氧化石墨烯對紫花苜蓿種子萌發(fā)與幼苗生長的影響

(天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,天津 300387)

近年來，隨著科技的發(fā)展，納米材料被廣泛應(yīng)用。納米材料具有接觸反應(yīng)活性、量子尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、電傳導(dǎo)性等特有的物理化學(xué)性質(zhì)，因其在自然環(huán)境中可能對動植物生長繁育、生態(tài)環(huán)境穩(wěn)定及社會安全等方面產(chǎn)生的負(fù)面影響而受到廣泛關(guān)注[1]。最初人們發(fā)現(xiàn)暴露在富勒烯水溶液中的鱸魚腦中產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化現(xiàn)象[2]，之后關(guān)于納米材料的生物毒理效應(yīng)的研究愈發(fā)深入。納米材料對生物體的毒理效應(yīng)會成為生態(tài)毒理學(xué)研究的一個重要方向[3]。

石墨烯(Graphene)是一種由碳原子以sp2雜化方式形成的蜂窩狀單層二維平面結(jié)構(gòu)納米材料，最初由英國曼切斯特大學(xué)的科研人員采用機(jī)械剝離法從石墨中分離出來單層石墨微片[4]。氧化石墨烯是石墨烯的氧化產(chǎn)物，相比石墨烯性質(zhì)更活潑，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、電磁、光學(xué)、能源、傳感器以及材料學(xué)等多個領(lǐng)域，在其生產(chǎn)加工、使用及回收處理等過程中，氧化石墨烯不可避免地進(jìn)入大氣、土壤、水環(huán)境中，對動植物造成影響。關(guān)于納米材料對植物生長發(fā)育的研究已有一些報道[5-6]，氧化石墨烯與其他碳納米材料對植物細(xì)胞影響的研究也有相當(dāng)?shù)倪M(jìn)展[7-9]，然而關(guān)于氧化石墨烯對于紫花苜蓿的影響研究仍待開展。

紫花苜蓿是我國主要牧草之一，也是歷史最長、種植面積最大、需求最多的牧草[10]，優(yōu)質(zhì)紫花苜蓿的干草蛋白質(zhì)含量可達(dá)18%，粗蛋白消化率為70%，是可消化蛋白質(zhì)最高的牧草之一。紫花苜蓿適應(yīng)性強(qiáng)，不同氣候環(huán)境中它都能較好地生長繁殖。我們選用紫花苜蓿作為實(shí)驗(yàn)對象，探究土壤中氧化石墨烯的含量對紫花苜蓿的萌發(fā)以及早期生長的影響，旨在揭示氧化石墨烯對豆科植物的生長繁育的調(diào)控規(guī)律與作用機(jī)制，進(jìn)一步的揭示納米材料對動植物生物毒理效應(yīng)以及可能存在的其他潛在風(fēng)險，為納米材料的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究材料

氧化石墨烯購自蘇州恒球納米公司，外觀為黑褐色粉末，厚度為3.4～8 mm，片層直徑10～50μm，層數(shù)5～10層，純度95%；比表面積100～300 m2·g-1。

實(shí)驗(yàn)用土壤取自天津師范大學(xué)校園內(nèi)表層0～20 cm土壤，風(fēng)干后過篩備用。土壤為砂質(zhì)粘土，pH 7.51，含水量17.89%，容重0.68 g·cm-3，孔隙度74.34%。

紫花苜蓿購自北京正道種業(yè)有限公司。

1.2 紫花苜蓿培植

采用上直徑23 cm、下直徑17 cm、高18 cm的塑料花盆，每盆中加入2.5 kg土壤，氧化石墨烯按0.5%、1.0%和1.5%比例加入，混勻，以不加氧化石墨烯(0%)為對照(ck)，每個處理3次重復(fù)。將100粒紫花苜蓿種子均勻撒入花盆中，稍微覆土并噴灑適量水，在發(fā)芽前進(jìn)行遮光處理，并保證水分充足，以滿足植物萌發(fā)所需。在子葉完全展開后，每天調(diào)換位置以保證光照一致。植物培養(yǎng)期間室內(nèi)溫度為18～25 ℃，相對濕度為30%～60%，光照為透入室內(nèi)的自然光。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1種子萌發(fā)

播種后第2天開始陸續(xù)萌發(fā)，每天統(tǒng)計發(fā)芽數(shù)，連續(xù)觀察至第5天萌發(fā)情況趨于穩(wěn)定，至第7天記錄完畢。評價種子萌發(fā)情況參數(shù)為：發(fā)芽勢(GE)、萌發(fā)率(GP)、萌發(fā)速率系數(shù)(CGR)、萌發(fā)指數(shù)(GI)。

計算公式：

GE(%)=(萌發(fā)4 d內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

GP(%)=(n/N)×100%；式中：n和N分別為萌發(fā)種子數(shù)和試驗(yàn)過程中所用種子總數(shù)；

CGR=[∑(t·n)/ ∑n]×100;式中：t為自萌發(fā)試驗(yàn)開始時的天數(shù)，n為在t天內(nèi)萌發(fā)的種子數(shù);

GI =∑(Gt/Dt);式中：Gt為時間t天的萌發(fā)種子數(shù)，Dt為萌發(fā)試驗(yàn)天數(shù)。

1.3.2株高動態(tài)

從第10天長出第1片真葉后，每盆隨機(jī)選取5株紫花苜蓿并取其平均株高。持續(xù)測定10 d，最后一天的植物株高為最終株高。

1.4 數(shù)據(jù)處理

紫花苜蓿種子萌發(fā)及株高動態(tài)生長效應(yīng)評價采用隸屬函數(shù)法[11]，公式如下：

R(Xj)=(Xj-Xmin) /(Xmax-Xmin)

式中，R為隸屬函數(shù)值，Xj為第j個綜合指標(biāo)，Xmax、Xmin分別為第j個綜合指標(biāo)的最大值和最小值。然后用各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值相加來計算綜合評定值。

采用SPSS 20.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，采用Turkey法進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性檢驗(yàn)(p<0.05)；采用Origin 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 氧化石墨烯對紫花苜蓿種子萌發(fā)的影響

氧化石墨烯對紫花苜蓿種子萌發(fā)的影響如表1所示。隨著土壤中添加氧化石墨烯比例的增加，紫花苜蓿種子的萌發(fā)勢、萌發(fā)率呈先增加后減少的趨勢，但是差異并不顯著；種子萌發(fā)速率指數(shù)表現(xiàn)出明顯的遞減趨勢，說明氧化石墨烯延長了紫花苜蓿的種子萌發(fā)時間；從萌發(fā)指數(shù)來看，氧化石墨烯提高了種子萌發(fā)指數(shù)，隨氧化石墨烯比例增加呈先升高后降低的趨勢，1.0%處理組的種子萌發(fā)指數(shù)最大，顯著高于對照組。

2.2 氧化石墨烯對紫花苜蓿幼苗株高的影響

紫花苜蓿幼苗株高生長情況如表2所示?？梢钥闯觯趸┖吭礁?，對幼苗的生長越不利，且隨著幼苗的生長發(fā)育，這種抑制表現(xiàn)得愈發(fā)顯著。在18 d之前，0.5%處理與對照組株高差異不顯著，在19、20 d，氧化石墨烯處理顯著低于對照，且隨氧化石墨烯添加比例的增加而降低。

表2 氧化石墨烯對紫花苜蓿株高動態(tài)的影響

表3 氧化石墨烯對紫花苜蓿指標(biāo)影響的隸屬函數(shù)分析

表1 氧化石墨烯對紫花苜蓿種子萌發(fā)的影響

注：不同小寫字母表示不同處理差異顯著(p<0.05)。下同。

20 d的幼苗株高如圖1所示。0.5%、1.0%和1.5%處理的幼苗株高和對照相比，分別降低10.96%、32.69%和48.08%，差異顯著。

圖1 氧化石墨烯對紫花苜蓿20d株高的影響

2.3 氧化石墨烯對紫花苜蓿萌發(fā)與幼苗生長影響效應(yīng)的評價

采用隸屬函數(shù)法對土壤中添加不同比例氧化石墨烯對紫花苜蓿種子萌發(fā)與幼苗生長的影響進(jìn)行評定(表3)。結(jié)果表明，1.0%處理組的紫花苜蓿，相對其他處理生長情況最好，排名第一，0.5%與1.5%處理的種子萌發(fā)與幼苗生長狀況明顯劣于對照，綜合評定排名為：1.0%、ck、1.5%、0.5%處理。

3 討論與結(jié)論

豆科植物的幼苗期是與根瘤菌建立共生關(guān)系的重要時期，根瘤侵染植物根系形成根瘤的過程需要植物為其提供養(yǎng)分[12]，而植物幼苗的生長情況直接關(guān)系到植物養(yǎng)分狀況。對于紫花苜蓿來說，萌發(fā)與初期生長對植物后期生長繁育極為重要。實(shí)驗(yàn)表明，氧化石墨烯使紫花苜蓿種子萌發(fā)速率變慢，但是萌發(fā)指數(shù)更高，相對來說種子活力更高?？傮w來說，1.0%氧化石墨烯處理的種子萌發(fā)生長效果最好，對于種子活力提升較大。He等研究認(rèn)為，氧化石墨烯的親水性與水傳輸性被用于促進(jìn)植物的萌發(fā)與生長，氧化石墨烯收集水并將水運(yùn)輸?shù)椒N子處以加速種子的萌發(fā)，進(jìn)而提高了種子活力[13]。Yin等發(fā)現(xiàn)，氧化石墨烯促進(jìn)種子萌發(fā)與幼苗生長，同時，氧化石墨烯可以吸附基質(zhì)中的重金屬，從而使得水稻的生長受到正面的影響[14]。此外，Hu等發(fā)現(xiàn)，氧化石墨烯能夠提升老化種子的活力，種子的萌發(fā)率提高了15%[15]。

雖然種子萌發(fā)指數(shù)得到提升，但氧化石墨烯并未顯著影響萌發(fā)勢和萌發(fā)率。種子的萌發(fā)需要滿足多個條件，水分、光照、氧氣和溫度等[16]，種子的年齡也影響著種子的萌發(fā)[17]。綜合認(rèn)為，種子的水分條件與土壤中氧化石墨烯含量相關(guān)，這直接影響了種子的萌發(fā)。另外，氧化石墨烯的生物毒性也需要考慮[19]。本研究表明，紫花苜蓿種子的萌發(fā)良好，說明實(shí)驗(yàn)條件適合種子萌發(fā)，而種子萌發(fā)率、萌發(fā)勢沒有受到顯著影響，可能是種子本身的特性影響所致。

研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的石墨烯或氧化石墨烯促進(jìn)植物的生長發(fā)育而高濃度抑制[20-21]。但是紫花苜蓿相對其他植物，抗逆性更高，能夠在更苛刻的條件下生長，可能萌發(fā)率與萌發(fā)勢并不會因?yàn)橥饨鐥l件改變而發(fā)生太多的變化。汪玉潔等研究認(rèn)為，納米材料侵入種子并在種皮附近聚集，種皮遭到破壞，對于一些植物來說這促進(jìn)了種子萌發(fā)[22]；而紫花苜蓿的種皮與番茄或水稻等種子不同，它更厚實(shí)堅韌，這種差異可能造成紫花苜蓿種子萌發(fā)速率變慢。

氧化石墨烯處理顯著降低了紫花苜蓿的株高，且隨著時間推移差距愈發(fā)明顯。王曉靜等研究認(rèn)為，氧化石墨烯對高羊茅株高的影響是先增加后減少的[23]；吳金海等研究也表明，氧化石墨烯對油菜的萌發(fā)與生長有著顯著的正面作用[24]；Yin等研究認(rèn)為，單獨(dú)的氧化石墨烯處理會抑制玉米的生長[14]。與上述研究不同的是，Zhao等關(guān)于氧化石墨烯對擬南芥影響的研究發(fā)現(xiàn)，氧化石墨烯對擬南芥幼苗的萌發(fā)，根、芽的生長，花、種子的發(fā)育并沒有明顯影響[25]。研究結(jié)果顯示，紫花苜蓿的萌發(fā)與幼苗生長受氧化石墨烯的影響，但是這種影響與之前的研究結(jié)果有所不同，可能的原因是氧化石墨烯對植物生長發(fā)育的影響對于單獨(dú)的某一種植物來說取決于植物本身。

隸屬函數(shù)分析是一種在多指標(biāo)測定基礎(chǔ)上對植物萌發(fā)和生長進(jìn)行綜合評價的方法，從而避免了單一指標(biāo)的片面性，提高評價的準(zhǔn)確性，能更好地揭示植物的生長狀況；隸屬函數(shù)值越大，表明該劑量的氧化石墨烯對種子萌發(fā)和幼苗生長的促進(jìn)作用越明顯[26]。本研究表明，1.0%的隸屬函數(shù)值最大，其次為對照，1.5%和0.5%處理則次之。

綜上所述，土壤中添加氧化石墨烯使紫花苜蓿種子的萌發(fā)速率變慢，提高了萌發(fā)指數(shù)，未顯著影響萌發(fā)率與萌發(fā)勢；氧化石墨烯顯著抑制了幼苗的生長，且隨著添加比例的增加和時間推移而加大。采用隸屬函數(shù)進(jìn)行綜合評定，結(jié)果為添加1.0%的氧化石墨烯處理表現(xiàn)最好。