小鼠原代肝細(xì)胞糖異生研究模型的建立

李輝龍，萬(wàn)祿明，楊歡，彭雨蒙，王化鵬，韋猛，莫運(yùn)海，徐藝心，魏從文，鐘輝，吳飛翔，4，5

1.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 肝膽外科，廣西 南寧 530021；2.軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京 100071；3.空軍軍醫(yī)大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710032；4.廣西肝癌診療工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530021；5.區(qū)域性高發(fā)腫瘤早期防治研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530021

糖尿病是全球公共衛(wèi)生問(wèn)題，也是全球第七大死亡原因。其特征是機(jī)體長(zhǎng)時(shí)間處于高血糖狀態(tài)，如果不及時(shí)治療，糖尿病會(huì)引起許多并發(fā)癥。嚴(yán)重的長(zhǎng)期并發(fā)癥包括心血管疾病、中風(fēng)、慢性腎臟病、足部潰瘍、神經(jīng)系統(tǒng)損傷和認(rèn)知障礙等[1]。機(jī)體通過(guò)復(fù)雜的激素反饋機(jī)制將血糖控制在狹窄的范圍，這種嚴(yán)格的調(diào)節(jié)稱為葡萄糖穩(wěn)態(tài)[2]。降低血糖的胰島素和升高血糖的胰高血糖素是其中最主要的激素[3]。當(dāng)血糖處于低水平時(shí)，胰腺釋放胰高血糖素（glucagon，GCG），后者通過(guò)促進(jìn)糖原異生和糖原分解來(lái)升高血糖[4]。在短期饑餓中，機(jī)體主要通過(guò)肝臟糖原的分解來(lái)維持血糖平衡；而在長(zhǎng)期禁食期間，隨著糖原儲(chǔ)存的逐漸消耗，糖原分解的貢獻(xiàn)逐漸減少，此時(shí)肝臟中糖異生的貢獻(xiàn)逐漸增加[5]。在GCG介導(dǎo)下，細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）積累并誘導(dǎo)cAMP依賴性蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）激活，進(jìn)而觸發(fā)酶和調(diào)節(jié)蛋白的磷酸化[6]。然而，肝臟糖異生過(guò)程處于異常激活狀態(tài)時(shí)，會(huì)增加肝糖輸出，導(dǎo)致血糖升高，這種長(zhǎng)期的高血糖狀態(tài)可對(duì)機(jī)體組織造成損傷，引起胰島素敏感性降低，進(jìn)一步形成糖尿病[7]。

肝臟是藥物代謝、生物轉(zhuǎn)化和各種生物分子儲(chǔ)存的主要器官[8]。原代肝細(xì)胞是體內(nèi)肝細(xì)胞的良好代表，是在體外研究肝功能的有用工具，如基因表達(dá)的變化、內(nèi)源性物質(zhì)的代謝以及外源性藥物的藥理特性，新分離的肝細(xì)胞比肝臟來(lái)源的細(xì)胞株更能反映正常肝臟在體內(nèi)的功能[9]。原代肝細(xì)胞的分離方法包括非灌流的機(jī)械分離法、胰酶消化法和膠原酶消化法，采用灌流的離體膠原酶灌流法、Seglen兩步灌流法、下腔靜脈逆向膠原酶灌流法和Gerlach五步膠原酶灌流法。迄今，Seglen兩步灌流法是分離大量高活性原代肝細(xì)胞的首選方法。在第一步中，含EGTA的無(wú)鈣灌注液迅速破壞細(xì)胞間連接，第二步用膠原酶破壞支持肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外基質(zhì)[10]。該分離方法是利用動(dòng)物自身的循環(huán)系統(tǒng)通過(guò)肝門靜脈向肝臟灌注的技術(shù)[9]。該方法能夠減少分離過(guò)程中肝細(xì)胞的損傷，尚存在灌流針易掉出導(dǎo)致組織消化不充分、細(xì)胞提純過(guò)程中細(xì)胞死亡等問(wèn)題，仍有待改善實(shí)驗(yàn)技術(shù)，進(jìn)一步提高肝細(xì)胞的活率并維持細(xì)胞形態(tài)。本實(shí)驗(yàn)在Seglen兩步灌流法分離小鼠原代肝細(xì)胞的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步完善實(shí)驗(yàn)技術(shù)，用糖原染色鑒定原代肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞對(duì)胰高血糖素的響應(yīng)，進(jìn)而表現(xiàn)出細(xì)胞糖異生葡萄糖的產(chǎn)出水平變化，關(guān)鍵酶基因的表達(dá)差異以及cAMP-PKA系統(tǒng)的應(yīng)答反應(yīng)，建立小鼠原代肝細(xì)胞糖異生研究模型。

1 材料和方法

1.1 材料

6只8周齡SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠，體重18～22 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)為SCXK2020-0006。小鼠飼養(yǎng)于相對(duì)濕度40%～70%、溫度20～25℃的環(huán)境中，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

Hank′s緩沖鹽溶液和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自Beyotime公司；EGTA購(gòu)自Meilunbio公司；Ⅳ型膠原酶購(gòu)自Biofroxx公司；低糖DMEM和無(wú)糖DMEM購(gòu)自Solarbio公司；DMEM/F-12購(gòu)自Biosharp公司；胎牛血清（FBS）購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；丙酮酸鈉和乳酸鈉購(gòu)自Sigma公司；胰高血糖素購(gòu)自MedChemExpress公司；cAMPS-Rp購(gòu)自Tocris公司；二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自Innochem公司；葡萄糖產(chǎn)出檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司；NucleoZOL購(gòu)自Macherey-Nagel公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑購(gòu)自TransGen Biotech公司；PKA激酶活性檢測(cè)試劑盒和cAMP檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Abcam公司；qRTPCR引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

密閉式靜脈留置針購(gòu)自BD公司（Becton，Dickinson and Company）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀和恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；倒置顯微鏡購(gòu)自Nikon公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)自Tecan公司；低溫高速離心機(jī)購(gòu)自北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器公司；PCR儀購(gòu)自北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司。

1.2 分離小鼠原代肝細(xì)胞

兩步灌流法分離小鼠原代肝細(xì)胞。取8周齡SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠，禁食12 h后用10%水合氯醛麻醉，腹部向上膠帶固定四肢，將小鼠固定于吸水工作臺(tái)墊上，75%乙醇徹底清潔腹部和胸部區(qū)域；用剪刀和直鉗取下腹部切口，剪開(kāi)表皮和肌肉層，暴露肝臟，用平口鑷將腹部臟器向右外側(cè)牽拉，充分暴露并識(shí)別肝門靜脈與下腔靜脈；啟動(dòng)蠕動(dòng)泵，密閉式靜脈留置針前端有液體緩慢流出后，伴隨液體的流出迅速將留置針置入肝門靜脈，用37℃溫浴的前灌流液進(jìn)行灌注，剪斷下腔靜脈釋放灌注壓力，灌注體積為75 mL/只；更換含Ⅳ型膠原酶的低糖DMEM消化液繼續(xù)緩慢灌注，灌注體積為75 mL/只；待肝臟膠原結(jié)構(gòu)充分消化后，快速切取整個(gè)肝臟于含有10 mL DMEM分散液的10 cm培養(yǎng)皿中；更換至生物安全柜中，按照嚴(yán)格的無(wú)菌要求，用無(wú)菌直鑷撕裂肝葉，使肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞充分游離于分散液中，加入10%胎牛血清以保持肝細(xì)胞活力，用10 mL移液管吹打肝細(xì)胞懸浮液后，用70～75 μm過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸浮液于50 mL錐形管中；在蕩平式離心機(jī)中以4℃、50 r/min離心2 min，去除上清并用含10%胎牛血清的低溫DMEM/F-12洗滌液重懸細(xì)胞洗滌，重復(fù)離心洗滌4次去除間質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞碎片；最后一次離心完成后，吸棄上清，即得小鼠原代肝細(xì)胞。

1.3 小鼠原代肝細(xì)胞培養(yǎng)

向獲得的小鼠原代肝細(xì)胞沉淀中加入25～50 mL DMEM培養(yǎng)基（含10% FBS，1%青霉素-鏈霉素）并重懸、混勻細(xì)胞，按密度4.5×108/L平均鋪板于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～8 h使細(xì)胞充分貼壁，吸棄舊培養(yǎng)基，PBS洗滌一次，更換成無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)以充分保持細(xì)胞形態(tài)和活力，細(xì)胞貼壁后，糖原染色鑒定小鼠原代肝細(xì)胞，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)。

1.4 葡萄糖產(chǎn)出檢測(cè)

細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，更換成含10 mmol/L丙酮酸鈉和10 mmol/L乳散鈉的無(wú)糖無(wú)酚紅DMEM培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱孵育4 h后，收集細(xì)胞上清于1.5 mL離心管中，1500 r/min離心3 min，收集上清液，盡量避免吸到管底細(xì)胞碎片沉淀，上清采用葡萄糖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)葡萄糖產(chǎn)出量，并利用相應(yīng)蛋白質(zhì)含量將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。

1.5 蛋白提取

吸棄培養(yǎng)基，用PBS洗滌2次，加入NP40裂解液，反復(fù)吹打細(xì)胞使細(xì)胞全部脫落，收集細(xì)胞懸液于1.5 mL離心管中，置于冰上裂解10 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清液，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

1.6 RNA提取

吸棄培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，在小鼠原代肝細(xì)胞樣品中加入適量NucleoZOL細(xì)胞裂解液，吹打細(xì)胞使之全部脫落，收集裂解液于1.5 mL離心管，放至勻漿機(jī)渦旋振蕩充分裂解細(xì)胞，用異丙醇有機(jī)試劑沉淀核酸，75%乙醇洗滌核酸沉淀，根據(jù)RNA沉淀量多少加入焦碳酸二乙酯（DEPC）水充分溶解，獲得純度及完整性較高的RNA樣本。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

如前所述，用NucleoZOL試劑從細(xì)胞中提取總RNA，用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將1 μg純化的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，利用特異性引物進(jìn)行定量檢測(cè)。結(jié)果采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.8 PKA活性檢測(cè)

吸棄培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，用配制的細(xì)胞裂解液充分裂解細(xì)胞，收集裂解液于1.5 mL離心管中，用PKA活性檢測(cè)試劑盒測(cè)定PKA活性，并利用相應(yīng)蛋白質(zhì)含量將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。

1.9 cAMP含量檢測(cè)

吸棄培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，用配制的細(xì)胞裂解液充分裂解細(xì)胞，收集裂解液于1.5 mL離心管中，用cAMP含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定cAMP活性，并利用相應(yīng)蛋白質(zhì)含量將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用GraphPad軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以x±s表示，采用非配對(duì)樣本的雙尾t檢驗(yàn)和多因素方差分析對(duì)不同組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠原代肝細(xì)胞分離

分離小鼠原代肝細(xì)胞后24 h，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并進(jìn)行糖原染色（圖1）。細(xì)胞貼壁良好，具有典型的肝細(xì)胞形態(tài)，可見(jiàn)雙核，呈多邊形，且細(xì)胞相互接觸，排列成肝索樣結(jié)構(gòu)。

圖1 分離的小鼠原代肝細(xì)胞

2.2 胰高血糖素通過(guò)促進(jìn)小鼠原代肝細(xì)胞糖異生產(chǎn)生葡萄糖

小鼠原代肝細(xì)胞分離后，細(xì)胞存活率高，形態(tài)完整，可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。為檢測(cè)小鼠原代肝細(xì)胞是否具有糖異生能力，并優(yōu)化糖異生研究模型，我們將培養(yǎng)24 h的細(xì)胞分成DMSO對(duì)照組和GCG實(shí)驗(yàn)組。結(jié)果顯示，與DMSO對(duì)照組相比，GCG實(shí)驗(yàn)組0 h糖異生葡萄糖產(chǎn)出量無(wú)明顯變化，GCG作用1、2、4和8 h細(xì)胞糖異生葡萄糖產(chǎn)出量顯著增加（P＜0.001，圖2A）。同時(shí)檢測(cè)了不同濃度GCG作用4 h后小鼠原代肝細(xì)胞糖異生葡萄糖的產(chǎn)出量，結(jié)果顯示，與DMSO對(duì)照組相比，100、250、500、1000和2000 nmol/L GCG作用下，細(xì)胞糖異生葡萄糖產(chǎn)出量顯著增加（P＜0.001，圖2B），GCG濃度為0～1000 nmol/L時(shí)葡萄糖產(chǎn)出量呈劑量依賴性，GCG濃度高于1000 nmol/L后葡萄糖產(chǎn)出量達(dá)到平臺(tái)期。

圖2 GCG作用下小鼠原代肝細(xì)胞葡萄糖產(chǎn)出水平

2.3 胰高血糖素上調(diào)小鼠原代肝細(xì)胞糖異生關(guān)鍵酶基因表達(dá)

GCG能夠促進(jìn)小鼠原代肝細(xì)胞糖異生產(chǎn)生葡萄糖，并呈時(shí)間依賴和劑量依賴。為了進(jìn)一步研究GCG如何促進(jìn)小鼠原代肝細(xì)胞糖異生產(chǎn)生葡萄糖，我們檢測(cè)了在GCG作用下細(xì)胞糖異生關(guān)鍵酶基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，GCG作用后小鼠原代肝細(xì)胞的Pcx、Fbp1、Pck1和G6pc等糖異生關(guān)鍵酶基因mRNA表達(dá)量顯著增加（P＜0.001，圖3A）。同時(shí)檢測(cè)了細(xì)胞糖酵解關(guān)鍵酶基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，GCG作用后小鼠原代肝細(xì)胞的Hk2、Pkm和Pfkl等糖酵解關(guān)鍵酶基因mRNA表達(dá)量下降（P＜0.001，圖3B）。最后，我們還檢測(cè)了糖原分解和糖原合成關(guān)鍵酶基因的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，GCG作用后小鼠原代肝細(xì)胞糖原分解關(guān)鍵酶基因Pygl的mRNA表達(dá)量顯著增加（P＜0.001，圖3C），而糖原合成關(guān)鍵酶基因Gys2的mRNA表達(dá)量顯著下降（P＜0.001，圖3D）。

圖3 GCG作用下小鼠原代肝細(xì)胞糖代謝關(guān)鍵酶基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.4 胰高血糖素上調(diào)小鼠原代肝細(xì)胞cAMP水平

GCG上調(diào)小鼠原代肝細(xì)胞糖異生關(guān)鍵酶基因Pcx、Fbp1、Pck1和G6pc的mRNA表達(dá)，基因表達(dá)受上游信號(hào)分子調(diào)控，其中cAMP發(fā)揮關(guān)鍵作用。為了進(jìn)一步研究GCG促進(jìn)細(xì)胞糖異生的作用機(jī)制，我們檢測(cè)了在GCG作用下細(xì)胞cAMP的水平，結(jié)果顯示，與DMSO對(duì)照組相比，GCG實(shí)驗(yàn)組小鼠原代肝細(xì)胞cAMP水平顯著上升（P＜0.001，圖4A）。同時(shí)檢測(cè)了添加cAMP抑制劑后GCG作用的細(xì)胞葡萄糖產(chǎn)出水平，實(shí)驗(yàn)分為DMSO、GCG、GCG和cAMPS-Rp等3組。與GCG組相比，同時(shí)加GCG和cAMP-Rp組葡萄糖水平顯著下降（P＜0.001，圖4B），與加DMSO對(duì)照組葡萄糖水平相近，表明GCG通過(guò)cAMP信號(hào)通路促進(jìn)小鼠原代肝細(xì)胞糖異生。我們還檢測(cè)了GCG作用下小鼠原代肝細(xì)胞PKA活性，結(jié)果表明，與DMSO對(duì)照組相比，GCG組小鼠原代肝細(xì)胞PKA活性顯著提高（P＞0.001，圖4C）。

圖4 GCG作用下小鼠原代肝細(xì)胞cAMP和PKA活性

3 討論

哺乳動(dòng)物禁食期間，糖異生過(guò)程被激活產(chǎn)出葡萄糖以維持機(jī)體血糖穩(wěn)定在狹窄的范圍內(nèi)，其中腎臟的貢獻(xiàn)值為10%，而肝臟的貢獻(xiàn)值達(dá)到90%[11]。GCG與位于細(xì)胞質(zhì)膜上的GCG受體（一種G蛋白偶聯(lián)受體）結(jié)合，受體的構(gòu)象變化激活了G蛋白，G蛋白是具有α、β和γ亞基的異源三聚體蛋白[12]。當(dāng)GCG與受體的G蛋白相互作用時(shí)，導(dǎo)致該異源三聚體蛋白從β和γ亞基釋放α亞基，α亞基特異性激活級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的下一個(gè)酶——腺苷酸環(huán)化酶[13]，該酶產(chǎn)生cAMP，可激活cAMP依賴性PKA[14]。GCG通過(guò)PKA活化調(diào)節(jié)肝糖異生，在急性環(huán)境中，通過(guò)促進(jìn)PKA磷酸化來(lái)刺激肝糖異生關(guān)鍵酶Pcx、Pck1、Fbp1和G6pc的基因表達(dá)，并激活這些糖異生過(guò)程中的關(guān)鍵酶系[15]，進(jìn)而使血糖穩(wěn)定在正常范圍內(nèi)，維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)平衡。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)若要獲得活率高形態(tài)好的小鼠原代肝細(xì)胞，在灌流階段必須充分消化肝組織支持結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)初期，我們時(shí)常面臨灌流針從門靜脈掉出或者刺穿門靜脈，導(dǎo)致灌流不充分并影響膠原酶消化肝組織支持結(jié)構(gòu)。為了克服這個(gè)技術(shù)難題，我們使用留置針代替普通灌流針，避免了灌流針從門靜脈掉出，能夠使肝細(xì)胞支持結(jié)構(gòu)充分消化。在小鼠原代肝細(xì)胞分離過(guò)程中，充分消化肝組織支持結(jié)構(gòu)方能獲得高活率的原代細(xì)胞，多次提取原代細(xì)胞的經(jīng)驗(yàn)表明，灌流75 mL膠原酶液能夠使肝組織支持結(jié)構(gòu)充分消化，肝臟顏色變黃，組織徹底軟化，在肝下葉看到小的清亮透明的部分并可能出現(xiàn)濕透的條紋布樣紋理。當(dāng)灌流膠原酶充分消化肝組織彈性纖維結(jié)構(gòu)，分散液中可不加膠原酶消化液，對(duì)肝細(xì)胞活率并無(wú)明顯影響。我們發(fā)現(xiàn)小鼠原代肝細(xì)胞分離洗滌過(guò)程中，與單純洗滌液相比，在洗滌液中加入10%的胎牛血清可以更大程度滿足細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需求，進(jìn)一步維持細(xì)胞活性和細(xì)胞形態(tài)，分離后的原代肝細(xì)胞存活率達(dá)95%以上，細(xì)胞能夠良好貼壁，貼壁后具有典型的肝細(xì)胞形態(tài)。研究表明，含有血清的培養(yǎng)條件更有利于細(xì)胞貼壁，細(xì)胞貼壁后我們比較了有無(wú)血清的培養(yǎng)條件下的細(xì)胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)無(wú)血清的培養(yǎng)環(huán)境更有利于維持小鼠原代肝細(xì)胞的形態(tài)和活性。

我們比較了小鼠原代肝細(xì)胞在有無(wú)GCG作用下的糖異生水平，發(fā)現(xiàn)小鼠原代肝細(xì)胞狀態(tài)良好，能夠?qū)CG做出有效響應(yīng)。與DMSO對(duì)照組相比，在GCG作用下，細(xì)胞糖異生葡萄糖產(chǎn)出水平上升。此外，我們檢測(cè)了糖代謝相關(guān)的關(guān)鍵酶系的mRNA相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果表明，在GCG作用下，糖異生關(guān)鍵酶系基因的表達(dá)顯著上升，糖酵解關(guān)鍵酶系基因的表達(dá)下降。進(jìn)一步探究原代肝細(xì)胞對(duì)糖異生信號(hào)級(jí)聯(lián)通路的應(yīng)答情況，發(fā)現(xiàn)GCG作用下細(xì)胞cAMP含量顯著增加，而在GCG處理的細(xì)胞中加入cAMP抑制劑，GCG上調(diào)葡萄糖產(chǎn)出水平的現(xiàn)象消失。為進(jìn)一步觀察細(xì)胞對(duì)糖異生信號(hào)級(jí)聯(lián)通路的響應(yīng)，我們還檢測(cè)了細(xì)胞的PKA活性，結(jié)果表明GCG刺激的細(xì)胞PKA活性顯著上調(diào)。糖代謝是機(jī)體為維持血糖穩(wěn)定做出的各種調(diào)節(jié)和代償性反應(yīng)，由各器官協(xié)同應(yīng)答，共同參與對(duì)機(jī)體血糖波動(dòng)的調(diào)節(jié)。小鼠原代肝細(xì)胞能夠在葡萄糖產(chǎn)出水平及信號(hào)級(jí)聯(lián)通路水平在體外有效模擬哺乳動(dòng)物肝臟的糖異生代謝，可用于分子機(jī)制研究以及藥物代謝評(píng)價(jià)研究。