吉林省地區(qū)奶牛乳房炎中鏈球菌的分離鑒定及耐藥性分析

賈文博，王彥方，馬曉媛，王 晉，王 妍，王 楠*

1.延邊大學(xué)，吉林延吉 133000；2. 吉林省磐石市動物疫病預(yù)防控制中心，吉林磐石 132300；3.吉林大學(xué)，吉林長春 130062；4.吉林省動物疫病預(yù)防控制中心，吉林長春 130062

在世界各國奶牛業(yè)中，乳房炎是造成奶牛業(yè)損失最多的一種疾病，也是一種嚴(yán)重的人畜共患病[1]，主要臨床表現(xiàn)為乳區(qū)紅、腫、熱、痛及泌乳障礙。鏈球菌是引起乳房炎最普遍的菌屬之一，以無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌和化膿鏈球菌等最為常見[2]。為了解吉林地區(qū)奶牛乳房炎中各鏈球菌分布情況及耐藥性，本實(shí)驗(yàn)針對全省15個(gè)奶牛場的300份乳液樣品進(jìn)行了生化鑒定及藥敏試驗(yàn)。

1 材料采集和應(yīng)用方法

1.1 材料采集

1.1.1 樣品來源：吉林省15個(gè)奶牛場采集的300份臨床奶牛乳房炎的乳樣。

1.1.2 儀器與試劑生物安全柜、恒溫培養(yǎng)箱、比濁儀、渦旋振蕩器、全自動微生物接種儀、微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)（美國Thermo Fisher Scientific）；光學(xué)顯微鏡（日本奧林帕斯株式會社）；革蘭氏染色劑、去離子水、0.5麥?zhǔn)媳葷峁?、革蘭氏陽性菌鑒定板、CAMHBT肉湯、革蘭氏陽性菌藥敏板均購自美國Thermo Fisher Scientific。

1.2 應(yīng)用方法

1.2.1 細(xì)菌分離將乳樣在渦旋振蕩器上震蕩混勻，在生物安全柜中進(jìn)行無菌操作，使用一次性接種環(huán)，采用平板劃線法接種于血瓊脂平板上并標(biāo)記序號及日期，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，從血瓊脂平板中用一次性接種環(huán)挑取單個(gè)菌落革蘭氏染色，鏡檢。初步判定是革蘭氏陽性球狀的單個(gè)菌落，再次平板劃線接種于新的血瓊脂平板上純化培養(yǎng)，18 h后革蘭染色、鏡檢。肉眼觀察到比較純凈，沒有雜質(zhì)的革蘭氏陽性球狀菌進(jìn)行生化鑒定。

1.2.2 生化鑒定將0.5麥?zhǔn)系臉?biāo)準(zhǔn)管插入比濁儀進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)調(diào)整后，從純化的血瓊脂平板上用一次性接種環(huán)挑取3～5個(gè)單個(gè)菌落放入去離子水中渦旋振蕩器乳化，隨后插入比濁儀調(diào)整到標(biāo)準(zhǔn)的0.5麥?zhǔn)?。使用接種儀將菌液接種至革蘭氏陽性菌鑒定板中，置于36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后用微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)讀取鑒定結(jié)果。

1.2.3 藥敏試驗(yàn)經(jīng)鑒定為鏈球菌的血瓊脂平板再次接種至新的血瓊脂板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h后中挑取3～5個(gè)單個(gè)菌落放入CAMHBT肉湯中乳化，經(jīng)0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)管比濁后通過接種儀將菌液接種至革蘭氏陽性菌藥敏板中，置于36 ℃培養(yǎng)24 h后用微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)讀取藥敏結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 分離病原菌的種類及比例

從300份樣品中得到31株G+鏈球菌，其中無乳鏈球菌17株，乳房鏈球菌8株，停乳鏈球菌4株，緩癥鏈球菌1株，β鏈球菌G群1株（見表1）。

表1 鏈球菌種類和對應(yīng)比例

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)藥敏分析系統(tǒng)讀取MIC值，并得到結(jié)果：鏈球菌對卡那霉素、慶大霉素、鏈霉素的耐藥率為100%（31/31）；鏈球菌對泰洛星的耐藥率為96.77%（30/31）；鏈球菌對林可霉素的耐藥率為93.55%（29/31）；鏈球菌對四環(huán)素、紅霉素的耐藥率為90.32%（28/31）；鏈球菌對達(dá)托霉素、利奈唑烷的耐藥率為87.10%（27/31）；鏈球菌對氯霉素的耐藥率為83.87%（26/31）；鏈球菌對替加環(huán)素、萬古霉素、呋喃妥因、奎奴普丁、青霉素的耐藥率為80.65%（25/31）（見表2）。

表2 鏈球菌MIC值

3 討論

抗生素等抗菌藥物在傳染性疾病治療方面有著不可磨滅的功勞，除此之外，種植業(yè)、畜牧業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中傳染病的預(yù)防以及治療也離不開抗生素的使用，然而對抗生素的過度依賴，又把人類置于新的危險(xiǎn)之中[3]。我國的濫用現(xiàn)象較美國更為嚴(yán)重，2013年中國科學(xué)院廣州地球化學(xué)研究所的相關(guān)研究表明：我國抗生素使用量近于世界其他國家的總和，其中48%的抗生素為人類使用，剩余52%用于農(nóng)牧業(yè)，使用總量約占世界用量的一半[4]?？股氐臑E用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的增加，繼而影響牲畜的發(fā)病率、死亡率等，甚至增加了各個(gè)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)成本，尤其是奶牛乳房炎的防治，大量依賴抗生素進(jìn)行治療，增加了細(xì)菌的耐藥性。

本實(shí)驗(yàn)中分離到包括無乳鏈球菌比例最高，達(dá)到了54.84%，其次為停乳鏈球菌，占25.8%。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示：所有分離到的鏈球菌對卡那霉素、慶大霉素、鏈霉素等氨基糖苷類抗生素耐藥性最為突出，達(dá)到了100%；其次為泰洛星、林可霉素、四環(huán)素、紅霉素的耐藥率均超過90%；對達(dá)托霉素、利奈唑烷的、氯霉素、替加環(huán)素、萬古霉素、呋喃妥因、奎奴普丁、青霉素的耐藥率超過80%，耐藥性十分廣泛。因此，為有效治療奶牛乳房炎，防止耐藥性的產(chǎn)生，應(yīng)減少抗生素的使用。同時(shí)，為避免奶牛場產(chǎn)生耐藥菌，需要完善藥物的使用策略來遏制耐藥性，最常用的方法就是通過藥敏試驗(yàn)科學(xué)使用抗生素，一旦發(fā)現(xiàn)氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類、四環(huán)素類等藥物耐藥性較高時(shí)，可以采用聯(lián)合、配伍用藥，也可增加中成藥的使用，減少耐藥性，并進(jìn)一步改善實(shí)驗(yàn)室檢測和耐藥細(xì)菌的流行病學(xué)檢測，避免引起公共衛(wèi)生安全問題。