脂肪干細胞對膝骨關(guān)節(jié)炎疼痛及軟骨修復的影響*

嚴波，凌曉宇，童培建，肖魯偉，單樂天

（1.浙江中醫(yī)藥大學 骨傷研究所，浙江 杭州310053；2.浙江省中醫(yī)院 骨傷科，浙江 杭州310006）

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis, KOA）是臨床最常見的慢性退行性骨代謝疾病，也是最常見的老年疾病之一，與衰老、創(chuàng)傷等因素有關(guān)，致殘率高達53%[1]，是成人殘疾的主要原因。KOA 患者約占全球人口15%，其中50 歲以上人群的發(fā)病率達50%，60 歲以上的發(fā)病率高達80%，嚴重威脅人類健康[2]。KOA 典型特征是軟骨退變，包括軟骨降解、關(guān)節(jié)滑膜纖維化、關(guān)節(jié)局部炎癥、軟骨下骨硬化、骨髓病變、骨贅形成等一系列的退行性病變，最終引起關(guān)節(jié)疼痛、僵硬、失用等行為功能障礙[3]。因此，軟骨代謝異常引起的軟骨退變是KOA 的主要發(fā)病機制，軟骨修復是KOA 早中期治療的主要目標。臨床治療KOA 的手段有限，普遍存在療效差或毒副作用大等問題[4]。

間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells, MSCs）具有 多向分化潛能，能在特定條件下分化成軟骨細胞，用于軟骨修復，為KOA 的局部治療開辟一條新的途徑[5-6]。但是MSCs 的臨床應用仍面臨如干細胞的遺傳穩(wěn)定性和免疫抑制效應等許多問題，無法有效地應用于臨床[7-9]。脂肪干細胞（adipose derived stem cells, ADSCs）被證實能向脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞、內(nèi)皮細胞、心肌細胞等定向分化[10]，其來源豐富、容易獲取、細胞同源性好、生長快速，在臨床多個?？凭哂芯薮蟮膽脻撃躘11]。ADSCs 不僅可分化為相關(guān)受損細胞，還可分泌一定的生長因子，如血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）、干細胞生長因子（stem cell growth factor, SCGF）等，通過分泌功能調(diào)節(jié)組織再生及修復[12]。已有文獻證明活體關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射ADSCs，可分化為活性軟骨細胞，補充凋亡的軟骨細胞，起到修復和治療骨關(guān)節(jié)炎的作用[13]。

前期優(yōu)化ADSCs 的提取、培養(yǎng)及質(zhì)量控制。本實 驗擬通過觀察不同濃度的ADSCs 干預KOA 大鼠模型，探討其對改善KOA 大鼠疼痛閾值及對大鼠軟骨細胞增殖的作用，為關(guān)節(jié)炎的臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SD 大鼠44 只，無特定病原體（SPF）級，體重為（200±20）g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCKK（滬）2007-0005，于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心進行實驗。實驗方案通過醫(yī)學動物實驗倫理委員會批準。

1.2 試劑及儀器

IMDM 培養(yǎng)基、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液、青鏈霉素混合液及0.25%胰蛋白酶（Trypsin-EDTA）（美國Gibco 公司），0.9%氯化鈉注射液（中國大冢制藥有限公司，批號5G70J3），碘乙酸（美國Sigma 公司），膠原酶Ⅳ（美國Worthington），乙二胺四乙酸（EDTA）（中國Solarbio 公司），YLS-3E 電子壓痛儀（安合盟天津科技發(fā)展有限公司），足底熱輻射測痛儀（西安峰嵐儀器廠），DK-S12 型恒溫水浴鍋（上海森信實驗儀器有限公司），SW-CJ-1F 層流超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），AXiovert 200 熒光倒置顯微鏡（BX20）（日本Olympus 公司），全自動多功能酶標儀（美國BioTek 公司），二氧化碳CO2細胞培養(yǎng)箱（3111）（美國Thermo 公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 ADSCs 制備及質(zhì)量控制 利用膠原酶消化法提取ADSCs。隨機選取4 只大鼠，無菌條件下取大鼠腹股溝脂肪組織，置于含Hank's 的培養(yǎng)皿中。去除 血質(zhì)及肉眼可見的血管、筋膜，反復清洗3～5 次。將清洗完畢的脂肪組織剪碎，置于50 ml 離心管中，1 000 r/min 離心5 min，棄上層組織。加入適量膠原酶Ⅳ，37℃消化45 min。加入Hank's 稀釋膠原酶Ⅳ，終止消化。用100 μm 細胞篩過濾，1 000 r/min 離心5 min，棄上清液。將細胞接種于25 cm×25 cm 培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。1 h 后換液。隔天觀察細胞生長情況。隨后每3 天換液，1 周后傳代。

實驗干預前收集培養(yǎng)皿生長的第3 代ADSCs，再次 離心重懸，制成低（1×106個/ml）、中（1×107個/ml）、高（1×108個/ml）3 種濃度的ADSCs，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 大鼠分組、復制及干預 將40 只SD 大鼠隨機分為空白組、KOA 模型組、ADSCs 低濃度治療組、ADSCs 中濃度治療組、ADSCs 高濃度治療組，每組8 只。KOA 模型組、ADSCs 低濃度治療組、ADSCs 中濃度治療組和ADSCs 高濃度治療組大鼠先復制KOA 模型，向大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)各注射25 mg/ml 碘乙酸50 μl復制KOA 模型，空白組大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)各注射25 mg/ml 生理鹽水50 μl。1 周后分別向ADSCs 低、中、高濃度治療組大鼠雙側(cè)后肢膝關(guān)節(jié)腔注射50 μl 低、中、高濃度ADSCs，向空白組和KOA 模型組大鼠膝關(guān)節(jié)腔注射等量生理鹽水，每周1 次，共注射4 次。

1.3.3 壓痛實驗 應用YLS-3E 電子壓痛儀測定大鼠的痛閾。將大鼠裝入固定桶內(nèi)，使其處于舒適又起固定作用的狀態(tài)，用扁型頭向大鼠雙側(cè)后足背施壓，當大鼠因疼痛出現(xiàn)鳴叫或掙扎時顯示的壓力值即為大鼠的痛閾值。實驗開始前測定基礎(chǔ)痛閾，于模型復制后的第2、4 周檢測痛閾。

1.3.4 熱痛實驗 應用足底熱輻射測痛儀檢測大鼠雙側(cè)后足趾熱痛閾值。測量時將大鼠置于透明有機玻璃箱內(nèi)，室溫保持在（25±2）℃。大鼠安靜后（停止梳理毛發(fā)和探索性活動），將測痛儀上的十字形標記置于大鼠左后跖足底中央并避開足墊，接下來開啟儀器，從開始至大鼠出現(xiàn)抬腿回避的時間作為大鼠的熱痛閾值。每只腳照射3 次，每次間隔5～6 min。為防止大鼠被熱輻射燙傷，將熱痛閾值測定的時間上限值設(shè)定為20 s，溫度上限值設(shè)定為35℃[14]。實驗于每次壓痛實驗后的6 h 進行檢測。

1.3.5 膝關(guān)節(jié)軟骨組織學檢測及骨關(guān)節(jié)炎程度評定 復制模型后4 周，最后1 次痛閾測試結(jié)束后，斷頸處死大鼠并取5 組大鼠雙側(cè)的膝關(guān)節(jié)于4%多聚甲醛固定48 h，EDTA 脫鈣4 周，酒精逐級脫水，浸蠟包埋后在切片機上沿膝關(guān)節(jié)矢狀面將脛骨外側(cè)平臺軟骨下松質(zhì)骨和股骨外側(cè)髁軟骨下松質(zhì)骨沿下肢縱軸方向切片，切片厚度5 μm，切片常規(guī)脫蠟至水，經(jīng)自來水沖洗后進行番紅O 染色、封片。熒光倒置顯微鏡下觀察組織病理學改變。參照Mankin's 軟骨組織學評分標準[15]進行評分（見表1）。

表1 Mankin's 評分標準

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較采用單因素方差分析或重復測量設(shè)計的方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 5 組大鼠壓痛閾值檢測結(jié)果

壓痛實驗結(jié)果表明，模型復制后第2 和4 周時，5 組大鼠的壓痛閾值比較，采用重復測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點大鼠壓痛閾值測定結(jié)果有差異（F=20.219，P=0.000）；②5 組間大鼠壓痛閾值無差異（F=0.767，P=0.550）；③5 組間的壓痛閾值測定結(jié)果變化趨勢有差異（F=1.234，P=0.024）。見表2。

2.2 5 組大鼠熱痛閾值檢測結(jié)果

熱痛實驗結(jié)果表明，模型復制后第2 和4 周時，5 組大鼠的熱痛閾值比較，采用重復測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點大鼠熱痛閾值有差異（F= 8.983，P=0.004）；②5 組間大鼠熱痛閾值無差異（F= 0.0879，P=0.986）；③5 組的熱痛閾值變化趨勢無差異（F=1.080，P=0.943）。見表3。

2.3 病理學結(jié)果與Mankin's 評分結(jié)果

病理學結(jié)果表明，與空白組比較，KOA 模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨表面明顯缺損，缺損處軟骨細胞嚴重丟失，蛋白聚糖降解，軟骨下骨呈現(xiàn)纖維化退變；低、中、高濃度ADSCs 對大鼠膝關(guān)節(jié)均有改善作用，呈濃度依賴趨勢。其中ADSCs 低濃度治療組仍可見軟骨表面缺損、軟骨細胞缺失和肥大化表型，ADSCs 中濃度治療組軟骨細胞大量存活，但仍有表面缺損和細胞肥大化退變，ADSCs 高濃度治療組軟骨基本恢復正常，軟骨面增厚，僅有少量肥大軟骨細胞（見圖1）。5 組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨Mankin's 評分比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=28.961，P=0.000）；KOA模型組的Mankin's 評分（9.29±1.03）均高于空白組（1.63±1.11）分、ADSCs 低濃度治療組（6.88±2.42）分、ADSCs 中濃度治療組（4.25±0.66）分和ADSCs 高濃度治療組（3.71±1.03）分（P＜0.05）；ADSCs 低濃度治療組的Mankin's 評分均高于ADSCs 高濃度治療組、ADSCs 中濃度治療組（P＜0.05）；ADSCs 高濃度治療組的Mankin's 評分與ADSCs 中濃度治療組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表2 5 組大鼠壓痛閾值的比較 （n =8，g，±s）

表2 5 組大鼠壓痛閾值的比較 （n =8，g，±s）

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表3 5 組大鼠熱痛閾值的比較 （n =8，g，±s）

表3 5 組大鼠熱痛閾值的比較 （n =8，g，±s）

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圖1 大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理切片 （番紅O 染色×100）

3 討論

KOA 臨床治療的常用藥物有甾體類抗炎藥（SAIDs）、非甾體類抗炎藥（NSAIDs）、阿片類鎮(zhèn)痛藥、關(guān)節(jié)營養(yǎng)素等，能緩解疼痛等KOA 癥狀、改善關(guān)節(jié)活動度[16]。然而，該藥物不僅無法逆轉(zhuǎn)KOA 的病變進程，而且會對機體產(chǎn)生明顯的毒副作用[16]。ADSCs來源于脂肪組織，易培養(yǎng)增殖，可分化為軟骨細胞，促進軟骨修復，有效抑制骨關(guān)節(jié)炎進展[17-18]。ADSCs相較于骨髓干細胞，同樣具有分化為成骨細胞及軟骨細胞的能力，且其具有創(chuàng)傷小、無免疫排斥性、取材便利并反復取材、來源廣泛的優(yōu)點，故ADSCs 相較于骨髓干細胞在治療KOA 方面有著一定優(yōu)勢。

本實驗大鼠膝關(guān)節(jié)腔注射碘乙酸后其關(guān)節(jié)面毛糙，細胞壞死和滑膜增生，炎癥細胞浸潤，同時隨著時間延長，關(guān)節(jié)破壞進行性加重，類似于KOA 表現(xiàn)，同時碘乙酸誘發(fā)的大鼠膝關(guān)節(jié)有較好的均一性和可比性。POMONIS 等[19]也用碘乙酸復制骨性關(guān)節(jié)炎動物模型，并認為碘乙酸與KOA 疼痛有關(guān)。故碘乙酸模型相較于前交叉韌帶切斷模型在KOA 疼痛有著一定優(yōu)勢。

本研究疼痛檢測結(jié)果表明，ADSCs 可促進大鼠軟骨修復，并有效提高膝骨關(guān)節(jié)炎的痛閾。關(guān)節(jié)病理結(jié)果表明，關(guān)節(jié)腔注射ADSCs能起到有效緩解關(guān)節(jié)疼痛，修復軟骨等作用。實驗中無明顯的不良反應發(fā)，進而證實ADSCs 治療KOA 具有良好的有效性和安全性。

本研究存在的主要不足是研究還處于動物實驗階段；對ADSCs 緩解疼痛的機制、軟骨細胞再生和/或軟骨祖細胞原位再生，以及受損關(guān)節(jié)軟骨修復過程和機制不清。KOA 的發(fā)生受多種因素影響，ADSCs 對治療KOA 有多大效果，是能夠逆轉(zhuǎn)KOA 的發(fā)病機制，使其恢復正常，還是能夠阻止已有癥狀的關(guān)節(jié)炎進一步發(fā)展，或僅起到預防KOA 的作用，仍需要大量基礎(chǔ)研究以及臨床實驗后才能得出結(jié)論。

綜上所述，ADSCs 能有效緩解骨關(guān)節(jié)炎疼痛，修復軟骨等，具有較高的安全性和療效，值得進一步和深入研究。