銅離子介導(dǎo)的石墨烯量子點(diǎn)熒光開-關(guān)高選擇性檢測谷胱甘肽

李欣玉 張 強(qiáng) 王 妮 劉加軍 王 健*

(發(fā)光與實(shí)時(shí)分析系統(tǒng)重慶市市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室1，國家級(jí)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心2， 西南大學(xué)藥學(xué)院， 重慶 400715)

1 引 言

作為一種含有活性巰基的短肽，谷胱甘肽(GSH)參與了體內(nèi)的多種生化反應(yīng)，如可防止體內(nèi)某些含巰基蛋白質(zhì)的氧化，保障體內(nèi)代謝的正常進(jìn)行[1]; GSH的巰基可與體內(nèi)的自由基結(jié)合，防止自由基對(duì)體內(nèi)器官的損傷[2]。另外，癌細(xì)胞中的GSH含量明顯高于正常細(xì)胞，且GSH的耗竭與腫瘤細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系，因此，監(jiān)測細(xì)胞中GSH的含量有利于監(jiān)控人體健康狀況[3]。近年來已開發(fā)出多種檢測GSH的方法，包括熒光法[4]、散射法[5]、比色法[6]、電化學(xué)[7]、高效液相色譜[8]等，但有些方法易受半胱氨酸等巰基化合物的干擾[9]，因此，有必要開發(fā)高靈敏、選擇性的方法，實(shí)現(xiàn)GSH的選擇識(shí)別[10]。

石墨烯量子點(diǎn)(GQDs)的尺寸通常小于10 nm，因制備簡單且具有良好的生物相容性、優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)和較強(qiáng)的成像能力，被認(rèn)為是熒光染料和半導(dǎo)體量子點(diǎn)的理想替代品[11,12]，被廣泛用于生物傳感[13，14]及細(xì)胞成像[15，16]。目前。大部分檢測策略基于GQDs與靶物直接作用，但方法的選擇性差、抗干擾能力不強(qiáng)，因此，需要開發(fā)新的策略，以提高方法的選擇性。其中，熒光信號(hào)開-關(guān)策略是一種有效手段[17]，該方法能夠提高信號(hào)單向變化檢測模式的選擇性。在典型的開-關(guān)策略中，通常需要中間介質(zhì)誘導(dǎo)探針信號(hào)的降低或升高，介質(zhì)結(jié)合目標(biāo)物，誘導(dǎo)信號(hào)恢復(fù)。

本研究利用微波法合成了GQDs，并基于聚集誘導(dǎo)熒光猝滅[18]機(jī)理實(shí)現(xiàn)了GSH的選擇性識(shí)別(圖1)。GQDs表面富含氨基，可與Cu2+配位而拉近GQDs之間的距離，導(dǎo)致GQDs聚集，進(jìn)而發(fā)生熒光猝滅。在GQDs-Cu2+中加入GSH后，由于GSH與Cu2+之間有更強(qiáng)的結(jié)合能力，導(dǎo)致Cu2+從GQDs表面解離，致使GQDs解聚集，從而使熒光恢復(fù)。本方法以Cu2+為開關(guān)，控制了GQDs熒光信號(hào)的猝滅與恢復(fù)，據(jù)此建立了GSH的檢測方法，提高了方法的選擇性，并用于細(xì)胞裂解液中GSH的檢測。

圖1 Cu2+介導(dǎo)的石墨烯量子點(diǎn)熒光開-關(guān)檢測GSH示意圖Fig.1 Illustration of Cu2+-mediated fluorescence switching of graphene quantum dots(GQDs) for highly selective detection of glutathione(GSH)

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

F-2500熒光分光光度計(jì)(日本日立公司); UV-3600紫外-可見分光光度計(jì)、FTIR-8400S傅里葉紅外光譜儀、XRD-7000 X射線衍射儀(日本島津公司); Tecnai G2 F20 S-TWIN高分辨透射電子顯微鏡(HRTEM，美國FEI公司)，加速電壓200 kV; ESCALAB 250 X-射線光電子能譜儀(XPS, 美國賽默飛世爾科技公司); FL-TCSPC熒光光譜儀(法國Horiba Jobin Yvon公司); C11347絕對(duì)量子產(chǎn)率儀器 (日本濱松公司); Synergy H1 多功能酶標(biāo)儀(美國Berton公司); DL-1電子萬用爐(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司); P70D20P-NPCWO微波爐(格蘭氏公司); 離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠); GDH 9070A鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司); 800Y多功能粉碎機(jī)(南陽東億機(jī)械設(shè)備有限公司)。

GSH、半胱氨酸、組氨酸、谷氨酸、賴氨酸等生物分子(Sigma公司); CuSO4(阿拉丁試劑有限公司); HCl、NaOH、NaCl等其它無機(jī)試劑(成都科龍化學(xué)試劑有限公司)。實(shí)驗(yàn)用水為超純水(18.2 MΩ·cm， Mili-Q公司純水儀制備)。銀杏葉采自西南大學(xué)校園。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 石墨烯量子點(diǎn)的合成先將銀杏葉用自來水沖洗干凈，接著用蒸餾水沖洗3遍，放入500 mL燒杯中瀝干水分，在鼓風(fēng)干燥箱中60℃烘干，然后用多功能粉碎機(jī)制成粉末。稱取上述銀杏葉粉末約0.6 g，加入40 mL超純水中并充分?jǐn)嚢?，加熱煮沸，保持微?0 min，之后用0.22 μm濾膜過濾，將濾液繼續(xù)用微波爐中火加熱15 min，使溶液完全蒸干。取出后，加20 mL水，超聲處理200 s， 10000 r/min離心10 min，再次用0.22 μm濾膜過濾。邊攪拌邊逐滴加入0.1 mol/L HCl，調(diào)節(jié)混合液至中性，最后用透析袋(1000 MWCO)透析48 h，將所得GQDs冷凍干燥，于4℃保存，備用。

2.2.2 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)考察在96孔板中的每孔中加入100 μL A549細(xì)胞(1×105cell/mL)，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育(37℃，5% CO2)24 h后，用PBS緩沖液清洗兩次，再分別加入10 μL不同濃度的GQDs (0、10-4、10-3、10-2、0.1、1和10 μg/mL)和90 μL RPMI 1640培養(yǎng)基(添加2%胎牛血清)，繼續(xù)孵育24 h。用PBS緩沖液清洗2次后，再加入10 μL CKK-8溶液和90 μL RPMI 1640培養(yǎng)基(添加2%胎牛血清)，繼續(xù)孵育40 min，用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度值，按公式(1)計(jì)算細(xì)胞存活率(Cell viability, CV)，評(píng)價(jià)GPDs對(duì)細(xì)胞的毒性:

(1)

其中，ODtreated為實(shí)驗(yàn)組的吸光度，ODcontrol為對(duì)照組的吸光度。

2.2.3 GSH的檢測在1.5 mL試管中依次加入50 μL BR緩沖溶液(pH 6.8)、 50 μL GQDs (10 mg/mL)、 50 μL Cu2+(2.5 mmol/L)和不同濃度的GSH溶液，混勻后加水稀釋至0.5 mL，在室溫下靜置20 min，測定GQDs的熒光強(qiáng)度。

2.2.4 細(xì)胞裂解液中GSH的測定細(xì)胞裂解液的制備[19]如下: A549細(xì)胞在RPMI 1640培養(yǎng)基(添加2%胎牛血清)中孵育(37℃，5% CO2) 24 h，用胰酶消化，并用PBS緩沖液洗滌2次，然后重復(fù)冷凍和解凍，確保細(xì)胞完全裂解。為除去細(xì)胞碎片和蛋白質(zhì)，以14000 r/min離心10 min，并用0.22 μm微孔膜過濾，收集濾液，于4℃儲(chǔ)存，備用。將20 μL細(xì)胞裂解液與50 μL BR緩沖溶液(pH 6.8)、 50 μL GQDs (10 mg/mL)、 50 μL Cu2+(2.5 mmol/L)以及50 μL不同濃度的GSH溶液(500、1000和2000 μmol/L)混勻后，加水稀釋至0.5 mL，在室溫下靜置20 min，測定GQDs的熒光強(qiáng)度。

3 結(jié)果與討論

3.1 石墨烯量子點(diǎn)的特征

3.1.1 石墨烯量子點(diǎn)的形貌結(jié)構(gòu)表征利用透射電鏡(TEM)及原子力顯微鏡(AFM)觀察了GQDs的形貌結(jié)構(gòu)(圖2)。TEM照片表明，GQDs呈單顆粒均勻分散，平均粒徑為2.4 nm，其面內(nèi)晶格間距為0.33 nm(圖2A)，對(duì)應(yīng)于石墨碳的(002)平面，說明合成的碳納米材料具有類石墨結(jié)構(gòu)[20]。X光衍射(XRD)譜在27.3°有一個(gè)寬峰，根據(jù)布拉格方程計(jì)算出對(duì)應(yīng)0.33 nm處的晶格間距(圖2B)。AFM結(jié)果(圖2C和2D)表明，GQDs的高度約為1 nm，可推斷出GQDs由3層左右石墨烯層組成[21]。

圖2 GQDs的形貌表征: (A) GQDs的透射電鏡照片，內(nèi)嵌圖為GQDs的晶格和粒徑分布圖; (B) GQDs的X射線衍射譜; (C)和(D)分別為GQDs的原子力顯微鏡照片和高度分布，其中D圖中a～c的高度對(duì)應(yīng)于圖C中標(biāo)記為a～c的GQDsFig.2 Morphological characterization of GQDs: (A) Transmission electron microscope (TEM) image of GQDs. Inset is lattice spacing and size distribution of GQDs; (B) X-ray diffraction (XRD) pattern of GQDs; (C) Atomic force microscope (AFM) image; (D) Height distribution of GQDs, and the heights of a-c in Fig.D corresponding to a-c of GQDs in Fig.C

圖3 GQDs的元素和官能團(tuán)分析: (A) GQDs的X射線光電子能譜(XPS)全譜; (B)C1s譜; (C) N1s 譜; (D) O1s譜Fig.3 Eelemental and functional group analysis of GQDs: (A) X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) full spectrum of GQDs; (B) C1s spectrum; (C) N1s spectrum; (D) O1s spectrum

3.1.2 石墨烯量子點(diǎn)的光譜特征GQDs具有良好的吸收和發(fā)射性能。GQDs在紫外-可見區(qū)具有非常寬的紫外吸收帶，在278 nm處具有肩峰，可歸因于納米碳的π-π*躍遷[16]。熒光光譜表明，GQDs的最大激發(fā)波長為360 nm，最大發(fā)射波長為463 nm，在365 nm紫外光照射下呈現(xiàn)藍(lán)色(圖4A)，量子產(chǎn)率為1.4%，且隨著激發(fā)光譜的改變，GQDs的發(fā)射光譜波長并未發(fā)生改變(圖4B)，說明此GQDs的粒徑或者表面狀態(tài)比較均一[22]。

圖4 (A) GQDs (2.5 μg/mL)的吸收、激發(fā)和發(fā)射光譜，內(nèi)插圖為石墨烯量子點(diǎn)在白光及365 nm紫外燈照射下的照片; (B)不同激發(fā)波長(300～400 nm)對(duì)應(yīng)的發(fā)射光譜Fig.4 (A) Absorption, excitation and emission spectra of GQDs (2.5 μg/mL), inset shows photographs of GQDs irradiated by white light and 365 nm UV lamp; (B)Emission spectra of GQDs at different excitation wavelengths in the range of 300-400 nm

3.1.3 石墨烯量子點(diǎn)的穩(wěn)定性研究一般的碳納米材料具有良好的穩(wěn)定性[12]。研究表明，不同的陰陽離子(除Cu2+外)未引起GQDs熒光強(qiáng)度的明顯變化，說明GQDs具有優(yōu)越的抗離子干擾能力(圖5A和5B)。在較高濃度的NaCl溶液中，GQDs的熒光強(qiáng)度幾乎沒有降低，說明GQDs具有很好的抗鹽能力(圖5C)。同時(shí)，研究了GQDs的抗光漂白能力，發(fā)現(xiàn)GQDs在紫外光照射2 h后仍保持較高的發(fā)光強(qiáng)度(圖5D)，說明GQDs具有較強(qiáng)的光穩(wěn)定性。但是GQDs熒光發(fā)射依賴于環(huán)境的酸度，在酸性條件下，其熒光強(qiáng)度較低; 中性和堿性條件下，其熒光強(qiáng)度較為穩(wěn)定(圖5E)。綜上，此GQDs比較穩(wěn)定，有利于GQDs在復(fù)雜樣品中的進(jìn)一步應(yīng)用。

圖5 濃度均為2 mmol/L的 (A)陰離和(B)陽離子對(duì)GQDs熒光強(qiáng)度的影響; (C)不同濃度的NaCl對(duì)GQDs熒光強(qiáng)度的影響; (D) 365 nm紫外燈的連續(xù)照射對(duì)GQDs熒光強(qiáng)度的影響; (E)不同酸度條件對(duì)GQDs熒光的影響。 GQDs濃度均為2.5 μg/mL; F0為GQDs的熒光信號(hào)，F(xiàn)為加入其它物質(zhì)后GQDs的熒光信號(hào)Fig.5 Fluorescence response of GQDs to (A) various anions and (B) various cations at 2 mmol/L respectively;; (C) The fluorescence response of GQDs to different concentrations of NaCl; (D) Fluorescence response of GQDs fluorescence under 365 nm UV light irradiation; (E) Fluorescence response of GQDs under different acidities. Conditions: cGQDs: 2.5 μg/mL; F0 is the fluorescence intensity of GQDs; F is the fluorescence intensity of GQDs in the presence of the species

3.1.4 石墨烯量子點(diǎn)的生物相容性研究結(jié)果表明，碳納米材料具有較好的生物相容性[12]。為了評(píng)價(jià)GQDs的生物相容性，使用CKK-8法測定A549細(xì)胞存活率。 如圖6所示， 當(dāng)GQDs濃度為1 μg/mL時(shí)， 細(xì)胞存活率大于90%，說明GQDs對(duì)細(xì)胞的毒性較小。

圖6 不同濃度GQDs處理后的A549細(xì)胞存活率Fig.6 Cell viability of A549 cells treated with different concentrations of GQDs

3.2 基于石墨烯量子點(diǎn)的熒光法檢測GSH

3.2.1 條件優(yōu)化考察了酸度、反應(yīng)時(shí)間及Cu2+濃度等因素對(duì)檢測靈敏度的影響。GQDs-Cu2+混合液與GSH反應(yīng)20 min后，GQDs的熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定，說明已反應(yīng)完全(圖7A)。因GQDs的熒光強(qiáng)度依賴于環(huán)境的酸度，故GQDs-Cu2+與GSH的反應(yīng)也依賴于環(huán)境酸度(圖7B)。結(jié)果表明，中性條件下，Cu2+能較大程度地猝滅GQDs的熒光，且GSH與Cu2+結(jié)合后能夠引起熒光信號(hào)的恢復(fù)，而酸性和堿性條件都不利于GQDs與Cu2+之間的配位。一方面，在酸性條件下，GQDs的氨基發(fā)生質(zhì)子化，不利于與Cu2+配位[23]; 另一方面，在堿性條件下，Cu2+容易水解，不利于與GQDs進(jìn)行配位反應(yīng)。酸性和堿性條件都不利于熒光的猝滅，加入GSH后，熒光恢復(fù)程度也不大。故選擇pH 6.8的BR緩沖溶液控制溶液的酸度。

采用熒光恢復(fù)效率(F2/F1)篩選Cu2+的最佳濃度，使其在“關(guān)”態(tài)和“開”態(tài)之間達(dá)到最佳效果。當(dāng)Cu2+的濃度過低時(shí)，會(huì)導(dǎo)致“關(guān)閉”效率低下，加入GSH后，GQDs的熒光信號(hào)恢復(fù)程度較低; 當(dāng)Cu2+濃度過高時(shí)，溶液中有大量游離的Cu2+直接與GSH結(jié)合，不能有效地恢復(fù)熒光，即“開啟”效率較低。當(dāng)Cu2+濃度為250 μmol/L時(shí)，熒光恢復(fù)效率達(dá)到最佳(圖7C)。

圖7 反應(yīng)條件的優(yōu)化: (A)反應(yīng)時(shí)間的影響，1 μg/mL GQDs， pH 6.8; 250 μmol/L Cu2+， 500 μmol/L GSH; (B)酸度的影響， 1 μg/mL GQDs，反應(yīng)時(shí)間 20 min，250 μmol/L Cu2+， 500 μmol/L GSH ; (C) Cu2+濃度的影響， 1 μg/mL GQDs， pH 6.8，反應(yīng)時(shí)間 20 min，500 μmol/L GSH。F1為加入Cu2+后GQDs熒光強(qiáng)度; F2為在GQDs-Cu2+混合液中加入GSH后的熒光強(qiáng)度Fig.7 Optimization of reaction conditions: (A) Effect of reaction time. 1 μg/mL GQDs, pH 6.8, 250 μmol/L Cu2+, 500 μmol/L GSH, (B) Effect of acidity, 1 μg/mL GQDs, reaction time is 20 min, 250 μmol/L Cu2+; 500 μmol/L GSH; (C) Effect of Cu2+concentration, 1 μg/mL GQDs, reaction time is 20 min, pH 6.8, 500 μmol/L GSH. F1 is the fluorescence intensity of GQDs in the presence of Cu2+; F2 is the fluorescence intensity of GQDs-Cu2+ mixture in the presence of GSH

3.2.2 基于GODs檢測GSH的方法的分析性能最佳實(shí)驗(yàn)條件下，在GQDs-Cu2+混合液中加入GSH，GQDs的熒光強(qiáng)度逐漸恢復(fù)(圖8A)。 GSH濃度在 20～500 μmol/L范圍內(nèi)與熒光信號(hào)的恢復(fù)程度(F2/F1)呈良好的線性關(guān)系(圖8B)，檢出限(LOD，3s/k)為3.4 μmol/L，與色度法[6]和電化學(xué)-試紙條法[7]相比，本方法較靈敏，且選擇性好(圖8C)，半胱氨酸(Cys)等物質(zhì)不干擾GSH的檢測。這是因?yàn)樽鳛橐环N嗜硫金屬離子，Cu2+對(duì)巰基化合物具有較強(qiáng)的結(jié)合力[24]; 且GSH的空間結(jié)構(gòu)特殊， 具有巰基、氨基和羧基3個(gè)潛在的配位位點(diǎn)[25]，與Cu2+的結(jié)合常數(shù)最高[26]，因此本方法具有較好的選擇性。

圖8 方法的分析性能和選擇性: (A) GQDs隨GSH濃度變化的熒光光譜; (B)GQDs熒光恢復(fù)程度與GSH濃度的線性關(guān)系, 1 μg/mL GQDs， 250 μmol/L Cu2+，反應(yīng)時(shí)間 20 min，pH 6.8; (C) GQDs檢測GSH的選擇性，1 μg/mL GQDs， 250 μmol/L Cu2+，反應(yīng)時(shí)間 20 min，pH 6.8，氨基酸及GSH的濃度均為300 μmol/L. F1為加入Cu2+后GQDs熒光強(qiáng)度; F2為在GQDs-Cu2+混合液中加入GSH或氨基酸后的熒光強(qiáng)度Fig.8 Performance and selectivity of the proposed method: (A) Fluorescence spectra of GQDs in the presence of different concentrations of GSH; (B) Linear relationship between F2/F1 and the concentration of GSH, 1 μg/mL GQD, pH 6.8, reaction time is 20 min, 250 μmol/L Cu2+; (C) Selectivity of GQDs towards determination of GSH, 1 μg/mL GQDs, pH 6.8, reaction time is 20 min, 250 μmol/L Cu2+, the concentrations of amino acids and GSH are 300 μmol/L respectively. F1 is the fluorescence intensity of GQDs in the presence of Cu2+; F2 is the fluorescence intensity of GQDs-Cu2+ mixture in the presence of GSH or amino acids

3.2.3 細(xì)胞裂解液中GSH的檢測為了驗(yàn)證GQDs-Cu2+混合物檢測GSH的可行性，測定了A549細(xì)胞裂解液中的GSH，并進(jìn)行了加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)(表1)。GSH是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)最豐富的抗氧化劑，且在大多數(shù)細(xì)胞中，超過90%的細(xì)胞內(nèi)硫醇分子是GSH[19]。本研究以A549細(xì)胞為模型細(xì)胞，采用2.2.4節(jié)的方法將細(xì)胞裂解液稀釋20倍， 測定GSH的平均含量為197.8 μmol/L，計(jì)算得A549細(xì)胞裂解液中原始GSH含量為3.96 mmol/L，與細(xì)胞中GSH的正常濃度(0.5～10 mmol/L)[27]相吻合，表明本方法可用于細(xì)胞裂解液中GSH的檢測。細(xì)胞裂解液中GSH的回收率為93.2%～101.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.4%～5.8%，表明所建立的GSH檢測方法具有良好的實(shí)用性。

表1 細(xì)胞裂解液中GSH的檢測結(jié)果

Table 1 Detection results of GSH in cell lysate (n=3)

樣品Sample測得量Found(μmol/L)加入量Spiked(μmol/L)總測得量Total found(μmol/L)回收率Recovery(%)RSD(%, n=3)1190.250.0236.893.25.82198.8100.0295.296.44.43204.5200.0407.5101.55.6

3.3 石墨烯量子點(diǎn)檢測GSH的機(jī)理

由于GSH是一種含有巰基的三肽，作為一種嗜硫金屬離子，Cu2+對(duì)GSH具有較強(qiáng)的結(jié)合力[24]; 而GSH具有特殊的空間結(jié)構(gòu)，具有巰基、氨基和羧基3個(gè)潛在的配位位點(diǎn)[25]，與Cu2+的結(jié)合常數(shù)高[26]，形成更穩(wěn)定的配合物，因此在GQDs-Cu2+復(fù)合物中加入GSH后，Cu2+從GQDs表面競爭下來，使GQDs聚集體發(fā)生解聚，從而導(dǎo)致GQDs熒光恢復(fù)。

圖9 反應(yīng)機(jī)理的研究: (A) Cu2+存在時(shí)GQDs吸收光譜的變化; (B) Cu2+存在時(shí)GQDs的TEM照片; (C) Cu2+存在時(shí)GQDs的紅外光譜的變化; (D) Cu2+存在時(shí)GQDs的熒光壽命的變化Fig.9 Mechanism investigation: (A) Absorption spectral change of GQDs in the presence and absence of Cu2+; (B) TEM image of GQDs in the presence of Cu2+; (C) Infrared spectral change of GQDs; (D) Fluorescence lifetime change of GQDs

4 結(jié) 論

利用微波法合成了表面富含氨基的GQDs，以此GQDs為光學(xué)探針, 以Cu2+為開關(guān)，開發(fā)了GSH的高選擇性檢測方法。表面富含氨基的GQDs與Cu2+發(fā)生配位作用而發(fā)生聚集誘導(dǎo)熒光猝滅，由于GSH與Cu2+結(jié)合能力更強(qiáng)，使Cu2+從GQDs解離，導(dǎo)致GQDs解聚而發(fā)生熒光恢復(fù)。GSH和Cu2+的較強(qiáng)的配位作用及熒光“開-關(guān)”作用賦予本方法優(yōu)異的選擇性，應(yīng)用于細(xì)胞裂解液中GSH的檢測,結(jié)果令人滿意。 本方法可針對(duì)其它目標(biāo)進(jìn)一步推廣，有利于提高方法的選擇性。