HPLC測定當歸芍藥散中的芍藥苷和芍藥內酯苷的含量*

付 新 ，張洪財 ，張 賀 ，劉 陽 ，王 宇

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學 藥學院,黑龍江 哈爾濱 150040；2.哈爾濱師范大學 教育學院,黑龍江 哈爾濱 150025）

當歸芍藥散為傳統(tǒng)經典方劑，以往多應用于治療婦科疾病。當歸芍藥散為經典古方，最早記載于《金匱要略》中，常用于治療婦科疾病。當歸芍藥散以芍藥、川芎、當歸三味血藥，補肝體助肝用；白術、澤瀉、茯苓三味水藥，健脾土防傳變，組方嚴謹，選藥精當，仲景的肝脾同調思想在此方中展現(xiàn)得淋漓盡致，為其調和肝脾的代表方。當歸芍藥散具有保護神經損傷、增強免疫力、促進神經遞質合成和釋放、調節(jié)激素、改善學習記憶功能等作用[1-3]。最新研究發(fā)現(xiàn)當歸芍藥散活性成分是通過多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點，在神經退行性這種多因素、多病理靶點的復雜性疾病治療中顯示了獨特療效[4]。

芍藥苷和芍藥內酯苷是當歸芍藥散的主要成分，具有抗炎、肌肉松弛、鎮(zhèn)痛和解痙等作用[5,6]。本研究以芍藥苷和芍藥內酯苷為指標成分，采用高效液相色譜法（HPLC）測定其中芍藥苷和芍藥內酯苷的含量。

1 實驗部分

1.1 儀器與試藥

Waters高效液相色譜系統(tǒng)，2695-2998型UV檢測器；AB145S型電子天平（上海精密儀器儀表有限公司）；KH3200DB型臺式數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

芍藥苷和芍藥內酯苷對照品（批號分別為110736-201438和110715-201318，純度依次為98.4%，99.3%）購自中國食品藥品檢定研究院；芍藥、當歸、川芎、白術、茯苓、澤瀉藥材購于哈爾濱同仁堂藥店（亳州張仲景中藥飲片有限責任公司）；甲醇（色譜純，迪馬科技有限公司）；H3PO4（秦皇島華瀛磷酸有限公司）；水為娃哈哈純凈水（杭州哇哈哈集團有限公司）。

1.2 色譜條件

色譜柱為COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ柱（4.6×250mm，5μm）；流動相：0.1%H3PO4溶液-甲醇（體積比 86∶14）；檢測波長為 230nm；柱溫為 30℃；流速為 1mL·min-1。

1.3 溶液的制備

1.3.1 對照品溶液制備 分別精密稱取的芍藥苷對照品，5.10mg芍藥內酯苷對照品，置于容積為25mL容量瓶中，用甲醇進行配置，采用超聲溶解，放冷后至室溫后，用甲醇定容，即得到單一成分對照品儲備液，保存于4℃冰箱。臨用時，分別精密量取兩種儲備液，量定5mL置50mL容量瓶中，得到芍藥苷和芍藥內酯苷的對照品混合溶液，濃度分別為芍藥苷 36.2μg·mL-1，芍藥內酯苷 20.4μg·mL-1。

1.3.2 供試品溶液 根據《金匱要略》的記載為參考，分別稱取當白芍 30g、當歸9g、茯苓 12g、澤瀉12g、川芎15g、白術15g，放入粉碎機中粉碎成細粉，再過80目篩，混勻，得到當歸芍藥散。精密稱取當歸芍藥散粉末0.2g，置于100mL容量瓶中，用甲醇定容，采用超聲溶解，濾過，再經過0.22μm微孔濾膜過濾，得到供試品溶液。

1.3.3 陰性樣品溶液的配制 按處方制備不含芍藥的當歸芍藥散浸膏粉各10g，取適量供試品并按“1.3.2”項下制備方法制備陰性對照溶液。

2 結果與討論

2.1 專屬性考察

參考相關文獻[7-11]，經過色譜條件的摸索與優(yōu)化，采用 0.2%H3PO4溶液-甲醇（體積比 50∶50）等度洗脫的方法。按照1.2項下色譜條件，取供試品溶液和陰性樣品溶液進樣分析，通過供試品溶液色譜圖分析發(fā)現(xiàn)，在230nm條件下，對照品溶液芍藥苷和對照品芍藥內酯苷具有保留時間一致的特征峰，所測樣品的色譜峰之間以及和雜質色譜峰分離良好，保留時間分別為13.37和10.86min，而陰性樣品無此特征峰，由此可見，供試品中其它藥物組分對所測組分并無干擾，如圖1所示。

圖1 HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram

2.2 線性關系考察

精密吸取 1.0、2.0、4.0、6.0 和 8.0mL 芍藥苷和芍藥內酯苷對照品溶液，置于10mL容量瓶中，用甲醇定容。定容后制備溶液中含芍藥苷7.24、14.48、21.72、28.96、36.20μg·mL-1和含芍藥內酯苷 4.08、8.16、12.24、16.32、20.40μg·mL-1的標準系列溶液。以峰面積比值為Y，以濃度為X，得到芍藥苷和芍藥內酯苷的回歸方程和相關系數(shù)，其回歸方程分別為Y=1.7826X-0.4794，相關系數(shù) r=0.9992。Y=1.2368X+0.0304，相關系數(shù) r=0.9998。

2.3 精密度考察

取相同的供試品溶液，按2.1項下色譜條件，連續(xù)重復進樣5次，測得芍藥苷、芍藥內酯苷峰面積的相對標準偏差分別為1.63%，1.48%，表明儀器精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性考察

取同一新鮮配制好的樣品溶液，在 0，2，4，6，8h各進樣10μL，測得芍藥苷、芍藥內酯苷峰面積的相對標準偏差分別為1.43%，1.85%，表明芍藥苷、芍藥內酯苷在8h內基本穩(wěn)定。

2.5 重復性考察

取同一供試品6份，按1.3.2項下方法分別制備6份供試品，分別測得芍藥苷和芍藥內酯苷為4.05，0.77mg·g-1，峰面積的相對標準偏差為 1.67%，1.74%，表明方法重復性良好。

2.6 加樣回收率試驗

取同一批號當歸芍藥散樣品6份，每份精密稱定0.5g，分別加入芍藥苷對照品儲備液（362.0μg·mL-1）1.5mL，芍藥內酯苷對照品儲備液（204.0μg·mL-1）4mL，按1.3.2項下方法，分別制備樣品溶液。用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，按1.2項中色譜條件，測得各被測成分的平均回收率，見表1。

表1 當歸芍藥散中芍藥苷和芍藥內酯苷樣回收率（n=6）Tab.1 Recovery of Peoniflorin and Albiflorin in Dangguishaoyao-san（n=6）

2.7 樣品含量測定

平行不同批號的當歸芍藥散樣品3份，分別按1.3.2項下方法分別制成供試品溶液。取20μL注入高效液相色譜儀測定含量，記錄峰面積，分別計算樣品中芍藥苷和芍藥內酯苷的含量。見表2。

表2 當歸芍藥散中芍藥苷和芍藥內酯苷的含量測定結果Tab.2 Content of Peoniflorin and Albiflorin in Dangguishaoyao-san

3 結論

當歸芍藥散化學成分復雜，本實驗采用高效液相色譜法同時測定當歸芍藥散中代表性成分芍藥苷和芍藥內酯苷的含量，測定方法均比較成熟。并應用該方法測定了3批當歸芍藥散中上述2種活性成分的含量。結果表明，本法簡便，準確可靠，專屬性強，穩(wěn)定性好，重復性好，可用于當歸芍藥散質量控制，從而保障了當歸芍藥散的臨床療效。