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    心臟不停跳大鼠單肺體外循環(huán)肺損傷模型的建立

    2020-03-10 06:58:22劉科宇張紅何苗謝菲李倩于承坤
    中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志 2020年3期
    關(guān)鍵詞:肺門差異含量

    劉科宇,張紅,何苗,謝菲,李倩,于承坤

    (1.遵義醫(yī)科大學 麻醉醫(yī)學院,貴州 遵義 563000;2.成都大學附屬醫(yī)院 麻醉科,四川 成都 610081;3.遵義市第一人民醫(yī)院 重癥醫(yī)學科,貴州 遵義 563000)

    目前體外循環(huán)(cardiopulmonary bypass, CPB)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于臨床心血管手術(shù)和非心血管手術(shù)中,但CPB 后各重要臟器的病理生理改變,一直是人們關(guān)注的重點。為進一步研究相關(guān)保護措施,國內(nèi)外已經(jīng)復(fù)制了多種CPB 動物模型,如:猴[1]、豬[2]、狗[3]等。因大鼠基因與人同源程度高、個體差異小、可重復(fù)性強,價格低廉、品系純正,同時大鼠體型小,適合單人操作,使實驗操作差異性明顯減小[4],所以大鼠CPB 模型越來越受到科研人員的重視,但目前針對CPB 肺損傷及肺保護的大鼠CPB 模型還鮮有報道。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物

    健康成年SD 大鼠24 只。雄性,體重350~500g,4~8個月,清潔級,由陸軍軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院創(chuàng)傷外科研究所動物中心提供,許可證號:SCXK(渝)2012—0005。術(shù)前禁食12h,禁水2h。

    1.2 實驗設(shè)備

    大鼠膜式氧合器(東莞科威醫(yī)療機械有限公司),小動物呼吸機(上海奧爾科特生物科技有限公司),BT100-2J 蠕動泵(蘭格恒流泵有限公司),大鼠體溫維持儀(瑞沃德生命科技有限公司),MD3000 型生物信號采集處理系統(tǒng)(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司),GEM Premier 3000 血氣分析儀(美國實驗儀器公司),ACT 儀(美國美敦力公司),WZS-50F2 雙通道輸液泵(浙江大學醫(yī)學儀器有限公司),16、20 及22G 靜脈留置針(貝朗醫(yī)療上海國際貿(mào)易公司)。

    1.3 實驗方法

    1.3.1 CPB 管道的準備 CPB 管道由儲血室(20ml注射器)、大鼠膜肺、蠕動泵、硅膠管(外徑約4mm,內(nèi)徑約3mm,長為60cm)以及動靜脈管路組成。動物實驗前,連接CPB 管道,連接氧氣源,用羥乙基淀粉9ml、甘露醇1ml、鈉鉀鎂鈣葡萄糖注射液1ml及5%碳酸氫鈉1ml 預(yù)充CPB 管道,排凈空氣。

    1.3.2 實驗分組 將24 只大鼠隨機分為單純開胸組(T 組)、單純CPB 組(C 組)、缺血再灌注組(IR 組),每組8 只。T 組僅開胸,C 組開胸后僅建立CPB 模型,IR 組開胸后建立大鼠CPB 左肺缺血再灌注損傷模型。

    1.3.3 模型的建立 采用1%戊巴比妥鈉(腹腔內(nèi)注射,50mg/kg)麻醉大鼠。麻醉后仰臥位固定大鼠,行尾靜脈穿刺置管。用加熱毯給大鼠保溫。喉鏡明視下行氣管插管,氣管導(dǎo)管連接小動物呼吸機,并行機械通氣,維持潮氣量15ml/kg,呼吸頻率60 次/min,I ∶E=1.0 ∶2.5,F(xiàn)iO2∶99%。分離右側(cè)股動靜脈及左側(cè)股靜脈并穿刺置管,右側(cè)股動脈連接生物信號采集處理系統(tǒng)監(jiān)測大鼠心率和血壓。將體溫計插入大鼠肛門5mm 處以檢測核心溫度。尾靜脈注射肝素 5mg/kg,待全身肝素化后,以雙側(cè)股靜脈作為靜脈端引流,右側(cè)頸總動脈作為動脈端回流連接CPB 管道,待ACT>480s 后開始轉(zhuǎn)機;并行循環(huán)10min 后經(jīng)左側(cè)第4 肋間開胸夾閉左側(cè)肺門,行右肺單肺通氣,調(diào)節(jié)適合的潮氣量及呼吸頻率;并行循環(huán)45min 后,開放左肺門,恢復(fù)雙肺通氣;并行循環(huán)30min 后停止CPB;停機90min 后實驗結(jié)束。CPB 期間采用體溫維持儀使肛溫維持在32~34℃,維持平均動脈壓(MAP)50~80mmHg,灌注流量40 ml/(kg·min);非CPB 期間維持肛溫在36.0~37.5℃,MAP 60~110mmHg。停機前尾靜脈注射魚精蛋白中和多余肝素,機血回收后從尾靜脈輸入大鼠體內(nèi)。術(shù)中通過動脈血氣分析結(jié)果調(diào)節(jié)大鼠內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性,采用鎮(zhèn)靜藥、鎮(zhèn)痛藥和肌松藥來維持麻醉深度,必要時給予血管活性藥物維持大鼠生命體征。術(shù)中大鼠留置胃管行胃腸減壓,留置尿管用于術(shù)中尿液引流[5]。見圖1。

    1.3.4 標本的采集 分別于CPB 前(T1)、開放左肺門即刻(T2)及實驗結(jié)束時(T3),經(jīng)股動脈抽取動脈血0.5ml 行血氣分析,記錄紅細胞壓積(Hct)及血乳酸(Lac),并計算氧合指數(shù)(OI)和呼吸指數(shù)(RI)。實驗結(jié)束時經(jīng)股動脈抽取動脈血2ml,離心后取上清液,于-80℃冰箱保存,采用ELISA 法檢測血清白細胞介素-1β(Interleukin-1β, IL-1β)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)的含量。取完血液標本后,剪取左肺組織,并分為上下兩部分。左肺上部經(jīng)4% 多聚甲醛固定后,行光學顯微鏡檢查及病理損傷評分;左肺下部經(jīng)液氮凍存后,于-80℃冰箱冷凍 保存,采用ELISA 法檢測肺組織IL-1β 和TNF-α 的含量。取完標本后,大鼠注入過量麻藥處死。

    1.3.5 指標的檢測 ①肺功能檢測:根據(jù)動脈血氣分析結(jié)果計算氧合指數(shù)(OI=PaO2/FiO2)、呼吸指數(shù)(RI= P(A-a)O2/PaO2)。校正氧合指數(shù)=PaO2/[FiO2×(P/760)];肺泡-動脈血氧分壓差[P(A-a)O2]=(P- PH2O)×FiO2-PaO2-PaCO2/0.8;PH2O 為飽和水蒸氣壓,標準狀態(tài)下為47mmHg;P 為實際大氣壓強,遵義地區(qū)為680mmHg;FiO2(%)為吸入氧濃度,本動物實驗?zāi)P蜑?9%。②肺組織光學顯微鏡檢查及病理損傷評分:左肺組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后,石蠟包埋處理。用切片機將包埋好的石蠟切成3~5μm 薄片,先后經(jīng)50%乙醇和正丁醇2 次脫水,經(jīng)二甲苯脫蠟3 次(切片脫蠟要完全,否則妨礙正常染色),HE染色后封片,在光學顯微鏡下觀察肺組織形態(tài),并拍攝圖片保存;每張病理切片隨機選擇3個高倍鏡視野(×100),采用CHENG 等[6]和DOS SANTOS 等[7]標準進行評分。按照肺泡及肺泡間質(zhì)有無水腫液、紅細胞滲出及炎癥細胞浸潤進行評分,并取平均值作為此切片的評分。③ELISA 檢測:按照ELISA 試劑盒說明書檢測血漿及肺組織中TNF-α 和IL-1β 含量變化。由于CPB 后血液稀釋的影響,血漿TNF-α 和IL-1β的含量按如下公式進行校正:校正值=實測值×轉(zhuǎn)機前血細胞比積(Hct)值/實際Hct 值。

    圖1 大鼠單肺體外循環(huán)肺損傷模型圖

    1.4 統(tǒng)計學方法

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,比較采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析或單因素方差分析,進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗,P<0.05 差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各組大鼠血流動力學指標變化

    T 組、C組與IR組大鼠T1、T2、T3的HR比較,符合正態(tài)分布和球形檢驗,采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析,結(jié)果:①不同時間點的HR 有差異(F=22.372,P= 0.000);②3 組間的HR 有差異(F=8.701,P=0.000);③3組HR變化趨勢有差異(F=7.556,P=0.000)。見表1。

    T 組、C 組與IR 組大鼠T1、T2、T3的MAP 比較,符合正態(tài)分布和球形檢驗,采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析,結(jié)果:①不同時間點的MAP 有差異(F=66.997,P=0.000),②3 組間的MAP 有差異(F=7.104,P= 0.000),③3 組MAP 變化趨勢有差異(F=14.758,P= 0.000)。見表1。

    2.2 各組大鼠Hct 及Lac 的變化

    T 組、C 組和IR 組在T1、T2、T3不同時間的Hct比較,符合正態(tài)分布和球形檢驗,采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析,結(jié)果:①不同時間點的Hct 有差異(F= 54.630,P=0.000);②3 組間的Hct 有差異(F= 188.425,P=0.000);③3 組的Hct 變化趨勢有差異(F= 25.538,P=0.000)。見表2。

    T 組、C組和IR 組大鼠T1、T2、T3的Lac比較,符合正態(tài)分布和球形檢驗,采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析,結(jié)果:①不同時間點的Lac有差異(F=66.464,P= 0.000);②3 組間大鼠的Lac 有差異(F=55.746,P= 0.000);③3 組的Lac 變化趨勢有差異(F=10.733,P= 0.000)。見表2。

    表1 各組大鼠不同時間點血流動力學指標比較 (n =8,±s)

    表1 各組大鼠不同時間點血流動力學指標比較 (n =8,±s)

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    2.3 各組大鼠OI 及RI 的變化

    T 組、C 組與IR 組大鼠T1、T2、T3的OI 比較,符合正態(tài)分布和球形檢驗,采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析,結(jié)果:①不同時間點的OI 有差異(F=63.795,P= 0.000);②3 組間大鼠的OI 有差異(F=75.493,P= 0.000);③3 組OI 變化趨勢有差異(F=29.727,P= 0.000)。見表3。

    T 組、C 組與IR 組大鼠T1、T2、T3的RI 比較,符合正態(tài)分布和球形檢驗,采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析,結(jié)果:①不同時間點的RI 有差異(F=35.491,P= 0.000);②3 組間大鼠的RI 有差異(F=46.995,P= 0.000);③3 組RI 變化趨勢有差異(F=25.699,P= 0.000)。見表3。

    2.4 各組大鼠肺組織病理學評分

    T 組、C 組及IR 組大鼠在T3時肺組織病理損傷 評分為(0.75±0.24)、(2.13±0.25)和(4.42±0.83)分,經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計學意義(F=101.974,P=0.000),進一步兩兩比較,經(jīng)LSD-t檢驗,C 組高于T 組(P<0.05),IR 組高于T、C 組(P<0.05)。T組肺組織結(jié)構(gòu)較清晰,肺泡壁完整(見圖2A);C 組肺組織結(jié)構(gòu)稍清晰,見少量肺泡壁塌陷及炎性滲出(見圖2B);IR 組肺組織結(jié)構(gòu)紊亂,充滿水腫液,肺泡壁斷裂,可見紅細胞和炎癥細胞浸潤(見圖2C)。

    表2 各組大鼠不同時間點Hct 及Lac 比較 (n =8,±s)

    表2 各組大鼠不同時間點Hct 及Lac 比較 (n =8,±s)

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    表3 各組大鼠不同時點OI 及RI 比較 (n =8,±s)

    表3 各組大鼠不同時點OI 及RI 比較 (n =8,±s)

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    2.5 各組大鼠IL-1β、TNF-α 含量的變化

    T 組、C 組、IR 組大鼠在T3時肺組織及血清中IL-1β、TNF-α 含量比較,差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)。各組大鼠肺組織及血清中IL-1β、TNF-α 含量 的變化趨勢一致;C 組IL-1β、TNF-α 的含量均高于T 組(P<0.05),IR 組IL-1β、TNF-α 的含量高于T組和C 組(P<0.05)。見表4。

    圖2 各組T3 時間點肺組織病理切片 (HE×100)

    表4 各組大鼠T3 時間點血清、肺組織中IL-1β、TNF-α 含量的比較 (n =8,ng/L,±s)

    表4 各組大鼠T3 時間點血清、肺組織中IL-1β、TNF-α 含量的比較 (n =8,ng/L,±s)

    注:①與T 組比較,P <0.05;②與C 組比較,P <0.05。

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    3 討論

    目前大多數(shù)學者認為,導(dǎo)致CPB 肺損傷的原因主要是血液與管道接觸、肝素-魚精蛋白等引起的全身性炎癥反應(yīng)和主動脈開放后對肺組織造成的缺血再灌注損傷;據(jù)此特點本實驗?zāi)P筒捎秒p側(cè)股靜脈作為靜脈端引流,右側(cè)頸總動脈作為動脈端回流進行CPB。預(yù)充液采用無血預(yù)充,總預(yù)充量為12 ml(晶體液:膠體液=1 ∶3),恰好為成年大鼠全身血容量的一半(成年大鼠血容量5.75~6.99 ml/100g);大鼠正常平均心輸出量為150~180 ml/(kg·min)[8],經(jīng)過預(yù)實驗探索,本實驗大鼠采用心臟不停跳CPB,流量控制在心輸出量的1/4,約40 ml/(kg·min),可維持MAP 在50~80 mmHg;采用大鼠專用的小動物膜肺(交換面積0.05 m2,預(yù)充量3 ml);實驗在CPB 前行全身肝素化,停機時又給予魚精蛋白拮抗;模擬血液與管道的接觸以及肝素-魚精蛋白等造成的全身炎癥反應(yīng)。同時本實驗在CPB 過程中夾閉左側(cè)肺門45 min 后開放左肺門,模擬心臟復(fù)跳后肺組織的缺血再灌注損傷。與臨床實際操作不同,本實驗中大鼠心臟并不停跳,減少動物的創(chuàng)傷,使實驗動物能夠長時間的保持循環(huán)穩(wěn)定(左肺再灌注后可維持生命體征平穩(wěn)超過2 h),亦排除因心臟缺血再灌注對肺功能的干擾。

    臨床常用OI 和RI 來作為判斷肺功能的指標。OI常用來評價肺氧合和換氣功能,與肺損傷呈正相關(guān);RI 能客觀反映肺組織的實際氧合情況,與肺功能狀態(tài)呈負相關(guān);兩者可綜合反映肺功能情況[9]。多種炎癥細胞因子與CPB 肺損傷關(guān)系密切[10],其中最重要的細胞因子主要包括TNF-α 和白細胞介素(IL-1β、IL-6)[11]。本實驗中3 組大鼠T3時間點OI 低于T1,而RI 高于T1;說明隨著時間的延長,3 組實驗均可降低大鼠的肺功能。實驗結(jié)束時,C 組大鼠肺組織病理損傷評分、肺組織及血漿中的IL-1β、TNF-α 的含量高于T 組;而肺功能則比T 組降低;說明CPB后導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致肺損傷。IR 組與C 組及T 組比較,大鼠Lac 濃度高于其他兩組,大鼠的組織氧供及代謝情況比其他兩組差;肺組織及血漿中的IL-1β、TNF-α 的含量,IR 組>C 組>T 組,而肺組織病理改變及肺功能下降程度,IR 組>C 組>T 組,表明IR 組左肺組織在左肺動脈開放后遭受CPB 全身炎癥反應(yīng)和血再灌注損傷的雙重打擊,大鼠全身炎癥反應(yīng)及肺組織損傷比其他兩組嚴重,能模擬臨床CPB 肺損傷的病理生理改變,大鼠單肺CPB 肺損傷自創(chuàng)模型成功建立。

    大鼠的肺臟位于胸腔中部,分為左、右兩部分。與人類解剖結(jié)構(gòu)不同,大鼠左肺為一個大葉,右肺分為4 葉(前葉、中葉、副葉、后葉),本實驗經(jīng)左側(cè)第4 肋間開胸可直接暴露左肺門,易于夾閉。另外,實驗中夾閉肺門采用的是自制的小動物專用門脈閉合鑷,能夠輕松夾閉和開放肺門,減輕夾閉肺門時導(dǎo)致的損傷,利于動物的存活。在預(yù)實驗中,筆者發(fā)現(xiàn)本實驗的氣管導(dǎo)管(16 G 靜脈留置套管)沒用套囊,在機械通氣過程中易漏氣,致腹腔壓力增高、影響肺擴張,嚴重時可造成血流動力學的劇烈改變;經(jīng)留置胃管后能很好地避免該類相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生。實驗中常規(guī)肌松劑的使用易導(dǎo)致尿儲留,留置尿管后能改善尿液引流,更易于液體的平衡管理。同時,術(shù)中通過動脈血氣分析結(jié)果調(diào)節(jié)大鼠內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,定時(間隔30~45 min)給予鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛和肌松藥來維持麻醉深度,以及實時監(jiān)測和調(diào)控大鼠的血壓、心率和體溫,極大程度地模擬臨床CPB 術(shù)中的管理。

    綜上所述,本自創(chuàng)實驗?zāi)P统晒δM臨床CPB 肺損傷的病理生理變化,適用于體外循環(huán)肺損傷及其機制的實驗研究,有助于推動體外循環(huán)肺保護的研究。

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