Box-Behnken響應(yīng)曲面法優(yōu)化藥對(duì)生-炒酸棗仁中總黃酮及總皂苷的提取工藝*

王艷艷，汪郁琦，閆金銘，黃莉莉，李廷利

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040）

酸棗仁為鼠李科植物酸棗Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou的干燥成熟種子，味甘、酸，性平[1]，具有補(bǔ)肝，寧心，斂汗，生津等功效，用于虛煩不眠，驚悸多夢(mèng)，體虛多汗，津傷口渴等癥，主要用于治療神經(jīng)衰弱和各種失眠癥[2,3]。自酸棗仁出現(xiàn)生、炒品，即有生熟異治之說(shuō)，《本草綱目》中有“酸棗仁，睡多生使，不得睡炒熟”，“熟用療膽虛不得眠、煩渴、虛汗之證；生品，療膽熱好眠”的記載[4]。著名老中醫(yī)施今墨先生將生酸棗仁與炒酸棗仁作為藥對(duì)，二者配伍使用，其認(rèn)為“熟棗仁補(bǔ)肝寧心安神，生棗仁清肝寧心安神。二藥參合，一補(bǔ)一清，清補(bǔ)合法，寧心安神的力量增強(qiáng)”[5-7]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，藥對(duì)生-炒酸棗仁具有明顯的抗抑郁作用，且優(yōu)于生、炒酸棗仁單用；生、炒酸棗仁配伍后化學(xué)成分未出現(xiàn)顯著變化，而斯皮諾素含量和酸棗仁皂苷A含量增加[8]。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)單因素試驗(yàn)與響應(yīng)面分析法優(yōu)化藥對(duì)生-炒酸棗仁中總黃酮及總皂苷的乙醇回流提取工藝，為其藥理作用及臨床應(yīng)用研究提供參考。

1 儀器與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

SP-1920型比例雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）；EYEL4型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀N-1100S（上海愛(ài)郎儀器有限公司）；光明電熱恒溫水溫箱（北京市永光明醫(yī)療器械有限公司），BJ-800A型拜杰多功能粉碎機(jī)（拜杰儀器有限公司）；MS105型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

生酸棗仁藥材，購(gòu)于河北省保定市安國(guó)藥材市場(chǎng)，經(jīng)鑒定為鼠李科植物酸棗Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa的干燥成熟種子；炒棗仁藥材，取凈酸棗仁，照清炒法（通則0213）炒至鼓起，色微變深[3]；蘆丁、酸棗仁皂苷B（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：MUST-15020412，純度：HPLC≥97.81%）；甲醇為色譜純，香草醛、高氯酸、冰乙酸、石油醚、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁、無(wú)水乙醇均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定

2.1.1 生、炒酸棗仁藥對(duì)總皂苷制備方法 取生、炒酸棗仁粉末(過(guò)40目篩)適量，精密稱(chēng)定，混勻（質(zhì)量比1∶1），脫脂，分別加入不同體積，不同濃度的乙醇溶液，加熱回流2次，濾過(guò)，濾渣用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇洗滌，合并洗液與濾液，回收溶劑至干，70%甲醇溶解，于10mL容量瓶中定容，0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，備用。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.1.2.1 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線 稱(chēng)取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品約10mg，精密稱(chēng)定11.7mg于10mL容量瓶中，精密移取 0.5、1、1.5、2、2.5、3mL 于 10mL 容量瓶中，依次加入 5%NaNO20.6mL，搖勻，放置 6min，10%硝酸鋁溶液 0.4mL，搖勻，放置 6min，4%NaOH溶液4.0mL，搖勻，用無(wú)水乙醇定容，搖勻，放置15min，雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上于200～700nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，測(cè)得最大吸收波長(zhǎng)為510nm。以質(zhì)量濃度（C,mg·mL-1）對(duì)吸光度 A進(jìn)行線性回歸，回歸方程A=7.1543C+0.0309，R2=0.9987。結(jié)果顯示總黃酮在58.5～351μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.2.2 總皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線 稱(chēng)取酸棗仁皂苷B約4mg，精密稱(chēng)定為4.17mg于10mL的容量瓶中，用甲醇定容，搖勻；分別精密移取120、220、280、360、440、520μL于10mL具塞試管中，依次加入5%香草醛冰醋酸溶液0.2mL，HClO40.8mL，搖勻，密封，置60℃水浴中加熱15min，立即置冰水浴中冷卻2min，精密加入HAc 5.0mL，搖勻。雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上于200～700nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，測(cè)得最大吸收波長(zhǎng)為480nm。以酸棗仁皂苷B質(zhì)量（x，mg）對(duì)吸光度值y進(jìn)行線性回歸，計(jì)算得到回歸方程y=3.6132x+0.0732，R2為0.9991，結(jié)果表明總皂苷在50.0～217μg質(zhì)量范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.1.3 精密度實(shí)驗(yàn) 按照2.1.1項(xiàng)下制備樣品溶液，按2.1.2項(xiàng)下顯色。分別測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定6次，測(cè)得總黃酮、總皂苷的吸光度平均值為0.657、0.525，RSD為0.304%、1.59%，結(jié)果表明，所用儀器精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 分別在 0、3、6、12、24、48h 測(cè)定 總 黃 酮 的 吸 光 度 ， 在 0、10、30、60、120、150、180min測(cè)定總皂苷的吸光度，其吸光度平均值分別為 0.664、0.511，RSD 為 1.01%、1.53%，結(jié)果表明，待測(cè)樣品在考察時(shí)間范圍內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一藥材，制備6份樣品溶液，測(cè)定總黃酮和總皂苷吸光度平均值分別為0.651、0.543，RSD 為 1.61%、1.25%。表明該法具有良好的重復(fù)性。

2.1.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知含量的6份樣品，分別加蘆丁、酸棗仁皂苷B對(duì)照品適量，按2.1.1項(xiàng)和2.1.2項(xiàng)下方法操作，平均回收率分別為97.5%、101%，RSD分別為1.43%、3.04%。

表1 總黃酮加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of total flavonoids recovery test

表2 總皂苷加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Total saponin sample recovery experiment results

2.1.7 藥對(duì)中總黃酮及總皂苷含量測(cè)定 分別稱(chēng)定脫脂后的生酸棗仁、炒酸棗仁、生-炒酸棗仁約1.4g，精密稱(chēng)定，按2.1.1項(xiàng)下，在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、液固比 20mL·g-1、提取溫度 80℃，提取時(shí)間60min條件下測(cè)定總皂苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 總黃酮及總皂苷含量測(cè)定結(jié)果Tab.3 Results of determination of total flavonoids and total saponins

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

按2.1.1項(xiàng)下方法，其他因素不變的情況下，分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比、提取溫度、提取時(shí)間對(duì)藥對(duì)生-炒酸棗仁中總黃酮及總皂苷得率的影響，篩選出各因素的最適條件。

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù) 液固比20mL·g-1、提取溫度80℃、提取時(shí)間為60min時(shí)，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%、70%、80%、90%時(shí)藥對(duì)中總黃酮及總皂苷的得率，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)藥對(duì)中總黃酮及總皂苷得率的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on the yield of total flavonoids and total saponins of Herb-partners

由圖1可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，總皂苷得率增加，70%時(shí)達(dá)到最大值。同時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)總黃酮得率最高，因此，確定最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

2.2.2 液固比 乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取溫度80℃、提取時(shí)間60min時(shí)，考察液固比分別為10、15、20、25、30mL·g-1時(shí)，藥對(duì)中總黃酮及總皂苷的得率，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 液固比對(duì)藥對(duì)中總黃酮及總皂苷得率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on the yield of total flavonoids and total saponins of Herb-partners

由圖2可知，與總黃酮得率比較，總皂苷得率隨著液固比增加趨勢(shì)顯著，二者均在20mL·g-1的比率時(shí)得率達(dá)到最大值。因此，確定適宜液固比為20mL·g-1。

2.2.3 提取溫度 乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、液固比20mL·g-1、提取時(shí)間60min時(shí)，考察不同提取溫度（60、70、80、90、100℃）對(duì)藥對(duì)中總黃酮及總皂苷得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 提取溫度對(duì)藥對(duì)中總黃酮及總皂苷得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the yield of total flavonoids and total saponins of Herb-partners

由圖3可知，溫度在80℃以下，總皂苷和總黃酮得率隨溫度升高而增大，80℃時(shí)達(dá)到最大值，當(dāng)提取溫度超過(guò)80℃后二者得率均下降，從而確定適宜提取溫度為80℃。

2.2.4 提取時(shí)間 乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、液固比20mL·g-1、提取溫度 80℃時(shí)，考察不同提取時(shí)間（20、40、60、80、100min） 對(duì)藥對(duì)中總黃酮及總皂苷得率的影響，見(jiàn)圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)藥對(duì)中總黃酮及總皂苷得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the yield of total flavonoids and total saponins of Herb-partners

由圖4可知，總皂苷和總黃酮得率提取時(shí)間隨時(shí)間的增加而增大，60min時(shí)二者得率均達(dá)到最高，故確定適宜提取時(shí)間為60min。

2.3 響應(yīng)曲面試驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 分別以總皂苷和總黃酮得率為考察指標(biāo)，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在各因素最大得率附近進(jìn)行方差分析。乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比、提取溫度、提取時(shí)間4個(gè)因素，黃酮得率方差分別為：0.0466、0.0735、0.0345、0.0180，皂苷得率方差分別為：0.307、0.233、0.198、0.176。鑒于黃酮得率方差極小，故本實(shí)驗(yàn)選取皂苷得率為響應(yīng)指標(biāo)設(shè)計(jì)響應(yīng)曲面試驗(yàn)，在提取工藝的4個(gè)因素中選擇方差較大的3個(gè)因素進(jìn)行考察，故本實(shí)驗(yàn)選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比、提取溫度3個(gè)因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

應(yīng)用軟件 Design-Expert 8.0.6進(jìn)行3因素 3水平Box-Behnken響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各因素及水平，見(jiàn)表4。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及相應(yīng)Box-Behnken Design數(shù)據(jù)見(jiàn)表5。

表4 響應(yīng)曲面因素與水平Tab.4 Variables and levels in response surface design

表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)值Tab.5 Box-Behnken design and observed responses

2.3.2 回歸方程與方差分析 以軟件Design-Expert 8.0.6分析，總皂苷得率（Y）與乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、液固比（B）、提取溫度（C）的二元多項(xiàng)回歸方程為Y=6.30-0.085A-0.047B+0.08 9C+0.00250AB-0.0032 50AC-0.028BC-0.38A2-0.31B2-0.27C2。

表6中 R2Adj值0.975，為失擬項(xiàng)系數(shù)，表明97.5%實(shí)際數(shù)據(jù)能用模型解釋。R2值0.989，為相關(guān)系數(shù)，表明理論值與實(shí)測(cè)值有很高的關(guān)聯(lián)性。從表6回歸方程方差分析得知，模型 P值＜0.0001，提示該模型差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。失擬項(xiàng)值為0.912，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明該模型對(duì)試驗(yàn)中的擬合較好[10]。

表6 回歸方程方差分析Tab.6 Analysis of varlance（ANOVA）of the regression model

從表 6 可見(jiàn) A、C、A2、B2、C2對(duì)總皂苷得率的影響，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。B的P值為0.0309，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3.3 響應(yīng)曲面圖分析 根據(jù)檢測(cè)結(jié)果繪制各因素的響應(yīng)曲面與等高線，其中，響應(yīng)曲面坡度的平緩陡峭程度反映因素間交互效應(yīng)的顯著性，曲面坡度陡峭，顯著性越大，曲面坡度平緩，顯著性越小[11]；而等高線的形狀反映因素間交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小，兩因素交互作用強(qiáng)則等高線為橢圓形，圓形則相反[12]。如圖5所示，乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取溫度、液固比與提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)與液固比的響應(yīng)曲面坡度較陡峭，等高線趨于橢圓形，表明上述3組因素間均具有一定的交互作用，但不顯著，此結(jié)果與回歸方程方差分析結(jié)果一致。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比和提取溫度對(duì)總皂苷得率影響的響應(yīng)曲面與等高線Fig.5 Response surface and contour of the effect of ethanol volume fraction,liquid-solid ratio and extraction temperature on total saponin yield

2.3.4 驗(yàn)證工藝 利用Design-Expert 8.0.6軟件預(yù)測(cè)的酸棗仁總皂苷提取最佳工藝為：液固比20mL·g-1、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、溫度80℃、時(shí)間60min。對(duì)該方案進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，總皂苷得率為6.30%，模型理論值為6.32%，表明該模型能很好地模擬生-炒酸棗仁總皂苷的提取條件，且響應(yīng)曲面優(yōu)化的工藝穩(wěn)定可行。

3 小結(jié)與討論

酸棗仁主要含有脂肪油、皂苷類(lèi)、黃酮類(lèi)、三萜類(lèi)和多糖等化學(xué)成分，具有鎮(zhèn)靜催眠、抗驚厥、抗心律失常、改善心肌缺血、增強(qiáng)免疫、降脂、抗缺氧、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)等藥理作用[3，14]。前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，生、酸棗仁藥對(duì)抗抑郁作用機(jī)制為抑制突觸間隙5-HT的重?cái)z取，增加突觸后膜5-HT1A受體，提高中樞5-HT能系統(tǒng)的功能和興奮性，抑制突觸間隙DA的重?cái)z取，提高中樞部分腦區(qū)DA含量，且藥對(duì)的抗抑郁作用優(yōu)于生、炒酸棗仁單用，其部分成分含量增加[8]。本實(shí)驗(yàn)在最佳工藝條件下，分別比較生酸棗仁、炒酸棗仁和藥對(duì)生-炒酸棗仁的總黃酮及總皂苷得率的差異，結(jié)果顯示，藥對(duì)生-炒酸棗仁兩類(lèi)代表成分的含量顯著升高，此結(jié)果可以為其藥效學(xué)差異提供依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)為排除酸棗仁中油脂的干擾，首先利用石油醚對(duì)生，炒酸棗仁藥材進(jìn)行脫脂，然后在不同條件下通過(guò)乙醇回流提取，借助雙波長(zhǎng)紫外分光光度計(jì)測(cè)得總黃酮及總皂苷含量，并計(jì)算得率。分別考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比、提取時(shí)間、提取溫度對(duì)得率的影響，并結(jié)合Box-Behnken響應(yīng)曲面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)得到最優(yōu)提取工藝參數(shù)：液固比20mL·g-1、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取溫度80℃、提取時(shí)間60min?？傇碥盏寐蕿椋?.29±0.06）%，總黃酮得率為（2.48±0.03）%。

響應(yīng)曲面是一種有效的優(yōu)化工藝參數(shù)的方法，可通過(guò)軟件Design-Expert 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)曲面試驗(yàn)，多因素分析、數(shù)據(jù)處理，得到回歸方程且能進(jìn)行因素間交互實(shí)驗(yàn)，分析交互作用強(qiáng)弱及顯著性，較其他試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法具有更多的優(yōu)勢(shì)[15，16]。經(jīng)工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證明，該提取工藝操作簡(jiǎn)單，提取總黃酮及總皂苷得率高，穩(wěn)定性良好，采用此法檢測(cè)藥對(duì)生-炒酸棗仁的總黃酮及總皂苷含量，操作方法簡(jiǎn)單，精密度，重復(fù)性，穩(wěn)定性，加樣回收率均較好，該工藝的優(yōu)化為其藥效學(xué)及機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)，也為臨床用藥提供參考。