神經(jīng)遞質(zhì)檢測方法的研究進(jìn)展

萬金霞 李毓龍*,3,4

1(北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院膜生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京100871) 2(北京大學(xué)麥戈文腦科學(xué)研究所， 北京100871)3(北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心， 北京100871) 4(北京腦科學(xué)與類腦研究中心， 北京100871)

1 引 言

在人類的大腦中存在數(shù)以億計(jì)的神經(jīng)元，后者通過數(shù)萬億的突觸組成復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。不同種類的神經(jīng)元通過近端或遠(yuǎn)程投射控制著一系列重要的生理活動，包括運(yùn)動、感知、意識、情緒、學(xué)習(xí)和記憶等[1]。神經(jīng)元之間的交流主要依賴于化學(xué)突觸，突觸前神經(jīng)元發(fā)放動作電位，位于突觸前膜上電壓依賴型的鈣離子通道打開，并引起鈣離子的內(nèi)流，后者進(jìn)一步導(dǎo)致突觸小泡與突觸前膜融合，并將小泡內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)釋放到突觸間隙，神經(jīng)遞質(zhì)與位于突觸后膜的受體結(jié)合，引起下游神經(jīng)元興奮性的改變，最終實(shí)現(xiàn)神經(jīng)元之間信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)[2]。

神經(jīng)遞質(zhì)的正常釋放對于維持機(jī)體正常的生理功能發(fā)揮著重要作用，同時，神經(jīng)遞質(zhì)的釋放與調(diào)節(jié)出現(xiàn)異常時也與一系列的病理過程相關(guān)，如抑郁癥(Depression)、成癮(Addiction)、帕金森氏癥(Parkinson's disease，PD)和阿爾茲海默癥(Alzheimer's disease，AD)等[3～6]。因此，在分子、細(xì)胞、環(huán)路等層面精確地分析檢測神經(jīng)遞質(zhì)是如何參與并調(diào)節(jié)上述生理和病理過程，能夠更深入地了解疾病的發(fā)病機(jī)制，并為臨床藥物的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。人類的大腦中存在上百種神經(jīng)遞質(zhì)，包括氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)(如谷氨酸 (Glu)、γ-氨基丁酸 (GABA))、單胺類神經(jīng)遞質(zhì)(如多巴胺 (DA)、去甲腎上腺素(NE)、五羥色胺 (5-HT))、膽堿類神經(jīng)遞質(zhì)(如乙酰膽堿(ACh))、多肽類神經(jīng)遞質(zhì)(如阿片肽、催產(chǎn)素)等。其中，大腦主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸以及抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸在突觸前膜釋放后，可快速地與位于突觸后膜的離子型受體結(jié)合，并引起神經(jīng)元興奮性的改變[7]。但對于多巴胺、催產(chǎn)素這類神經(jīng)遞質(zhì)而言，其受體主要是代謝型受體，即GPCR，這類受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相較于離子型受體時程更長、空間更廣[8]。不同種類的神經(jīng)遞質(zhì)釋放模式的復(fù)雜性、時間空間的差異、受體種類以及分布的不同，使得精確檢測神經(jīng)遞質(zhì)釋放的難度大大增加，傳統(tǒng)的電生理檢測方法很難實(shí)現(xiàn)此目標(biāo)[9～11]。近年來，為了實(shí)現(xiàn)對神經(jīng)遞質(zhì)釋放的精確檢測，已開發(fā)了包括生物化學(xué)和電化學(xué)等一系列檢測方法。同時，隨著成像技術(shù)的高速發(fā)展，可遺傳編碼的熒光探針也逐步發(fā)展起來。本文對近年發(fā)展的可檢測神經(jīng)遞質(zhì)釋放的新方法進(jìn)行了評述。

2 神經(jīng)遞質(zhì)的檢測方法

2.1 微透析法

微透析法(Microdialysis)是一種對待測組織損傷相對較小、靈敏度較高的方法，被廣泛用于檢測大腦中的各種生物分子，包括神經(jīng)遞質(zhì)、激素以及其它化學(xué)小分子的分布和動態(tài)變化過程。微透析系統(tǒng)含有一個微透析探頭，探頭前端被半透的中空纖維膜覆蓋，兩端與人工腦脊液(Artificial cerebrospinal fluid， ACSF)的入口管和出口管相連。使用該系統(tǒng)檢測大腦中神經(jīng)遞質(zhì)的動態(tài)變化，首先要將微透析探頭插入待研究的腦區(qū)，并對該系統(tǒng)灌流ACSF， 使其以0.5～2.0 μL/min的速度持續(xù)不斷地通過微透析探頭前端的半透膜，與大腦中的腦脊液進(jìn)行物質(zhì)交換，在此過程中，細(xì)胞外液中的神經(jīng)遞質(zhì)通過被動擴(kuò)散作用穿過半透膜進(jìn)入ACSF，之后回收透析液，利用高效液相色譜(High performance liquid chromatography， HPLC)或氣相色譜(Gas chromatography，GC)將不同的神經(jīng)遞質(zhì)分離出來，通過質(zhì)譜(Mass spectroscopy， MS)分析腦脊液中每種神經(jīng)遞質(zhì)的含量，最終實(shí)現(xiàn)對神經(jīng)遞質(zhì)的檢測[12,13](圖1A)。由于此系統(tǒng)持續(xù)地對微透析探頭灌流ACSF，因此在樣品采集位置很難建立神經(jīng)遞質(zhì)的化學(xué)梯度平衡，導(dǎo)致透析液中的神經(jīng)遞質(zhì)濃度低于采樣位置的實(shí)際濃度。為了提高對采樣位置神經(jīng)遞質(zhì)濃度測量的準(zhǔn)確度，可通過降低ACSF的灌流速度使其盡量建立平衡; 同時，為保證樣品中神經(jīng)遞質(zhì)的含量足夠在后續(xù)系統(tǒng)中被檢測出來，只能在一定程度上降低該系統(tǒng)的采樣頻率，導(dǎo)致該系統(tǒng)的時間分辨率較低。盡管微透析法可在復(fù)雜的神經(jīng)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)對各種神經(jīng)遞質(zhì)相對精確、靈敏、長時程的檢測，但由于其時間分辨率比較低，單次采樣時間通常約10 min，因此很難實(shí)時地檢測大腦中快速變化的神經(jīng)遞質(zhì)[14]。

2.2 電化學(xué)法

除了利用微透析的方法檢測神經(jīng)遞質(zhì)濃度的變化，基于氧化還原反應(yīng)原理的電化學(xué)檢測方法近年也逐步發(fā)展起來。安培法(Amperometry)被用于檢測可被氧化還原的神經(jīng)遞質(zhì)的動態(tài)變化[15]。利用此方法檢測神經(jīng)遞質(zhì)釋放時， 需要將電極放置在被記錄細(xì)胞表面附近，給予電極一個固定的電壓，并保持該電壓高于被檢測神經(jīng)遞質(zhì)的氧化還原電位。當(dāng)神經(jīng)遞質(zhì)從細(xì)胞釋放并擴(kuò)散至電極表面，會被氧化，進(jìn)而發(fā)生電子的轉(zhuǎn)移，通過電極記錄到的電流指示神經(jīng)遞質(zhì)的釋放[16]。最初，由于電極的直徑過大，很難檢測單個細(xì)胞的分泌反應(yīng)，通過改進(jìn)電極的尺寸、材料和記錄方法，使得該方法可檢測神經(jīng)遞質(zhì)從單個突觸小泡的釋放[17]。由于氧化還原反應(yīng)非常迅速，該方法能夠以毫秒級別的時間分辨率檢測神經(jīng)遞質(zhì)的動態(tài)變化。然而，安培法是基于氧化還原的原理開發(fā)的，因此只能用于檢測易于被氧化還原的物質(zhì)，而對于乙酰膽堿等難以被氧化還原的神經(jīng)遞質(zhì)則比較困難。此外，這種檢測方法缺乏特異性，不能區(qū)分不同的神經(jīng)遞質(zhì)，凡是可被特定電位氧化還原的物質(zhì)均能產(chǎn)生電子，并被電極記錄，因此，這種方法通常與HPLC聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)神經(jīng)遞質(zhì)的特異性檢測[18]。目前，此方法已被應(yīng)用于檢測腎上腺嗜鉻細(xì)胞去甲腎上腺素的釋放、肥大細(xì)胞五羥色胺的釋放、活體大鼠伏隔核(Nucleus accumbens， NAc)內(nèi)源多巴胺的釋放[19,20]等。

快速掃描循環(huán)伏安法(Fast scan cyclic voltammetry，F(xiàn)SCV)是基于氧化還原反應(yīng)原理的方法，被廣泛用于檢測可被氧化還原的神經(jīng)遞質(zhì)的釋放[21]。FSCV與Amperometry的區(qū)別在于FSCV給予電極的是呈特定波形并不斷變化的電壓，而不是恒定的電壓，不同的神經(jīng)遞質(zhì)在不同的電壓下發(fā)生氧化還原反應(yīng)，并產(chǎn)生相對應(yīng)的電流，因此，該方法相比于安培法的優(yōu)勢是可在一定程度上區(qū)分不同的神經(jīng)遞質(zhì)，已被廣泛用于小鼠腦片以及活體小鼠研究單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。如Marcinkiewcz等[22]使用該方法在小鼠腦片上記錄到大腦中縫背核(Dorsal raphe nucleus，DRN)五羥色胺能神經(jīng)元釋放的五羥色胺(圖1B); Saylor等[23]也成功地在活動小鼠的海馬(Hippocampus)中記錄到不同發(fā)情周期內(nèi)五羥色胺的釋放。雖然FSCV具有較高的時間分辨率和一定的神經(jīng)遞質(zhì)分子的特異性，但難以實(shí)現(xiàn)對多個區(qū)域的同時檢測。此外，雖然碳纖電極的直徑可達(dá)到微米級別，但是依然難以精確定位到特定突觸，很難實(shí)現(xiàn)亞細(xì)胞特異性檢測。

圖1 (A)利用微透析方法檢測小鼠大腦中神經(jīng)遞質(zhì)釋放的原理示意圖; (B) 利用FSCV在小鼠腦片上檢測五羥色胺的釋放, 左圖是不同電壓下對應(yīng)的五羥色胺氧化電流的偽彩圖，右圖是對應(yīng)電流-電壓曲線圖[22]Fig.1 (A) Schematic diagram of detection of neurotransmitter release in mouse brain in vivo by microdialysis system; (B) Fast scan cyclic voltammetry detection of serotonin release in mouse brain slices with color plot (left) and cyclic voltammograms trace (right)[22]

2.3 熒光成像法

2.3.1 檢測下游報(bào)告基因的Tango-assay隨著熒光共聚焦顯微鏡(Confocal microscopy)、雙光子顯微鏡(Two-photon excitation microscopy)、受激發(fā)射損耗顯微鏡(Stimulated emission depletion microscopy)等新型顯微鏡技術(shù)的發(fā)展，光學(xué)成像方法在各個領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。 應(yīng)用光學(xué)成像的方法解決生物學(xué)問題具有很多優(yōu)勢，如將其與熒光蛋白聯(lián)合使用可觀察特定生物分子在細(xì)胞內(nèi)的定位、基因的表達(dá)、蛋白和蛋白之間的相互作用等過程。在神經(jīng)遞質(zhì)的檢測方面，光學(xué)成像方法因其靈敏性高、對樣品損傷小、可實(shí)時觀測等特點(diǎn)而得到了極快的發(fā)展。

2008年，Barnea等[24]開發(fā)了一種通過兩種融合蛋白之間的相互作用啟動下游報(bào)告基因表達(dá)檢測神經(jīng)遞質(zhì)釋放的方法，并命名為Tango assay。這種檢測方法的原理是將一種細(xì)胞膜定位的受體(如GPCR)與一種轉(zhuǎn)錄因子(如tTA)融合在一起，并在這兩種蛋白之間插入一段可被特異性蛋白酶識別的酶切位點(diǎn)(如煙草花葉病毒TEV蛋白酶識別的酶切位點(diǎn))，同時，將一種在膜受體激活后可與之發(fā)生相互作用的蛋白(如β-arrestin2)與相對應(yīng)的蛋白酶相融合。當(dāng)神經(jīng)遞質(zhì)激活GPCR后，β-arrestin2會被招募到GPCR附近，并與之發(fā)生相互作用，此時TEV蛋白酶會對GPCR與tTA之間的酶切位點(diǎn)進(jìn)行識別與切割，繼而tTA被釋放，并進(jìn)入細(xì)胞核，啟動下游報(bào)告基因熒光素酶的表達(dá)，最終通過熒光素酶催化的熒光反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對神經(jīng)遞質(zhì)的檢測(圖2A)?；诖朔椒ㄩ_發(fā)的Tango-mapping 系統(tǒng)已被成功地用于檢測活體果蠅內(nèi)源多巴胺的釋放及其參與的神經(jīng)環(huán)路[25]。Tango assay具有兩方面的優(yōu)勢: 一方面，基于神經(jīng)遞質(zhì)的內(nèi)源受體開發(fā)，具有較高的分子特異性; 另一方面，通過轉(zhuǎn)錄因子啟動報(bào)告基因的表達(dá)對信號產(chǎn)生放大作用，使得該系統(tǒng)具有較高的靈敏性。由于技術(shù)層面的限制，該檢測系統(tǒng)背景信號較高，信噪比較低，且配體結(jié)合引起下游報(bào)告基因的表達(dá)是不可逆的，不能被特異的受體拮抗劑阻斷，這些因素都限制了該系統(tǒng)在活體動物中的應(yīng)用。

2017年，Lee等[26]對Tango assay進(jìn)行改造，并將新的系統(tǒng)命名為iTango(圖2B)。iTango是一個包含3組件開關(guān)的控制系統(tǒng)，該系統(tǒng)由兩種融合的蛋白質(zhì)組件以及一個帶有四環(huán)素反應(yīng)元件(Tetracycline response element，TRE)的單個報(bào)告基因載體組成。第一個組件是由一個膜神經(jīng)遞質(zhì)受體融合表達(dá)一系列其它的蛋白元件構(gòu)成，包括一個截短的與隱花色素相互作用的元件(Cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix， CIBN)、一個截短的對藍(lán)光敏感的元件(Light-sensitive LOV2 domain of Avena Sativa phototropin 1， AsLOV2)和一個受四環(huán)素調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子tTA相融合，AsLOV2和tTA之間有一個TEV蛋白酶識別位點(diǎn)[27,28]。第二個組件是將β-arrestin2和TEV蛋白酶的N端部分融合; 最后一個組件是將介導(dǎo)光反應(yīng)的植物隱花色素光裂合酶的同源區(qū)域(Photolyase homology region of the CRY2 protein from Arabidopsis thaliana，CRY2PHR)與TEV蛋白酶的C端部分融合。為了降低TEV蛋白酶自發(fā)的酶切活性，該系統(tǒng)用TEV識別位點(diǎn)代替與PAS 序列緊密結(jié)合的藍(lán)光敏感元件的Jα 螺旋的C端。在膜受體被相應(yīng)配體激活的情況下，β-arrestin2被招募與膜受體結(jié)合發(fā)生相互作用，使得TEV蛋白酶的N端靠近受體; 同時給予藍(lán)光照射，CRY2PHR與CIBN也發(fā)生相互作用，使得TEV蛋白酶的C端部分也靠近受體，和N端部分相互靠近， 形成有功能的TEV蛋白酶并切割其識別位點(diǎn)，釋放tTA進(jìn)入細(xì)胞核，與TRE結(jié)合，啟動下游報(bào)告基因的表達(dá)。隨后，該研究組對該系統(tǒng)進(jìn)一步優(yōu)化，將CRY2PHR-CIBN這對光開關(guān)去除，并將新系統(tǒng)命名為iTango2(圖2C)，該系統(tǒng)已被成功用來標(biāo)記以及操縱小鼠大腦中接收多巴胺的神經(jīng)元。相比于最初的Tango assay，iTango2具有背景信號低、信噪比高的優(yōu)點(diǎn)，但由于轉(zhuǎn)錄因子啟動下游報(bào)告基因的表達(dá)需要數(shù)分鐘至數(shù)小時，時間分辨率相對較低，在瞬息萬變的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)里，依然很難檢測到神經(jīng)遞質(zhì)的動態(tài)變化。

圖2 (A)Tango assay通過下游報(bào)告基因檢測配體與受體結(jié)合原理示意圖; 基于iTango assay(B)與iTango2 assay(C)原理構(gòu)建的檢測多巴胺釋放的試驗(yàn)體系示意圖Fig.2 (A) Schematic diagram of detecting binding between ligand and corresponding G protein coupled receptor by Tango assay through downstream reporter gene; Schematic diagram of detecting dopamine release by iTango assay (B) and iTango2 assays (C)

圖3 基于CNiFER原理構(gòu)建的分別可以檢測(A)乙酰膽堿、(B)多巴胺以及(C)去甲腎上腺素的探針原理示意圖Fig.3 Schematic diagram of cell-based neurotransmitter fluorescent engineered reporters strategy for detection of (A) acetylcholine, (B) dopamine and (C) norepinephrine

2.3.2 基于細(xì)胞系構(gòu)建的神經(jīng)遞質(zhì)探針基于細(xì)胞系構(gòu)建的神經(jīng)遞質(zhì)探針M1-CNiFERs(Cell-based neurotransmitter fluorescent engineered reporters)是Nguyen等[29]于2010年為檢測內(nèi)源乙酰膽堿的釋放而開發(fā)的。他們將一個代謝型的乙酰膽堿受體(M1)與基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)原理構(gòu)建的鈣離子探針TN-XXL表達(dá)在人胚胎腎細(xì)胞系HEK293T中，M1與乙酰膽堿結(jié)合會招募下游Gq蛋白，通過三磷酸肌醇(IP3)信號通路引起細(xì)胞中鈣離子濃度的升高，鈣離子探針檢測到鈣離子濃度的變化，并通過改變熒光信號的強(qiáng)度最終反應(yīng)乙酰膽堿濃度的變化(圖3A)。由于此探針是基于內(nèi)源乙酰膽堿受體與乙酰膽堿的結(jié)合引發(fā)下游信號通路的原理構(gòu)建的，因此保留了受體與配體結(jié)合的特異性與親和力，而且通過下游信號通路的放大作用增強(qiáng)了探針的靈敏度。通過將表達(dá)M1-CNiFERs的細(xì)胞系種植在小鼠的大腦皮層，可檢測到電刺激基底核(Nucleus basalis of meynert，NBM)乙酰膽堿能神經(jīng)元遠(yuǎn)程投射到皮層釋放的乙酰膽堿。此外，他們還構(gòu)建了多巴胺探針(D2-CNiFERs)和去甲腎上腺素探針(α1A-CNiFERs)的細(xì)胞系，并成功用于檢測活體小鼠內(nèi)源神經(jīng)遞質(zhì)的釋放[30,31](圖3B和3C)。此方法具有一定的時間和空間分辨率、對神經(jīng)遞質(zhì)具有高度的特異性、靈敏度和親和力，但將外源細(xì)胞系植入動物大腦中存在一定的困難，包括細(xì)胞移植的操作要求較高、受體動物的免疫排斥反應(yīng)等。

2.3.3 化學(xué)遺傳探針SnifitsSnifits探針通過一個熒光蛋白與一個發(fā)色基團(tuán)或者兩個發(fā)色基團(tuán)之間的能量共振轉(zhuǎn)移檢測神經(jīng)遞質(zhì)濃度的變化[32]。Snifits是基于SNAP-tag以及CLIP-tag標(biāo)記的探針，其中SNAP-tag可特異地與活細(xì)胞中的芐基鳥嘌呤(Benzyl guanine，BG)衍生物形成共價(jià)鍵。 這類探針通常包含一個SNAP-tag、一個熒光蛋白或者CLIP-tag、一個可與神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)合的蛋白(Binding protein，BP)、一個合成的可與BP結(jié)合的帶發(fā)色團(tuán)的配體分子(圖4A和4B)。合成的配體通過相應(yīng)的BG衍生物偶聯(lián)到SNAP-tag上，在分子內(nèi)與BP結(jié)合。神經(jīng)遞質(zhì)不存在時，探針處于關(guān)閉的狀態(tài); 神經(jīng)遞質(zhì)出現(xiàn)時，與合成的配體分子競爭，后者從BP上解離下來, 探針切換到開放的狀態(tài)，兩個發(fā)色團(tuán)之間的位置發(fā)生改變，影響二者之間FRET的效率。此方法已被用于開發(fā)γ-氨基丁酸的探針，此探針以一個代謝型的GABAB受體作為BP，與SNAP-tag、CLIP-tag蛋白融合表達(dá)，同時，SNAP-tag和CLIP-tag分別連接一個發(fā)色團(tuán)，作為FRET的供體和配體[33]。除此之外，此方法還被用于開發(fā)谷氨酸和乙酰膽堿的探針，但此類探針尚未用于活體動物中檢測內(nèi)源神經(jīng)遞質(zhì)的釋放[34,35]。 此類探針具有較高的靈敏度和特異性，但需要將外源合成的發(fā)色團(tuán)偶聯(lián)到SNAP-tag，導(dǎo)致較高的背景，限制了其在活體動物體內(nèi)的應(yīng)用。

圖4 (A)帶有熒光蛋白的Snifits類探針和(B)帶有CLIP-tag的Snifits類探針構(gòu)建的原理示意圖Fig.4 Schematic diagram of Snifits sensors with a fluorescent protein (A) and with a CLIP-tag (B)

2.3.4 可遺傳編碼的熒光探針(1)基于細(xì)菌周質(zhì)結(jié)合蛋白(Periplasmic binding protein，PBP)構(gòu)建的可遺傳編碼的神經(jīng)遞質(zhì)熒光探針。目前，已開發(fā)的可遺傳編碼、具有較高時空分辨率、高分子特異性以及高靈敏度檢測神經(jīng)遞質(zhì)釋放的熒光探針主要分為兩類，一類以細(xì)菌PBP為骨架，另一類以GPCR為骨架。細(xì)菌PBP種類繁多，為構(gòu)建神經(jīng)遞質(zhì)探針提供了良好的蛋白骨架。以檢測谷氨酸釋放的熒光探針為例，早期的谷氨酸探針FLIP-E以及改良版的SuperGluSnFR均是基于FRET原理構(gòu)建的，融合了來自細(xì)菌中可與谷氨酸結(jié)合的蛋白ybeJ以及兩個可發(fā)生FRET的熒光蛋白，但此類探針在體使用的信噪比不高[36～38]。后期的谷氨酸探針iGluSnFR依然使用了ybeJ蛋白，但是沒有FRET原理，而是改用經(jīng)過循環(huán)重排并對構(gòu)象變化敏感的綠色熒光蛋白(Circular permutated enhanced green fluorescent protein, cpEGFP)[39](圖5A)。iGluSnFR相較于原來的SuperGluSnFR在信噪比方面有了較大的提升，更適合在體檢測內(nèi)源谷氨酸的釋放，此外，單個熒光蛋白占用的光譜相較于原來兩個熒光蛋白占用的光譜更窄，因此可與其它顏色的探針聯(lián)合使用，更適用于多色成像系統(tǒng)[31,40]。此后，基于單個熒光蛋白以及細(xì)菌PBP骨架構(gòu)建的可遺傳編碼的神經(jīng)遞質(zhì)探針被相繼開發(fā)出來，包括可檢測γ-氨基丁酸的iGABASnFR及可檢測ATP的iATPSnFR[41,42]。來自細(xì)菌的PBP雖可與神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)合，作為探針的骨架蛋白，但并不適用于大規(guī)模神經(jīng)遞質(zhì)探針的開發(fā)。一方面，并非所有的神經(jīng)遞質(zhì)都能找到可與之結(jié)合的PBP，尤其是神經(jīng)肽類; 另一方面，PBP蛋白來自于細(xì)菌，將其表達(dá)在真核細(xì)胞中，容易出現(xiàn)膜定位差、表達(dá)量低等問題。(2)基于G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)構(gòu)建的可遺傳編碼的神經(jīng)遞質(zhì)熒光探針。GPCR是一大類膜蛋白受體的統(tǒng)稱，這類受體具有相對保守的七次跨膜結(jié)構(gòu)，其配體包括氣味分子、神經(jīng)遞質(zhì)、激素、趨化因子等，在真核細(xì)胞中發(fā)揮重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用[43]。已知的大部分神經(jīng)遞質(zhì)都有相應(yīng)的GPCR作為受體，因此，GPCR作為一類可與神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)合的天然內(nèi)源性受體是構(gòu)建可遺傳編碼神經(jīng)遞質(zhì)探針的首選骨架。其優(yōu)勢主要有兩方面: 一方面， GPCR來自于真核細(xì)胞，不存在由原核轉(zhuǎn)移到真核細(xì)胞引起的蛋白表達(dá)及包裝運(yùn)輸方面的問題; 另一方面，GPCR作為神經(jīng)遞質(zhì)本身的內(nèi)源受體，保留了二者之間的高選擇性和親和力?；谝呀馕龅腉PCR晶體結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)生物學(xué)家發(fā)現(xiàn)配體與GPCR結(jié)合后，主要引起后者的第五和第六個跨膜區(qū)構(gòu)象的改變，并且此變化在不同的GPCR中較為保守[44～47]。因此，通過將cpEGFP插入到連接第五和第六個跨膜區(qū)的第三個胞內(nèi)環(huán)(Intracellular Loop 3，ICL3)的位置，配體與GPCR的結(jié)合會引起后者構(gòu)象的改變，而這種變化又引起cpEGFP發(fā)生構(gòu)象的變化，進(jìn)一步影響其發(fā)色團(tuán)周圍的微環(huán)境，最終導(dǎo)致其熒光強(qiáng)度的改變。基于GPCR激活原理構(gòu)建的神經(jīng)遞質(zhì)探針被命名為GRAB(GPCR Activation Based Sensor)探針(圖5B)，如GRABACh、 GRABDA、 GRABNE[48～50]。

圖5 (A)基于PBP蛋白構(gòu)建的可以檢測谷氨酸釋放的熒光探針原理示意圖; (B)基于GPCR激活原理構(gòu)建的GRAB系列探針的原理示意圖Fig.5 (A) Schematic diagram of glutamate sensor based on PBP; (B) Schematic diagram of GPCR Activation Based Sensor, GRAB

以GRABDA為例，該探針將cpEGFP插入到人源多巴胺受體D2，通過對插入位點(diǎn)、連接肽段等一系列條件的優(yōu)化，該探針在培養(yǎng)的HEK293T以及原代培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元中對飽和濃度多巴胺的熒光信號響應(yīng)可達(dá)到90%。通過對D2受體上多巴胺結(jié)合位點(diǎn)的突變，得到了具有不同親和力的多巴胺探針DA1m(EC 50～130 nmol/L)和DA1h(EC 50～10 nmol/L)，用于檢測不同濃度范圍的多巴胺。GRABDA信號的上升動力學(xué)是亞秒級別的，與內(nèi)源GPCR配體結(jié)合的動力學(xué)速度類似，因此，該探針具有相對較好的時間分辨率，適用于檢測內(nèi)源多巴胺的動態(tài)變化。GRABDA還具有較好的分子特異性，對五羥色胺、組胺、乙酰膽堿等神經(jīng)遞質(zhì)沒有響應(yīng)。但是，目前GRABDA對一定濃度的去甲腎上腺素仍有一定的響應(yīng)，這源于去甲腎上腺素和多巴胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)非常類似，二者之間區(qū)別僅為一個羥基。此外，GPCR作為一個重要的內(nèi)源信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，在使用基于GPCR構(gòu)建的探針檢測神經(jīng)遞質(zhì)釋放時，是否會影響細(xì)胞本身的信號通路是一個需要考慮的因素。通過對GPCR兩條主要的下游信號通路的檢測，即G蛋白和β-arrestin介導(dǎo)的信號通路，發(fā)現(xiàn)多巴胺探針的表達(dá)基本不與這兩條信號通路偶聯(lián)，其過量表達(dá)對細(xì)胞正常的生理功能沒有明顯影響[50]。這可能是因?yàn)樵谔结槝?gòu)建的過程中，一方面將D2受體的ICL3截短，另一方面將空間占位的cpEGFP插入到ICL3，影響了下游G蛋白和β-arrestin與胞內(nèi)環(huán)的相互作用，最終導(dǎo)致探針與下游信號通路的去偶聯(lián)。綜上，此探針可在不影響細(xì)胞正常生理功能的情況下檢測內(nèi)源多巴胺的釋放。GRABDA不僅可在急性小鼠腦片檢測由電刺激引起的伏隔核內(nèi)源多巴胺的釋放，而且還通過構(gòu)建轉(zhuǎn)基因果蠅將GRABDA特異地表達(dá)在果蠅蘑菇體(Mushroom body，MB)的單顆多巴胺神經(jīng)元檢測電刺激引發(fā)內(nèi)源多巴胺的釋放。除此之外，GRABDA成功地在活體小鼠中檢測到不同情況下內(nèi)源多巴胺的釋放，包括光遺傳刺激、聯(lián)合型學(xué)習(xí)、性行為等。基于類似的原理，來自UC Devis的Tian課題組基于多巴胺GPCR受體D1開發(fā)了可檢測多巴胺的一系列探針dLight，與D2受體相比，D1受體對多巴胺的親和力較低，但對于多巴胺和去甲腎上腺素的區(qū)分度稍高，因此dLight探針也保留了這些特性[51]。 GRAB以及dLight系列的探針都是可遺傳編碼的，為活體應(yīng)用提供了便利，可通過病毒注射或者構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物的方法將探針表達(dá)在目的區(qū)域，也可通過一系列遺傳學(xué)手段和工具將該探針表達(dá)在特定類型的細(xì)胞中。除此之外，此系列的探針都具有較高的分子特異性、高靈敏度、高信噪比以及時空分辨率，為研究內(nèi)源神經(jīng)遞質(zhì)的釋放提供了強(qiáng)有力的工具。

3 總結(jié)與展望

神經(jīng)遞質(zhì)作為大腦中一類重要的信息傳遞分子，參與了多種生理過程，神經(jīng)遞質(zhì)的釋放與調(diào)節(jié)出現(xiàn)異常時，可引發(fā)多種疾病。因此，精確地檢測生理與病理過程中神經(jīng)遞質(zhì)的釋放與調(diào)控，可更好地理解某些疾病的發(fā)病機(jī)理，并為臨床治療奠定基礎(chǔ)。然而， 神經(jīng)遞質(zhì)釋放模式、時間空間及化學(xué)性質(zhì)的復(fù)雜性，給神經(jīng)遞質(zhì)的研究帶來了重重阻力。首先，神經(jīng)遞質(zhì)的釋放模式可分為緊張型釋放(Tonic release)和相位型釋放 (Phasic release)，通常，緊張型釋放是由神經(jīng)元的自發(fā)性活動引起的，而相位型釋放則與神經(jīng)元動作電位的成簇發(fā)放有關(guān)[11]。其次，某些神經(jīng)遞質(zhì)的結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)比較類似，如單胺類的神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺和去甲腎上腺素，不論是電化學(xué)方法，還是可遺傳編碼的探針，對其區(qū)分度都有限。此外，還存在不同神經(jīng)遞質(zhì)在同一腦區(qū)同時釋放的情況。這些都增加了檢測神經(jīng)遞質(zhì)的難度[52]。

傳統(tǒng)的檢測神經(jīng)遞質(zhì)釋放的方法包括基于生化的微透析法、基于電化學(xué)原理的安培法和快速掃描循環(huán)伏安法存在時空分辨率不夠高、分子特異性比較低等問題; 檢測下游報(bào)告基因的Tango assay存在時間分辨率較低、背景信號較高等問題; 基于細(xì)胞系的CNiFER存在免疫排斥、操作復(fù)雜等問題; 化學(xué)遺傳探針Snifts需要外源加入帶熒光的發(fā)色基團(tuán)， 不適合動物的活體研究。 基于PBP構(gòu)建的可遺傳編碼的神經(jīng)遞質(zhì)熒光探針既保證了探針與神經(jīng)遞質(zhì)之間的分子特異性，又保證了探針與配體之間的親和力，但此方法目前可否廣泛用于神經(jīng)遞質(zhì)探針的構(gòu)建還有待研究，因?yàn)椴糠稚窠?jīng)遞質(zhì)很難在細(xì)菌中找到可與之結(jié)合的蛋白，而原核生物的蛋白在真核生物中的表達(dá)及運(yùn)輸也需要大量的優(yōu)化工作。目前，基于GPCR激活原理已成功構(gòu)建了可檢測乙酰膽堿、多巴胺和去甲腎上腺素的熒光探針，此系列探針表現(xiàn)出了較高的靈敏度、分子特異性和時空分辨率，可在果蠅、斑馬魚和小鼠等多種模式生物的不同行為范式中特異性地檢測相應(yīng)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。同時，基于GPCR構(gòu)建的神經(jīng)遞質(zhì)探針相較于基于PBP構(gòu)建的探針存在以下優(yōu)勢: 大多數(shù)的神經(jīng)遞質(zhì)都有相應(yīng)的GPCR受體，較容易找到探針的骨架蛋白; 根據(jù)解析出來的GPCR晶體結(jié)構(gòu)，其構(gòu)象變化相對保守，因此該原理普適于開發(fā)神經(jīng)遞質(zhì)的探針。此外，通過改變熒光蛋白的顏色，可進(jìn)一步拓寬神經(jīng)遞質(zhì)探針的光譜，開發(fā)紅色、藍(lán)色等不同顏色的探針，用于多色成像研究不同神經(jīng)遞質(zhì)之間的相互調(diào)節(jié)。 隨著各種新型遺傳工具的發(fā)展(如AAV(Adeno-associated virus)病毒和CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)技術(shù))，以及顯微成像技術(shù)的發(fā)展(如大視場顯微鏡和三光子顯微鏡)，可在哺乳動物(包括非人靈長類)中運(yùn)用神經(jīng)遞質(zhì)探針，實(shí)現(xiàn)同時多色大范圍對內(nèi)源神經(jīng)遞質(zhì)釋放的檢測，為研究生理和病理情況下各種神經(jīng)遞質(zhì)的釋放與調(diào)控奠定基礎(chǔ)，使得最終解釋人類大腦的工作機(jī)制成為可能。