人乳鐵蛋白(hLF)轉(zhuǎn)基因山羊的遺傳背景分析

宋紹征，張旻，李丹，陳朝軍，于康英，張婷，周鳴鳴，成勇

·動物及獸醫(yī)生物技術(shù)·

人乳鐵蛋白()轉(zhuǎn)基因山羊的遺傳背景分析

宋紹征1，張旻1，李丹1，陳朝軍1，于康英1，張婷2，周鳴鳴1，成勇2

1 無錫太湖學(xué)院 護(hù)理學(xué)院，江蘇 無錫 214000 2 揚(yáng)州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院 江蘇省轉(zhuǎn)基因動物制藥工程研究中心，江蘇 揚(yáng)州 225009

以隨機(jī)整合方式獲得的轉(zhuǎn)基因動物外源基因的拷貝數(shù)、整合位點(diǎn)及染色體核型等遺傳背景并不清楚，可能會存在外源基因的沉默整合、無效整合、毒性整合以及其表達(dá)水平不可預(yù)測等問題。文中選取了6只原代（F0）及其相對應(yīng)的子一代（F1）的人乳鐵蛋白（）轉(zhuǎn)基因山羊作為研究對象，分別頸靜脈采血、提取DNA，通過染色體核型分析、實(shí)時熒光定量PCR（qPCR）、ELISA和Western blotting等檢測技術(shù)，研究其外源基因的遺傳背景與表達(dá)水平。結(jié)果顯示，6只F0代轉(zhuǎn)基因山羊的染色體沒有明顯的形態(tài)變異、數(shù)量改變等異常情況。相對拷貝數(shù)高低不同（2–16），且能夠穩(wěn)定地遺傳給下一代，F(xiàn)0和F1代基因拷貝數(shù)一致。F1代轉(zhuǎn)基因山羊表達(dá)hLF水平最高可達(dá)1.12 g/L（L3-1，拷貝數(shù)8）。結(jié)果表明，整合的外源基因能夠穩(wěn)定地遺傳下一代，也沒有對轉(zhuǎn)基因山羊個體的生長發(fā)育造成障礙，而且拷貝數(shù)高低與hLF表達(dá)水平無明顯的相關(guān)性，這為轉(zhuǎn)基因山羊及其他轉(zhuǎn)基因動物的新品種培育奠定了基礎(chǔ)，解析了遺傳背景。

轉(zhuǎn)基因動物，核型分析，乳鐵蛋白，拷貝數(shù)，遺傳

通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)生產(chǎn)的后代外源基因并不一定都能高效表達(dá)及穩(wěn)定遺傳，有可能產(chǎn)生基因沉默或外源基因拷貝數(shù)丟失，這些都是育種過程中無法回避的問題[1]。另外，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，轉(zhuǎn)基因技術(shù)可能會引起宿主染色體數(shù)量和結(jié)構(gòu)的改變，易造成重構(gòu)胚的損傷和重編程異常，從而造成異常的核型[2-4]，直接導(dǎo)致胚胎在發(fā)育過程中死亡、流產(chǎn)或幼崽畸形[5]。Pursel等[6]和Reik等[7]相關(guān)研究也證實(shí)了當(dāng)外源基因插入到宿主染色體上重要的功能基因中，就會導(dǎo)致宿主的畸形發(fā)育甚至死亡。因此，在轉(zhuǎn)基因新品種培育的過程中，從分子遺傳到染色體核型以及動物外在表型，都需要進(jìn)行不斷的遴選。

相關(guān)研究表明，外源基因的拷貝數(shù)在傳遞中會出現(xiàn)差異，有可能會影響外源基因的表達(dá)和遺傳穩(wěn)定，而且外源基因的拷貝在世代傳遞過程中還可能發(fā)生丟失[8-10]。Migliaccio等[11]通過體外篩選K256細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，外源基因雖然能在許多位點(diǎn)整合和表達(dá)，但是只有在特定的位點(diǎn)才能穩(wěn)定遺傳給下一代，而其他位點(diǎn)處的外源基因就會發(fā)生丟失。此外，關(guān)于外源基因的拷貝數(shù)與表達(dá)水平之間的關(guān)系也說法不一。蔣冬花等[12]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)抗蟲基因的煙草中，抗病效果與整合的拷貝數(shù)呈負(fù)相關(guān)性，單拷貝的植株比2–3個拷貝的植株抗病能力更強(qiáng)。Mansur等[13]構(gòu)建了攜帶不同拷貝數(shù) (1、5、11) 的胰島素前體 (MIP) 基因的畢赤酵母載體，發(fā)現(xiàn)表達(dá)水平與拷貝數(shù)呈正相關(guān)性。

但是，目前關(guān)于轉(zhuǎn)基因動物的遺傳背景分析較少報(bào)道，尤其是人乳鐵蛋白 () 轉(zhuǎn)基因山羊的遺傳背景分析尚未見報(bào)道，如劉長國等對陜西省境內(nèi)5個山羊品種遺傳背景的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA (Radom amplified polymorphic DNA，RAPD) 分析[14]，毛鳳顯等對貴州地方山羊品種遺傳背景的微衛(wèi)星分析[15]，這些均是針對非轉(zhuǎn)基因普通山羊的遺傳背景分析。

因此，本研究為了分析轉(zhuǎn)基因山羊的遺傳背景，選取揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院江蘇省轉(zhuǎn)基因制藥工程研究中心通過核移植制備的轉(zhuǎn)基因山羊作為研究對象，采用熒光原位雜交 (Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)、實(shí)時熒光定量PCR (qPCR)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)和Western blotting作為研究手段，對轉(zhuǎn)基因山羊的核型和外源基因拷貝數(shù)進(jìn)行分析，旨在闡明轉(zhuǎn)基因山羊整合的外源基因是否會對本身造成影響、是否能夠穩(wěn)定遺傳給后代、拷貝數(shù)與外源基因表達(dá)水平的關(guān)系等一系列遺傳背景問題，為今后轉(zhuǎn)基因山羊及其他動物新品種培育提供良好的指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

GoqPCR Master Mix (Promega)，GoGreen Master Mix (Promega)，Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega)，pGEM-T Easy Vector (Promega)，SunShineclean質(zhì)粒小量抽提試劑盒 (SunShineBio)，凝膠回收試劑盒 (QIAGEN)，GeneRuLer? Low Range DNA ladders (Fermentas)，鼠抗hLF單克隆抗體 (Santa Cruz，sc-53498)、羊抗鼠單克隆抗體IgG-HRP (Santa Cruz，sc-2005)，其余未說明試劑均為國產(chǎn)分析純，分別購自生工生物工程 (上海) 股份有限公司和國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司等。

1.1.2 引物

根據(jù)外源基因和管家基因 (山羊-，基因組拷貝數(shù)為2) 序列用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成 (表1)。

1.1.3 質(zhì)粒

BLC14載體構(gòu)建并保存于本實(shí)驗(yàn)室，含有山羊β-乳球蛋白調(diào)控元件和功能基因 (圖2 A)。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動物

F0 (標(biāo)記L1–L6，BLC14載體轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細(xì)胞作為供核細(xì)胞，通過體細(xì)胞核移植制備的轉(zhuǎn)基因克隆山羊，整合外源基因) 及F1代 (標(biāo)記L1-1、L2-1、L3-1、L4-1、L5-1、L6-1，F(xiàn)0代與普通山羊雜交后代) 的轉(zhuǎn)基因山羊和普通非轉(zhuǎn)基因正常山羊 (標(biāo)記N0、N0-1) 來自揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)牧場，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 山羊血細(xì)胞染色體片的制備及核型分析

選取6只原代轉(zhuǎn)基因山羊 (F0，標(biāo)記L1–L6) 和2只正常山羊 (標(biāo)記N0、N0-1)，1%肝素鈉作抗凝劑，頸靜脈無菌采血2 mL。37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)72 h，添加終濃度0.5 mol/mL的秋水仙素處理后，繼續(xù)培養(yǎng)，使細(xì)胞分裂停止在分裂中期。收集對數(shù)生長期細(xì)胞，使用終濃度0.05 μg/mL的秋水仙素處理6 h，然后依次5 mL低滲液 (0.075 mol/L KCl) 37 ℃處理30 min、1 mL固定液 (甲醇/冰醋酸3∶1) 4 ℃放置20 min，重復(fù)固定2次后，?20 ℃過夜。次日，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個/mL，滴片 (20 cm高度滴到預(yù)冷凍的載玻片上)，在空氣中放置干燥。最后，添加1.5 g/L Giemsa工作液染色20 min，自來水沖洗載玻片，自然干燥。挑選良好的分裂相在顯微鏡下進(jìn)行放大、攝影。利用Adobe Photoshop 圖像處理軟件進(jìn)行染色體的計(jì)數(shù)、剪切、排隊(duì)，進(jìn)行同源染色體的配對、測量。

表1 RT-PCR擴(kuò)增引物序列

1.2.2 熒光原位雜交 (FISH) 檢測

BLC14質(zhì)粒經(jīng)Ⅰ/Ⅰ酶切回收15 936 bp的片段作為BLC14探針。Digoxigenin-11-dUTP切口平移法標(biāo)記探針，并進(jìn)行探針免疫學(xué)檢測：1 μL探針點(diǎn)尼龍膜；2 000 W，5 min，紫外交膜；馬萊酸緩沖液，室溫?fù)u動2 min；2 mL封閉液 (5% BSA)，30 min；添加2 mL熒光抗體Anti-Dig-fluorescine，使其終濃度為200 μg/mL，孵育30 min；洗滌2次 (洗滌液為0.1 mol/L 馬來酸+0.3% Tween20)， 15 min/次；添加10 mL檢測緩沖液 (0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液，pH 9.5)，平衡5 min；顯色、拍照并保存結(jié)果。標(biāo)記成功的探針，按照常規(guī)方法[16]進(jìn)行探針雜交：玻片置于 85 ℃變性液 (70%甲酰胺/2×SSC) 中3 min，立刻轉(zhuǎn)移至70%冰乙醇，脫水，晾干；探針雜交液 (2 μL 20×SSC，10 μL去離子甲酰胺，4 μL 50% DS，2 μL探針，2 μL超純水) 沸水浴5 min，轉(zhuǎn)移至冰浴5 min；滴加變性后的雜交緩沖液20 μL于玻片上，封口，37 ℃濕盒雜交過夜；PBS洗凈后，滴加100 μL抗體 (anti-dig-antibody)，37 ℃孵育2 h；PBS洗凈、晾干后，滴加20 μL DAPI復(fù)染；使用熒光倒置顯微鏡 (IX-71，Olympus，日本) 觀察，并拍照。

1.2.3 實(shí)時熒光定量PCR檢測拷貝數(shù)

選取6只原代轉(zhuǎn)基因山羊 (F0，標(biāo)記L1–L6) 及其對應(yīng)的后代 (F1，標(biāo)記L1-1、L2-1、L3-1、L4-1、L5-1、L6-1) 和2只正常山羊 (標(biāo)記N0、N0-1)，頸靜脈無菌采血0.5 mL (加15% EDTA抗凝)，提取基因組。根據(jù)外源基因和管家基因 (-，內(nèi)參基因) 序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增、回收，與pGEM-T Easy Vector以3∶1的比例進(jìn)行連接，4 ℃反應(yīng)8 h，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌落擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，酶切和測序鑒定，正確結(jié)果分別命名actin-T和 hLF-T。按照qPCR的操作說明進(jìn)行轉(zhuǎn)基因山羊和普通山羊基因組擴(kuò)增，反應(yīng)體系 (20 μL)：2×RT mix，10 μL；模板，1 μL；引物F和R (2 μmol/L)，2 μL；無核酸酶水，7 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性5 s，60 ℃退火及延伸30 s，40個循環(huán)。熔解曲線：溫度為60–95 ℃，間隔為0.5 ℃，時間為5秒/個。設(shè)定好如上程序，t值、閾值等實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由軟件自動收集生成。

1.2.4 ELISA檢測

選取F1代轉(zhuǎn)基因山羊 (標(biāo)記L1-1、L2-1、L3-1、L4-1、L5-1、L6-1) 和正常山羊 (標(biāo)記N0-1) 的乳清作為檢測樣品，每天用雌二醇 (2 mg/只)、黃體酮 (10 mg/只) 進(jìn)行人工誘導(dǎo)泌乳，連續(xù)催乳14 d后注射一支利血平 (0.5 mg/只)，2 d后收集乳汁。乳汁離心 (10 000 r/min，30 min) 去除上層脂肪及下層渾濁，吸取乳清，?20 ℃保存?zhèn)溆?。以轉(zhuǎn)基因山羊乳清作為樣本、普通山羊乳清作為陰性對照、PBS作為空白對照、人乳清作為陽性對照，使用鼠抗hLF單克隆抗體作為一抗 (sc-53498，Santa Cruz)、羊抗鼠單克隆抗體IgG-HRP (sc-2005，Santa Cruz) 作為二抗進(jìn)行ELISA檢測，顯色后酶標(biāo)儀測定450值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線、計(jì)算hLF表達(dá)量。

1.2.5 Western blotting檢測

乳清樣品以樣本稀釋液 (125 mmol/L NaCl，25 mmol/L Tris，5 mmol/L KCl, 2 mmol/L苯甲基磺酰氟，pH 7.4) 進(jìn)行100倍稀釋，按照1∶1體積與電泳上樣緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl，pH 6.8，200 mmol/L 1,4-二硫蘇糖醇，4% SDS，0.2%溴酚藍(lán)，20%甘油) 混勻，100 ℃加熱5 min，變性，進(jìn)行12% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)[17]。使用轉(zhuǎn)移緩沖液 (1.93 g/L Tris，9 g/L glycine) 將聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜，250 mA，轉(zhuǎn)印3 h。超純水沖洗后，37 ℃封閉 (20 mmol/L Tris，137 mmol/L NaCl，0.1% Tween-20，10%胎牛血清，pH 7.6)，2h。加入一抗稀釋液 (1∶1 000稀釋，鼠抗hLF單克隆抗體，sc-53498，Santa Cruz)，37 ℃孵育2 h。TTBS (20 mmol/L Tris，137 mmol/L NaCl，1% Tween-20，pH 7.6) 洗滌3次后，加入二抗-HRP稀釋液 (1∶2 000稀釋，羊抗鼠單克隆抗體IgG-HRP，sc-2005，Santa Cruz) 中，37 ℃孵育2 h。取出PVDF膜，PBS洗凈后，添加顯色液 (DAB 50 mg，0.05 mol/L TB 100 mL, 30 μL 30% H2O2，pH 7.6)，室溫15 min，晾干后拍照、記錄并保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因山羊的染色體圖譜分析

普通健康山羊的染色體數(shù)目是60條，有29對是同源染色體的常染色體，最后一對是性染色體。在轉(zhuǎn)基因山羊染色體片中挑選分散良好、形態(tài)清晰、收縮適中的中期分裂相，通過與普通非轉(zhuǎn)基因正常山羊染色體進(jìn)行比較，結(jié)果顯示：選取的6只F0代轉(zhuǎn)基因山羊 (L1、L2、L3、L4、L5、L6) 的染色體和正常山羊的染色體十分相似，沒有發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因山羊的染色體數(shù)目和形態(tài)結(jié)構(gòu)異常變化。從圖1中可以看出染色體數(shù)目均為60條，形狀均為馬蹄形；而性染色體X也為端著絲粒染色體，相對長度較大；Y染色體形態(tài)較小，可以很明顯地辨認(rèn)。

2.2 熒光原位雜交檢測結(jié)果

BLC14質(zhì)粒 (圖2A) 酶切回收15 936 bp大小的片段，與預(yù)期的結(jié)果一致，如圖2B所示。按照切口平移法用Digoxigenin-11-dUTP標(biāo)記BLC14探針的標(biāo)記效率如圖3 A所示。本實(shí)驗(yàn)共標(biāo)記了0.5 ng/μL和1 ng/μL兩種濃度的探針，均能夠達(dá)到實(shí)驗(yàn)的預(yù)期目標(biāo)，且標(biāo)記效率均能達(dá)到要求。BLC14探針與轉(zhuǎn)基因山羊雜交結(jié)果顯示，染色體上有明顯的綠色信號 (圖3B1，L3轉(zhuǎn)基因山羊，箭頭所示)，說明在該處染色體位點(diǎn)整合了外源目的基因 (11號染色體)；而正常非轉(zhuǎn)基因普通山羊中未見到雜交綠色熒光信號 (圖3B2)，說明正常普通山羊中不含有該外源基因。

圖1 山羊染色體核型分析圖

2.3 實(shí)時熒光定量PCR檢測外源基因hLF拷貝數(shù)

本研究檢測的拷貝數(shù)是相對于內(nèi)參基因的相對拷貝數(shù)，故內(nèi)參基因的選擇至關(guān)重要，我們選擇山羊β-肌動蛋白 (β-actin) 作為內(nèi)參基因，內(nèi)參基因-和外源目的基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%凝膠電泳，分別得到193 bp和210 bp的目標(biāo)片段，如圖4所示。根據(jù)qPCR的Conc ()= 10(–0.286*Ct+12.272)和Conc ()=10(–3.05*Ct+13.070)公式，分別計(jì)算出內(nèi)參基因和外源基因的平均拷貝數(shù)[18-19]。由于該內(nèi)參基因在山羊體內(nèi)是純合二倍體[20]，而轉(zhuǎn)基因山羊的外源基因是純合體的幾率極小，因此，通過公式“外源基因拷貝數(shù)=(待測試樣轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)×2)/待測試樣內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因拷貝數(shù)”計(jì)算出外源基因的相對拷貝數(shù)。如表2和表3所示，L1–L6號轉(zhuǎn)基因山羊的及其相應(yīng)的后代相對拷貝數(shù)分別是2、16、8、2、12、5，而正常普通山羊 (標(biāo)記N0、N0-1) 的相對拷貝數(shù)是0，這說明了轉(zhuǎn)基因山羊的外源基因能夠穩(wěn)定地遺傳給后代，拷貝數(shù)不發(fā)生變化。

圖4 內(nèi)參基因β-actin和外源基因hLF的PCR擴(kuò)增電泳圖

表2 hLF轉(zhuǎn)基因山羊中外源基因的拷貝數(shù)

表3 hLF轉(zhuǎn)基因山羊中外源基因的拷貝數(shù)與表達(dá)水平

2.4 ELISA檢測乳腺表達(dá)hLF情況

以人乳清標(biāo)準(zhǔn)品濃度 (g/L) 作為橫坐標(biāo)、450值作為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 (如圖5A所示)，6只F1代轉(zhuǎn)基因山羊乳腺表達(dá)hLF含量檢測結(jié)果見表3。根據(jù)曲線計(jì)算，其中L1-1和L4-1轉(zhuǎn)基因山羊乳清未檢測出hLF，其余4只轉(zhuǎn)基因山羊乳清檢測表達(dá)hLF的濃度在0.13–1.12 g/L之間 (L2-1：0.85 g/L，L3-1：1.12 g/L，L5-1：0.13 g/L，L6-1：0.19 g/L)，最高表達(dá)水平達(dá)到1.12 g/L (L3-1)。從表3的轉(zhuǎn)基因山羊表達(dá)水平和相對拷貝數(shù)對照結(jié)果中，可以看出相對拷貝數(shù)過低 (2) 的轉(zhuǎn)基因山羊未表達(dá)hLF，而其他表達(dá)hLF的轉(zhuǎn)基因山羊拷貝數(shù)與表達(dá)水平高低無直接明顯的相關(guān)性。

圖5 轉(zhuǎn)基因山羊乳腺表達(dá)hLF的檢測結(jié)果

2.5 Western blotting檢測乳腺表達(dá)hLF情況

乳清Western blotting結(jié)果 (圖5B) 表明，L2-1、L3-1、L5-1、L6-1號轉(zhuǎn)基因山羊的乳汁中均有人乳鐵蛋白 (分子量80 kDa) 的表達(dá)，出現(xiàn)大小約80 kDa的條帶，與預(yù)期目標(biāo)一致；而L1-1、L4-1和普通山羊乳汁中并沒有檢測出人乳鐵蛋白條帶，這與ELSIA檢測結(jié)果相一致。

3 討論

自轉(zhuǎn)基因技術(shù)誕生以來，在生物醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域產(chǎn)生了巨大的效益[1]，但外源基因在轉(zhuǎn)基因動物培育繁殖過程中無法穩(wěn)定高效地遺傳和表達(dá)是目前轉(zhuǎn)基因新品種培育面臨的主要困難之一，因此只有弄清外源基因的遺傳背景才能更好地建立轉(zhuǎn)基因新品系[21-22]。劉長國等分析了陜西省境內(nèi)5個山羊品種 (陜南白山羊、莎能奶山羊、關(guān)中奶山羊、安哥拉山羊、波爾山羊) 的遺傳變異及遺傳關(guān)系[14]，毛鳳顯等研究了4個貴州省地方山羊品種 (貴州白山羊、貴州黑山羊、黔北麻羊、榕江小香羊) 的遺傳背景[15]，均是針對普通山羊的遺傳背景分析。關(guān)于轉(zhuǎn)基因動物的遺傳背景分析的研究較少，尤其是轉(zhuǎn)基因山羊的遺傳背景分析少之又少。本文主要是從染色體的形態(tài)結(jié)構(gòu)和數(shù)量、外源基因在染色體上的拷貝數(shù)和遺傳性、拷貝數(shù)與表達(dá)水平間的關(guān)系等方面來研究轉(zhuǎn)基因山羊的遺傳背景。

通過核移植和顯微注射等方法制備的轉(zhuǎn)基因動物很容易造成染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常，致使胚胎在發(fā)育過程中自然流產(chǎn)或產(chǎn)生畸形個體[23]。而從我們獲得的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因山羊的染色體核型、數(shù)量與普通山羊沒有明顯的差異，染色體數(shù)目均是60條，其中29對為同源染色體的常染色體，最后一對為性染色體，形態(tài)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)為馬蹄形，性染色體X相對長度較大，Y染色體形態(tài)較小。轉(zhuǎn)基因動物中的外源基因通常以頭尾相連串聯(lián)體的形式整合到宿主染色體基因組上，分為單拷貝單一位點(diǎn)的整合、多拷貝單一位點(diǎn)的整合及多拷貝多位點(diǎn)的整合[24]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示6只F0代轉(zhuǎn)基因山羊與其相應(yīng)的F1后代外源基因的相對拷貝數(shù)相同，但整合拷貝數(shù)高低不同 (2–16)，這表明外源基因整合在宿主染色體拷貝數(shù)目不定，但是能夠在轉(zhuǎn)基因動物中穩(wěn)定遺傳，且拷貝數(shù)不變。同時，L3轉(zhuǎn)基因山羊的FISH結(jié)果顯示只有單一的熒光信號，說明該外源基因是以多拷貝單一位點(diǎn)的整合方式進(jìn)入山羊染色體中。此外，由于外源基因的絕對拷貝數(shù)較難測量，本文提出了“相對拷貝數(shù)”這一概念，主要是參照山羊-基因，以此作為內(nèi)參進(jìn)行拷貝數(shù)計(jì)算[18-19]。

據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，拷貝數(shù)與外源基因表達(dá)可以呈現(xiàn)正相關(guān)，也可以是負(fù)相關(guān)，或者拷貝數(shù)多少對表達(dá)無顯著的影響[8,25]。例如，Hobbs等[26]通過對轉(zhuǎn)基因煙草的基因表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)表達(dá)量的高低取決于外源基因的插入位點(diǎn)而不是拷貝數(shù)。Meyer等[27]的研究發(fā)現(xiàn)，多拷貝時，90%的轉(zhuǎn)基因玉米外源基因失活，在該基因啟動子附近還出現(xiàn)甲基化現(xiàn)象，這一現(xiàn)象表明多拷貝可能會導(dǎo)致外源基因表達(dá)抑制或失活。Kohli等[28]的研究發(fā)現(xiàn)，外源基因多拷貝并未導(dǎo)致其表達(dá)量下降或轉(zhuǎn)基因沉默，外源基因4–5個與1–2個拷貝的表達(dá)水平相差無幾。本研究中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因山羊的相對拷貝數(shù)過低時 (2) 不表達(dá)，但是表達(dá)水平的高低又和拷貝數(shù)無直接的相關(guān)性，最高表達(dá)水平 (1.12 g/L) 的轉(zhuǎn)基因山羊拷貝數(shù) (8) 并非最高。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能是外源基因的表達(dá)受拷貝數(shù)在內(nèi)的多種機(jī)制的調(diào)節(jié)，不能單獨(dú)考慮某一個特定的因素。

總之，本實(shí)驗(yàn)主要通過對轉(zhuǎn)基因山羊的遺傳背景分析研究發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)基因山羊的染色體核型、數(shù)量與普通山羊沒有明顯的差異，這表明外源基因的插入未導(dǎo)致染色體出現(xiàn)斷裂、缺失等現(xiàn)象；整合外源基因的拷貝數(shù)高低不同 (2–16)，但F0和F1代拷貝數(shù)相一致，這表明轉(zhuǎn)基因山羊外源基因能夠穩(wěn)定遺傳給下一代；6只F1代轉(zhuǎn)基因山羊中，2只山羊的乳汁未檢測到表達(dá)hLF (L1-1和L4-1，拷貝數(shù)均為2)，其余4只表達(dá)hLF量在0.13–1.12 g/L，最高表達(dá)水平達(dá)到1.12 g/L (L3-1，拷貝數(shù)為8)，這表明外源基因拷貝數(shù)多少和表達(dá)水平無直接明顯的相關(guān)性，過低或過高在一定程度上均可能影響外源基因的表達(dá)水平。因此，本研究首次比較全面地分析了轉(zhuǎn)基因山羊的遺傳背景，且該轉(zhuǎn)基因山羊能夠健康存活、正常繁殖和表達(dá)外源目的蛋白，為進(jìn)一步轉(zhuǎn)基因山羊遺傳育種和轉(zhuǎn)基因動物新品種培育奠定了基礎(chǔ)。

[1] Chansel-Debordeaux L, Bezard E. Local transgene expression and whole-body transgenesis to model brain diseases in nonhuman primate. Anim Model Exp Med, 2019, 2(1): 9–17.

[2] Chen JQ, Juan C, Xu XJ, et al. Effect of cytoplast on the development of inter-subspecies nuclear transfer reconstructed goat embryo. Mol Reprod Dev, 2007, 74(5): 568–573.

[3] Fischer K, Kind A, Schnieke A. Assembling multiple xenoprotective transgenes in pigs. Xenotransplantation, 2018, 25(6): e12431.

[4] Li GL, Zhong CL, Mo JX, et al. Advances in site-specific integration of transgene in animal genome. Hereditas, 2017, 39(2): 98–109 (in Chinese). 李國玲, 鐘翠麗, 莫健新, 等. 動物基因組定點(diǎn)整合轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究進(jìn)展. 遺傳, 2017, 39(2): 98–109.

[5] Di Meco A, Joshi YB, Lauretti E, et al. Maternal dexamethasone exposure ameliorates cognition and tau pathology in the offspring of triple transgenic AD mice. Mol Psychiatry, 2016, 21(3): 403–410.

[6] Pursel VG, Pinkert CA, Miller KF. Genetic engineering of livestock. Science, 1989, 244(4910): 1281–1288.

[7] Reik W, R?mer I, Barton SC, et al. Adult phenotype in the mouse can be affected by epigenetic events in the early embryo. Development, 1993, 119(3): 933–942.

[8] Bervoets I, Charlier D. A novel and versatile dual fluorescent reporter tool for the study of gene expression and regulation in multi- and single copy number. Gene, 2018, 642: 474–482.

[9] Bellec L, Katz LA. Analyses of chromosome copy number and expression level of four genes in the ciliatereveal a complex pattern that suggests epigenetic regulation. Gene, 2012, 504(2): 303–308.

[10] Lucotte EA, Skov L, Jensen JM, et al. Dynamic copy number evolution of X- and Y-linked ampliconic genes in human populations. Genetics, 2018, 209(3): 907–920.

[11] Migliaccio AR, Bengra C, Ling JH, et al. Stable and unstable transgene integration sites in the human genome: extinction of the Green Fluorescent Protein transgene in K562 cells. Gene, 2000, 256(1/2): 197–214.

[12] Jiang DH, Guo ZJ. Disease resistance and inheritance analysis of Cryptogein transgenic tobacco plants. Acta Phytopathol Sin, 2003, 33(3): 237–242 (in Chinese). 蔣冬花, 郭澤建. 轉(zhuǎn)隱地蛋白基因煙草的抗病性及遺傳分析. 植物病理學(xué)報(bào), 2003, 33(3): 237–242.

[13] Mansur M, Cabello C, Hernández L, et al. Multiple gene copy number enhances insulin precursor secretion in the yeast. Biotechnol Lett, 2005, 27(5): 339–345.

[14] Liu CG, Luo J, Yang GS, et al. Study on the genetic background of five goat breeds in Shaanxi province using RAPD. J Northwest Sci-Tech Univ Agric For: Nat Sci Ed, 2003, 31(3): 19–24 (in Chinese). 劉長國, 羅軍, 楊公社, 等. 陜西省境內(nèi)5個山羊品種遺傳背景的RAPD分析. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2003, 31(3): 19–24.

[15] Mao FX, Huangpu JY, Zhao YZ. Analysis of microsatellite loci on genetic background of the local goats in Guizhou province. Anim Husband Vet Med, 2006, 38(2): 13–15 (in Chinese). 毛鳳顯, 皇甫江云, 趙有璋. 貴州地方山羊品種遺傳背景的微衛(wèi)星分析. 畜牧與獸醫(yī), 2006, 38(2): 13–15.

[16] An LY, Yuan YG, Yu BL, et al. Generation of human lactoferrin transgenic cloned goats using donor cells with dual markers and a modified selection procedure. Theriogenology, 2012, 78(6):1303–1311.

[17] Song SZ, Ge X, Cheng YB, et al. High-level expression of a novel recombinant human plasminogen activator (rhPA) in the milk of transgenic rabbits and its thrombolytic bioactivity. Mol Biol Rep, 2016, 43(8): 775–783.

[18] Li K, Gao HL, Gao L, et al. Development of a real-time PCR for determination of foreign gene copy number in genome of. Acta Vet Zootech Sin, 2011, 42(5): 742–746 (in Chinese). 李凱, 高宏雷, 高立, 等. TaqMan實(shí)時熒光定量PCR檢測畢赤酵母基因組中外源基因拷貝數(shù). 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2011, 42(5): 742–746.

[19] Yu J, Zou J, Fu Q, et al. Detecting copy number of exogenous genes in transgenic tobacco by multiplex RT-PCR. Acta Tabacaria Sin, 2017, 23(4): 92–97 (in Chinese). 余婧, 鄒頡, 付強(qiáng), 等. 多重實(shí)時熒光定量PCR分析轉(zhuǎn)基因煙草外源基因拷貝數(shù). 中國煙草學(xué)報(bào), 2017, 23(4): 92–97.

[20] Das A, Deng MY, Babiuk S, et al. Modification of two capripoxvirus quantitative real-time PCR assays to improve diagnostic sensitivity and include beta-actin as an internal positive control. J Vet Diagn Invest, 2017, 29(3): 351–356.

[21] Lavania D, Dhingra A, Siddiqui MH, et al. Current status of the production of high temperature tolerant transgenic crops for cultivation in warmer climates. Plant Physiol Biochem, 2015, 86: 100–108.

[22] Wang JK, Cui K, Yang Z, et al. Transcriptome analysis of improved wool production in skin-specific transgenic sheep overexpressing ovine β-catenin. Int J Mol Sci, 2019, 20(3): 620, doi: 10.3390/ijms20030620.

[23] Scott GJ, Gruzdev A. Genome editing in mouse embryos with CRISPR/Cas9//Allen IC. Mouse Models of Innate Immunity. New York, NY: Humana Press, 2019: 23–40.

[24] Saito H, Kurome M, Tomii R, et al. Foreign gene integration patterns in transgenic porcine fetuses produced by ICSI-mediated gene transfer. Reprod Fert Dev, 2007, 19(1): 319–320.

[25] Rukh G, Ericson U, Andersson-Assarsson J, et al. Dietary starch intake modifies the relation between copy number variation in the salivary amylase gene and BMI. Am J Clin Nutr, 2017, 106(1): 256–262.

[26] Hobbs SLA, Kpodar P, DeLong CMO. The effect of T-DNA copy number, position and methylation on reporter gene expression in tobacco transformants. Plant Mol Biol, 1990, 15(6): 851–864.

[27] Meyer P, Heidmann I. Epigenetic variants of a transgenic petunia line show hypermethylation in transgene DNA: an indication for specific recognition of foreign DNA in transgenic plants. Mol Gen Genet, 1994, 243(4): 390–399.

[28] Kohli A, Griffiths S, Palacios N, et al. Molecular characterization of transforming plasmid rearrangements in transgenic rice reveals a recombination hotspot in the CaMV 35S promoter and confirms the predominance of microhomology mediated recombination. Plant J, 1999, 17(6): 591–601.

Genetic background of human lactoferrin transgenic goats

Shaozheng Song1, Min Zhang1, Dan Li1, Chaojun Chen1, Kangying Yu1, Ting Zhang2, Mingming Zhou1, and Yong Cheng2

1 School of Nursing, Taihu University of Wuxi, Wuxi 214000, Jiangsu, China 2 Jiangsu Provincial Research Center for Animal Transgenesis and Biopharming, College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu, China

The genetic background such as copy number, integration site and chromosome karyotype of exogenous genes of transgenic animals obtained by random integration is still unclear. There may be some problems such as silent integration, invalid integration, toxic integration and unpredictable expression level of exogenous genes.In this study, six primary (F0) and their corresponding offspring (F1) of human lactoferrin () transgenic goats were selected as the research objects, and blood samples were collected from jugular vein and DNA were extracted. The genetic background and expression level of exogenous genes were studied by chromosome karyotype analysis,real-time quantitative PCR (qPCR), ELISA and Western blotting. The chromosomes of six F0 transgenic goats had no obvious morphological variation, number change and other abnormalities. The relative copy number was different (2–16) and could be steadily inherited to the next generation. The copy number of F0 and F1gene was the same. The highest expression level of hLF was 1.12 g/L in F1 transgenic goats (L3-1, 8 copies). The results proved that the integrated exogenous genes could steadily inherit the next generation, and did not cause obstacles to the growth and development of transgenic goat individuals. Moreover, there was no obvious correlation between the number of copies and the expression level of hLF. This laid a foundation for the new varieties cultivation of transgenic goats and other transgenic animals, and analysis of genetic background.

transgenic animals, karyotype analysis, lactoferrin, copy number, heredity

宋紹征, 張旻, 李丹, 等. 人乳鐵蛋白 () 轉(zhuǎn)基因山羊的遺傳背景分析. 生物工程學(xué)報(bào), 2020, 36(1): 67–76.

Song SZ, Zhang M, Li D, et al. Genetic background of human lactoferrin transgenic goats. Chin J Biotech, 2020, 36(1): 67–76.

May 6, 2019;

June 19, 2019

Supported by: Natural Science Foundation of Colleges and Universities in Jiangsu Province, China (Nos. 17KJD310004, 19KJB180030), National Major Special Projects on New Cultivation for Transgenic Organisms (No. 2014ZX08008-004).

Yong Cheng. Tel: +86-514-87979348; E-mail:ssz0610@163.com

Mingming Zhou. Tel: +86-510-85532221; E-mail: zmm19770@126.com

10.13345/j.cjb.190173

江蘇省高校自然科學(xué)基金 (Nos. 17KJD310004, 19KJB180030)，國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng) (No. 2014ZX08008-004) 資助。

2019-07-16

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190715.0935.001.html

(本文責(zé)編 陳宏宇)