心臟不停跳大鼠單肺體外循環(huán)肺損傷模型的建立

劉科宇，張紅，何苗，謝菲，李倩，于承坤

（1.遵義醫(yī)科大學 麻醉醫(yī)學院，貴州 遵義 563000；2.成都大學附屬醫(yī)院 麻醉科，四川 成都 610081；3.遵義市第一人民醫(yī)院 重癥醫(yī)學科，貴州 遵義 563000）

目前體外循環(huán)（cardiopulmonary bypass, CPB）技術(shù)已廣泛應(yīng)用于臨床心血管手術(shù)和非心血管手術(shù)中，但CPB 后各重要臟器的病理生理改變，一直是人們關(guān)注的重點。為進一步研究相關(guān)保護措施，國內(nèi)外已經(jīng)復(fù)制了多種CPB 動物模型，如：猴[1]、豬[2]、狗[3]等。因大鼠基因與人同源程度高、個體差異小、可重復(fù)性強，價格低廉、品系純正，同時大鼠體型小，適合單人操作，使實驗操作差異性明顯減小[4]，所以大鼠CPB 模型越來越受到科研人員的重視，但目前針對CPB 肺損傷及肺保護的大鼠CPB 模型還鮮有報道。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康成年SD 大鼠24 只。雄性，體重350～500g，4～8個月，清潔級，由陸軍軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院創(chuàng)傷外科研究所動物中心提供，許可證號：SCXK（渝）2012—0005。術(shù)前禁食12h，禁水2h。

1.2 實驗設(shè)備

大鼠膜式氧合器（東莞科威醫(yī)療機械有限公司），小動物呼吸機（上海奧爾科特生物科技有限公司），BT100-2J 蠕動泵（蘭格恒流泵有限公司），大鼠體溫維持儀（瑞沃德生命科技有限公司），MD3000 型生物信號采集處理系統(tǒng)（淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司），GEM Premier 3000 血氣分析儀（美國實驗儀器公司），ACT 儀（美國美敦力公司），WZS-50F2 雙通道輸液泵（浙江大學醫(yī)學儀器有限公司），16、20 及22G 靜脈留置針（貝朗醫(yī)療上海國際貿(mào)易公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 CPB 管道的準備 CPB 管道由儲血室（20ml注射器）、大鼠膜肺、蠕動泵、硅膠管（外徑約4mm，內(nèi)徑約3mm，長為60cm）以及動靜脈管路組成。動物實驗前，連接CPB 管道，連接氧氣源，用羥乙基淀粉9ml、甘露醇1ml、鈉鉀鎂鈣葡萄糖注射液1ml及5%碳酸氫鈉1ml 預(yù)充CPB 管道，排凈空氣。

1.3.2 實驗分組 將24 只大鼠隨機分為單純開胸組（T 組）、單純CPB 組（C 組）、缺血再灌注組（IR 組），每組8 只。T 組僅開胸，C 組開胸后僅建立CPB 模型，IR 組開胸后建立大鼠CPB 左肺缺血再灌注損傷模型。

1.3.3 模型的建立 采用1%戊巴比妥鈉（腹腔內(nèi)注射，50mg/kg）麻醉大鼠。麻醉后仰臥位固定大鼠，行尾靜脈穿刺置管。用加熱毯給大鼠保溫。喉鏡明視下行氣管插管，氣管導(dǎo)管連接小動物呼吸機，并行機械通氣，維持潮氣量15ml/kg，呼吸頻率60 次/min，I ∶E=1.0 ∶2.5，F(xiàn)iO2∶99%。分離右側(cè)股動靜脈及左側(cè)股靜脈并穿刺置管，右側(cè)股動脈連接生物信號采集處理系統(tǒng)監(jiān)測大鼠心率和血壓。將體溫計插入大鼠肛門5mm 處以檢測核心溫度。尾靜脈注射肝素 5mg/kg，待全身肝素化后，以雙側(cè)股靜脈作為靜脈端引流，右側(cè)頸總動脈作為動脈端回流連接CPB 管道，待ACT＞480s 后開始轉(zhuǎn)機；并行循環(huán)10min 后經(jīng)左側(cè)第4 肋間開胸夾閉左側(cè)肺門，行右肺單肺通氣，調(diào)節(jié)適合的潮氣量及呼吸頻率；并行循環(huán)45min 后，開放左肺門，恢復(fù)雙肺通氣；并行循環(huán)30min 后停止CPB；停機90min 后實驗結(jié)束。CPB 期間采用體溫維持儀使肛溫維持在32～34℃，維持平均動脈壓（MAP）50～80mmHg，灌注流量40 ml/（kg·min）；非CPB 期間維持肛溫在36.0～37.5℃，MAP 60～110mmHg。停機前尾靜脈注射魚精蛋白中和多余肝素，機血回收后從尾靜脈輸入大鼠體內(nèi)。術(shù)中通過動脈血氣分析結(jié)果調(diào)節(jié)大鼠內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性，采用鎮(zhèn)靜藥、鎮(zhèn)痛藥和肌松藥來維持麻醉深度，必要時給予血管活性藥物維持大鼠生命體征。術(shù)中大鼠留置胃管行胃腸減壓，留置尿管用于術(shù)中尿液引流[5]。見圖1。

1.3.4 標本的采集 分別于CPB 前（T1）、開放左肺門即刻（T2）及實驗結(jié)束時（T3），經(jīng)股動脈抽取動脈血0.5ml 行血氣分析，記錄紅細胞壓積（Hct）及血乳酸（Lac），并計算氧合指數(shù)（OI）和呼吸指數(shù)（RI）。實驗結(jié)束時經(jīng)股動脈抽取動脈血2ml，離心后取上清液，于-80℃冰箱保存，采用ELISA 法檢測血清白細胞介素-1β（Interleukin-1β, IL-1β）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α, TNF-α）的含量。取完血液標本后，剪取左肺組織，并分為上下兩部分。左肺上部經(jīng)4% 多聚甲醛固定后，行光學顯微鏡檢查及病理損傷評分；左肺下部經(jīng)液氮凍存后，于-80℃冰箱冷凍 保存，采用ELISA 法檢測肺組織IL-1β 和TNF-α 的含量。取完標本后，大鼠注入過量麻藥處死。

1.3.5 指標的檢測 ①肺功能檢測：根據(jù)動脈血氣分析結(jié)果計算氧合指數(shù)（OI=PaO2/FiO2）、呼吸指數(shù)（RI= P（A-a）O2/PaO2）。校正氧合指數(shù)＝PaO2/[FiO2×（P/760）]；肺泡-動脈血氧分壓差[P（A-a）O2]=（P- PH2O）×FiO2-PaO2-PaCO2/0.8；PH2O 為飽和水蒸氣壓，標準狀態(tài)下為47mmHg；P 為實際大氣壓強，遵義地區(qū)為680mmHg；FiO2（%）為吸入氧濃度，本動物實驗?zāi)Ｐ蜑?9%。②肺組織光學顯微鏡檢查及病理損傷評分：左肺組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后，石蠟包埋處理。用切片機將包埋好的石蠟切成3～5μm 薄片，先后經(jīng)50%乙醇和正丁醇2 次脫水，經(jīng)二甲苯脫蠟3 次（切片脫蠟要完全，否則妨礙正常染色），HE染色后封片，在光學顯微鏡下觀察肺組織形態(tài)，并拍攝圖片保存；每張病理切片隨機選擇3個高倍鏡視野（×100），采用CHENG 等[6]和DOS SANTOS 等[7]標準進行評分。按照肺泡及肺泡間質(zhì)有無水腫液、紅細胞滲出及炎癥細胞浸潤進行評分，并取平均值作為此切片的評分。③ELISA 檢測：按照ELISA 試劑盒說明書檢測血漿及肺組織中TNF-α 和IL-1β 含量變化。由于CPB 后血液稀釋的影響，血漿TNF-α 和IL-1β的含量按如下公式進行校正：校正值=實測值×轉(zhuǎn)機前血細胞比積（Hct）值/實際Hct 值。

圖1 大鼠單肺體外循環(huán)肺損傷模型圖

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析或單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05 差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血流動力學指標變化

T 組、C組與IR組大鼠T1、T2、T3的HR比較，符合正態(tài)分布和球形檢驗，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點的HR 有差異（F=22.372，P= 0.000）；②3 組間的HR 有差異（F=8.701，P=0.000）；③3組HR變化趨勢有差異（F=7.556，P=0.000）。見表1。

T 組、C 組與IR 組大鼠T1、T2、T3的MAP 比較，符合正態(tài)分布和球形檢驗，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點的MAP 有差異（F=66.997，P=0.000），②3 組間的MAP 有差異（F=7.104，P= 0.000），③3 組MAP 變化趨勢有差異（F=14.758，P= 0.000）。見表1。

2.2 各組大鼠Hct 及Lac 的變化

T 組、C 組和IR 組在T1、T2、T3不同時間的Hct比較，符合正態(tài)分布和球形檢驗，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點的Hct 有差異（F= 54.630，P=0.000）；②3 組間的Hct 有差異（F= 188.425，P=0.000）；③3 組的Hct 變化趨勢有差異（F= 25.538，P=0.000）。見表2。

T 組、C組和IR 組大鼠T1、T2、T3的Lac比較，符合正態(tài)分布和球形檢驗，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點的Lac有差異（F=66.464，P= 0.000）；②3 組間大鼠的Lac 有差異（F=55.746，P= 0.000）；③3 組的Lac 變化趨勢有差異（F=10.733，P= 0.000）。見表2。

表1 各組大鼠不同時間點血流動力學指標比較 （n =8，±s）

表1 各組大鼠不同時間點血流動力學指標比較 （n =8，±s）

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2.3 各組大鼠OI 及RI 的變化

T 組、C 組與IR 組大鼠T1、T2、T3的OI 比較，符合正態(tài)分布和球形檢驗，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點的OI 有差異（F=63.795，P= 0.000）；②3 組間大鼠的OI 有差異（F=75.493，P= 0.000）；③3 組OI 變化趨勢有差異（F=29.727，P= 0.000）。見表3。

T 組、C 組與IR 組大鼠T1、T2、T3的RI 比較，符合正態(tài)分布和球形檢驗，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點的RI 有差異（F=35.491，P= 0.000）；②3 組間大鼠的RI 有差異（F=46.995，P= 0.000）；③3 組RI 變化趨勢有差異（F=25.699，P= 0.000）。見表3。

2.4 各組大鼠肺組織病理學評分

T 組、C 組及IR 組大鼠在T3時肺組織病理損傷 評分為（0.75±0.24）、（2.13±0.25）和（4.42±0.83）分，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=101.974，P=0.000），進一步兩兩比較，經(jīng)LSD-t檢驗，C 組高于T 組（P＜0.05），IR 組高于T、C 組（P＜0.05）。T組肺組織結(jié)構(gòu)較清晰，肺泡壁完整（見圖2A）；C 組肺組織結(jié)構(gòu)稍清晰，見少量肺泡壁塌陷及炎性滲出（見圖2B）；IR 組肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，充滿水腫液，肺泡壁斷裂，可見紅細胞和炎癥細胞浸潤（見圖2C）。

表2 各組大鼠不同時間點Hct 及Lac 比較 （n =8，±s）

表2 各組大鼠不同時間點Hct 及Lac 比較 （n =8，±s）

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表3 各組大鼠不同時點OI 及RI 比較 （n =8，±s）

表3 各組大鼠不同時點OI 及RI 比較 （n =8，±s）

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2.5 各組大鼠IL-1β、TNF-α 含量的變化

T 組、C 組、IR 組大鼠在T3時肺組織及血清中IL-1β、TNF-α 含量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。各組大鼠肺組織及血清中IL-1β、TNF-α 含量 的變化趨勢一致；C 組IL-1β、TNF-α 的含量均高于T 組（P＜0.05），IR 組IL-1β、TNF-α 的含量高于T組和C 組（P＜0.05）。見表4。

圖2 各組T3 時間點肺組織病理切片 （HE×100）

表4 各組大鼠T3 時間點血清、肺組織中IL-1β、TNF-α 含量的比較 （n =8，ng/L，±s）

表4 各組大鼠T3 時間點血清、肺組織中IL-1β、TNF-α 含量的比較 （n =8，ng/L，±s）

注：①與T 組比較，P ＜0.05；②與C 組比較，P ＜0.05。

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3 討論

目前大多數(shù)學者認為，導(dǎo)致CPB 肺損傷的原因主要是血液與管道接觸、肝素-魚精蛋白等引起的全身性炎癥反應(yīng)和主動脈開放后對肺組織造成的缺血再灌注損傷；據(jù)此特點本實驗?zāi)Ｐ筒捎秒p側(cè)股靜脈作為靜脈端引流，右側(cè)頸總動脈作為動脈端回流進行CPB。預(yù)充液采用無血預(yù)充，總預(yù)充量為12 ml（晶體液:膠體液=1 ∶3），恰好為成年大鼠全身血容量的一半（成年大鼠血容量5.75～6.99 ml/100g）；大鼠正常平均心輸出量為150～180 ml/（kg·min）[8]，經(jīng)過預(yù)實驗探索，本實驗大鼠采用心臟不停跳CPB，流量控制在心輸出量的1/4，約40 ml/（kg·min），可維持MAP 在50～80 mmHg；采用大鼠專用的小動物膜肺（交換面積0.05 m2，預(yù)充量3 ml）；實驗在CPB 前行全身肝素化，停機時又給予魚精蛋白拮抗；模擬血液與管道的接觸以及肝素-魚精蛋白等造成的全身炎癥反應(yīng)。同時本實驗在CPB 過程中夾閉左側(cè)肺門45 min 后開放左肺門，模擬心臟復(fù)跳后肺組織的缺血再灌注損傷。與臨床實際操作不同，本實驗中大鼠心臟并不停跳，減少動物的創(chuàng)傷，使實驗動物能夠長時間的保持循環(huán)穩(wěn)定（左肺再灌注后可維持生命體征平穩(wěn)超過2 h），亦排除因心臟缺血再灌注對肺功能的干擾。

臨床常用OI 和RI 來作為判斷肺功能的指標。OI常用來評價肺氧合和換氣功能，與肺損傷呈正相關(guān)；RI 能客觀反映肺組織的實際氧合情況，與肺功能狀態(tài)呈負相關(guān)；兩者可綜合反映肺功能情況[9]。多種炎癥細胞因子與CPB 肺損傷關(guān)系密切[10]，其中最重要的細胞因子主要包括TNF-α 和白細胞介素（IL-1β、IL-6）[11]。本實驗中3 組大鼠T3時間點OI 低于T1，而RI 高于T1；說明隨著時間的延長，3 組實驗均可降低大鼠的肺功能。實驗結(jié)束時，C 組大鼠肺組織病理損傷評分、肺組織及血漿中的IL-1β、TNF-α 的含量高于T 組；而肺功能則比T 組降低；說明CPB后導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致肺損傷。IR 組與C 組及T 組比較，大鼠Lac 濃度高于其他兩組，大鼠的組織氧供及代謝情況比其他兩組差；肺組織及血漿中的IL-1β、TNF-α 的含量，IR 組＞C 組＞T 組，而肺組織病理改變及肺功能下降程度，IR 組＞C 組＞T 組，表明IR 組左肺組織在左肺動脈開放后遭受CPB 全身炎癥反應(yīng)和血再灌注損傷的雙重打擊，大鼠全身炎癥反應(yīng)及肺組織損傷比其他兩組嚴重，能模擬臨床CPB 肺損傷的病理生理改變，大鼠單肺CPB 肺損傷自創(chuàng)模型成功建立。

大鼠的肺臟位于胸腔中部，分為左、右兩部分。與人類解剖結(jié)構(gòu)不同，大鼠左肺為一個大葉，右肺分為4 葉（前葉、中葉、副葉、后葉），本實驗經(jīng)左側(cè)第4 肋間開胸可直接暴露左肺門，易于夾閉。另外，實驗中夾閉肺門采用的是自制的小動物專用門脈閉合鑷，能夠輕松夾閉和開放肺門，減輕夾閉肺門時導(dǎo)致的損傷，利于動物的存活。在預(yù)實驗中，筆者發(fā)現(xiàn)本實驗的氣管導(dǎo)管（16 G 靜脈留置套管）沒用套囊，在機械通氣過程中易漏氣，致腹腔壓力增高、影響肺擴張，嚴重時可造成血流動力學的劇烈改變；經(jīng)留置胃管后能很好地避免該類相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生。實驗中常規(guī)肌松劑的使用易導(dǎo)致尿儲留，留置尿管后能改善尿液引流，更易于液體的平衡管理。同時，術(shù)中通過動脈血氣分析結(jié)果調(diào)節(jié)大鼠內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，定時（間隔30～45 min）給予鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛和肌松藥來維持麻醉深度，以及實時監(jiān)測和調(diào)控大鼠的血壓、心率和體溫，極大程度地模擬臨床CPB 術(shù)中的管理。

綜上所述，本自創(chuàng)實驗?zāi)Ｐ统晒δM臨床CPB 肺損傷的病理生理變化，適用于體外循環(huán)肺損傷及其機制的實驗研究，有助于推動體外循環(huán)肺保護的研究。