3.1 基本培養(yǎng)基對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響

MS和B5是在木本植物組織培養(yǎng)中最常用的培養(yǎng)基。由于各種植物所需營(yíng)養(yǎng)成分不盡相同，因此不同植物材料所適宜的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基也不同[8]。因此，選擇適合的基本培養(yǎng)基對(duì)植物組織培養(yǎng)的成敗至關(guān)重要。本試驗(yàn)得出，韃靼忍冬和疏花薔薇組織培養(yǎng)所適宜的基本培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基，接種MS培養(yǎng)基上的韃靼忍冬和疏花薔薇不定芽誘導(dǎo)率比B5培養(yǎng)基上的韃靼忍冬和疏花薔薇高2.69%和5.26%。張啟昌等用MS、N6、B5、H 和 White 5種培養(yǎng)基進(jìn)行了對(duì)比試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)MS是藍(lán)靛果忍冬莖段最佳的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，分化率達(dá)到 98.5%[9]。趙松峰發(fā)現(xiàn)，在MS、B5、White、WPM 4種基本培養(yǎng)基中，MS培養(yǎng)基是誘導(dǎo)豐花月季葉片愈傷組織的最佳培養(yǎng)，誘導(dǎo)率為35.5%[10]。劉冠楠等發(fā)現(xiàn)，MS培養(yǎng)基對(duì)金櫻子莖段不定芽誘導(dǎo)的效果均優(yōu)于WPM和B5兩種培養(yǎng)基[11]。韃靼忍冬和藍(lán)靛果忍冬屬于忍冬屬，疏花薔薇、豐花月季和金櫻子屬于薔薇屬，因此認(rèn)為MS培養(yǎng)基比B5培養(yǎng)基更有利于忍冬屬和薔薇屬植物不定芽的誘導(dǎo)，這可能是MS培養(yǎng)基具高鹽成分且所含微量元素和有機(jī)成分齊全而豐富，能較好地滿(mǎn)足忍冬屬和薔薇屬植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求。

注：A為韃靼忍冬腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)；B為韃靼忍冬組培苗增殖培養(yǎng)：C為韃靼忍冬組培苗生根培養(yǎng)；D為韃靼忍冬組培苗移栽。圖2 韃靼忍冬組培苗生根過(guò)程

注：A為疏花薔薇腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)；B為疏花薔薇組培苗增殖培養(yǎng)：C為疏花薔薇組培苗生根培養(yǎng)；D為疏花薔薇組培苗移栽。圖3 疏花薔薇組培苗生根過(guò)程

3.2 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)腋芽增殖的影響

繼代增殖是組織培養(yǎng)的關(guān)鍵，細(xì)胞分裂素6-BA與生長(zhǎng)素NAA 的配比對(duì)組培苗增殖的影響較大[12]。因此，在韃靼忍冬和疏花薔薇腋芽繼代增殖培養(yǎng)中設(shè)計(jì)了6-BA、NAA和GA3的組合配方。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，韃靼忍冬增殖培養(yǎng)基中6-BA與NAA比例為10∶1，附加1.0 mg·L-1GA3時(shí)增殖率最高，增殖系數(shù)為5.73。李群等研究認(rèn)為，6-BA與NAA比例為3∶1有利于灰氈毛忍冬新品種‘渝蕾一號(hào)’腋芽的增殖，增殖系數(shù)為5.1[13]；李永興等研究發(fā)現(xiàn)，6-BA與NAA比例為30∶1時(shí)，不僅灰氈毛忍冬苗生長(zhǎng)旺盛，而且具有較高的增殖系數(shù)，增殖倍數(shù)達(dá)4倍以上[14]；分析認(rèn)為，雖然韃靼忍冬和灰氈毛忍冬都屬于忍冬屬，但腋芽增殖培養(yǎng)所需要的6-BA和NAA比例不盡一致，這可能是由于生長(zhǎng)環(huán)境和基因型差異所導(dǎo)致的。因?yàn)轫^靼忍冬是野生忍冬，主要分布在西天山野果林，而灰氈毛忍冬是栽培品種，受到常年生長(zhǎng)環(huán)境的影響，導(dǎo)致雖然同屬于忍冬屬植物，但是對(duì)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的需求差異很大。

3.3 活性炭對(duì)組培苗生根的影響

組織培養(yǎng)過(guò)程中，組培苗的生根好壞將直接影響到組培苗的質(zhì)量和移栽成活率，活性碳對(duì)組培苗生根具有重要影響。活性炭由于具有極高的吸附能力已被廣泛用于植物組織培養(yǎng)中,它還能將培養(yǎng)基變黑提供類(lèi)似土壤的暗化條件,有利于離體生根與根生長(zhǎng)[15]；本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，韃靼忍冬和疏花薔薇組培苗分別在生根培養(yǎng)基1/2 MS+NAA 1.5 mg·L-1+6-BA 0.05 mg·L-1和1/2 MS+NAA 1.5 mg·L-1+6-BA 0.1 mg·L-1上同一附加 0.1% 活性炭時(shí)生根率最高，生根率分別為100%和66.67%。馬麗娜等研究認(rèn)為，培養(yǎng)基1/2 MS + 0.5 mg·L-1NAA上，添加0.2%活性炭能促進(jìn)新塔花的生根，生根率達(dá)60%，平均生根數(shù)達(dá)3.5條[16]；金香花等研究發(fā)現(xiàn)，1/2 MS+1.0 mg·L-1IBA+0.1% 活性炭是樹(shù)莓生根和試管苗生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)基[17]；王一諾等認(rèn)為，培養(yǎng)基1/2 MS+NAA 2.0 mg·L-1+ IBA 0.2 mg·L-1上，附加0.1%活性炭對(duì)黑果菝葜組培苗生根效果最好，生根率達(dá)到70%[18]。因此，生根培養(yǎng)基中添加0.1%～0.2%活性炭有利于組培苗生根，這可能是活性炭能吸附生根培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的有害酚類(lèi)物質(zhì),同時(shí)它還能將培養(yǎng)基變黑提供類(lèi)似土壤的暗化條件。

4 結(jié) 論

通過(guò)研究培養(yǎng)基種類(lèi)和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)韃靼忍冬和疏花薔薇離體培養(yǎng)及植株再生的影響,發(fā)現(xiàn)MS為韃靼忍冬和疏花薔薇莖段初代培養(yǎng)最適宜的基本培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基MS+6-BA 1.5 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1中,韃靼忍冬和疏花薔薇誘導(dǎo)率分別可達(dá)99.12%和100%；適合韃靼忍冬腋芽增殖的培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+GA31.0 mg·L-1，增殖系數(shù)可達(dá)5.37；而疏花薔薇腋芽增殖的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1，增殖系數(shù)高達(dá)3.0；適合韃靼忍冬組培苗生根的最佳培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 1.5 mg·L-1+6-BA 0.05 mg·L-1+ 活性炭1.0 g·L-1，生根率為100%；而疏花薔薇組培苗生根最佳的培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 1.5 mg·L-1+6-BA 0.1 mg·L-1+ 活性炭1.0 g·L-1，生根率為66.67%。煉苗移栽到單獨(dú)的珍珠巖基質(zhì)中,韃靼忍冬和疏花薔薇成活率分別達(dá)90%和75%。