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    氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)小鼠急性肝損傷的代謝物及相關(guān)代謝通路的研究*

    2020-03-10 06:58:22馬小芬蘇比努爾巴克李珍李德龍馬曉麗
    關(guān)鍵詞:嘌呤代謝物組學(xué)

    馬小芬,蘇比努爾·巴克,李珍,李德龍,馬曉麗

    (新疆醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830011)

    急性肝損傷是引起肝硬化、肝癌的重要因素[1],四氯化碳CCl4誘導(dǎo)的肝損傷是經(jīng)典的肝損傷模型之一[2-5],其損傷肝細(xì)胞的主要機(jī)制是通過強(qiáng)氧化性自由基及脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生,造成肝臟組織損傷[6]。如何從代謝組學(xué)角度研究CCl4導(dǎo)致急性肝損傷的作用機(jī)制,發(fā)現(xiàn)致毒標(biāo)志物將有助于對(duì)這一經(jīng)典肝毒性物質(zhì)的中毒機(jī)制的認(rèn)識(shí)。

    目前,基于高分辨核磁共振[7](nuclear magnetic resonance, NMR)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)[8]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)等[9]代謝組學(xué)分析技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于標(biāo)志物的篩查和分析[10]及疾病診斷、毒理學(xué)研究、新藥研發(fā)與藥物篩選等[11],其中GC-MS 被認(rèn)為是分析組織代謝產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)之一[12]。本文應(yīng)用GC-MS代謝組學(xué)技術(shù)探尋CCl4致小鼠急性肝損傷的肝組織代謝標(biāo)志物;運(yùn)用Metabo Analyst 3.0 在線代謝組分析工具進(jìn)行基于偏最小二乘判別分析(partial least squares-discrimination analysis, PLS-DA)的代謝物查找及代謝通路分析。

    1 材料與方法

    1.1 儀器與試劑

    1.1.1 儀器GC-MS聯(lián)用儀(GC:waters, MS:Agilent 7683B series)、可視氮吹儀、KQ-500DE 型超聲儀(昆山超聲儀器有限公司),HH-S4恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠),低溫離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司),HV-3 靜音無(wú)油空壓機(jī)(濟(jì)南浩偉實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

    1.1.2 試劑 甲氧胺鹽酸鹽、N-甲基-(三甲基硅烷基)-三氟乙酰胺(MSTFA)、三甲基一氯硅烷(TMCS)、分析純、十七烷酸(美國(guó)Sigma 公司),甲醇、乙腈(美國(guó)Fisher chemicals 公司),色譜純、吡啶(天津大茂化學(xué)試劑廠,生產(chǎn)批號(hào):20150612),分析純、實(shí)驗(yàn)用水取自新疆醫(yī)科大學(xué)超純水。

    1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

    SPF 級(jí)雄性昆明種小鼠,體重(20.0±2.0)g,由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供,所有動(dòng)物飼養(yǎng)按照國(guó)家動(dòng)物實(shí)驗(yàn)規(guī)定執(zhí)行。將適宜喂養(yǎng)的22 只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組,每組11 只。對(duì)照組和模型組小鼠適應(yīng)性灌胃生理鹽水0.5 ml 3 d 后,模型組腹腔注射0.1% CCl4橄欖油溶液10 ml/kg,對(duì)照組腹腔注射生理鹽水橄欖油溶液10 ml/kg。小鼠于模型復(fù)制后禁食不禁水12 h,立即斷頸處死,快速取出 完整肝臟,生理鹽水洗盡殘血,除去結(jié)締組織,濾紙拭干,稱重;準(zhǔn)確稱取0.50 g 肝臟,按1 ∶9(g ∶ml)加入冰生理鹽水,冰浴下手動(dòng)勻漿,4 000 r/min 離心5 min,分離得到10%肝勻漿上清液,置入-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3 肝組織病理切片

    取小鼠左葉相同位置肝組織,用4℃生理鹽水沖盡殘血,濾紙拭干,10%中性甲醛固定,石蠟包埋,切片,蘇木精-伊紅染色,光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織切片的病理形態(tài)學(xué)變化。

    1.4 GC-MS 代謝組學(xué)分析

    1.4.1 樣品前處理 參考文獻(xiàn)[13-14]將置于-80℃冷凍保存的樣品復(fù)溶后取100 μl 置于2 ml EP 管內(nèi),加入250 μl 乙腈溶液混勻,渦旋1.5 min,冰浴超聲10 min,4℃、10 000 r/min 離心10 min 后,取上清液置于2 ml EP 管內(nèi)用氮吹干。加15 g/L 甲氧胺吡啶溶液50 μl 混勻,70℃下肟化1 h 后加入衍生化試劑(MSTFA ∶TMCS=100 ∶1)50 μl 混勻,靜止。1 h后加含十七烷酸的乙腈溶液(0.9 mg/ml)150 μl 混勻,4℃、10 000 r/min 離心10 min,取上清液于內(nèi)插管內(nèi)置于微量進(jìn)樣瓶待測(cè)。

    1.4.2 GC-MS 條件 升溫程序?yàn)椋?5℃保持5 min后,以10℃/min 上升至300℃,保持10 min;進(jìn)樣量:2 μl,不分流進(jìn)樣;進(jìn)樣口溫度:270℃;接口溫度:270℃;離子源溫度:230℃;電離電壓:70 eV;四極桿溫度:150℃;載氣:高純氦氣,1.0 ml/min;掃描方式:全掃描60~600 m/z。每次進(jìn)樣時(shí)均用甲醇和乙腈清洗進(jìn)樣針各4 次,避免前一次樣品影響結(jié)果。

    1.4.3 GC-MS 圖譜數(shù)據(jù)處理 GC-MS 的總粒子流圖(TIC)中共有的峰和具有代表性的峰被提取出來,并對(duì)所有的峰進(jìn)行手動(dòng)峰面積積分,獲取各個(gè)峰與內(nèi)標(biāo)峰的保留時(shí)間及峰面積導(dǎo)入Excel 表內(nèi)備用,用樣品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰的比值(相對(duì)峰面積)表示代謝物的含量。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 和Metabo Analyst 3.0 統(tǒng)計(jì)軟件,對(duì)歸一化后峰面積相對(duì)值導(dǎo)入SIMCA-P12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行PLS-DA 分析[15],最大化地顯示出組間的差異。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,比較采用t檢驗(yàn),P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用PLS-DA 模型中變量重要性投影(variable importance in the projection, VIP)和兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)來共同評(píng)價(jià)可能的內(nèi)源性代謝物相對(duì)峰面積的差異,只有同時(shí)滿足VIP>1 和P<0.05 的代謝物才被認(rèn)為是潛在生物學(xué)標(biāo)志物[16-17]。

    2 結(jié)果

    2.1 CCl4 急性肝損傷模型病理變化

    對(duì)照組小鼠肝組織病理切片與模型組比較,模型組小鼠的肝細(xì)胞排列紊亂,部分肝細(xì)胞內(nèi)見大小不等的脂滴空泡,另有部分區(qū)域小葉內(nèi)肝細(xì)胞點(diǎn)狀、灶狀滑絲,伴有碎片狀肝細(xì)胞浸潤(rùn),肝中央靜脈及肝血竇充血,壞死灶區(qū)有較多淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖1。

    2.2 GC-MS 結(jié)果

    2.2.1 NIST 圖譜中各代謝物圖譜 通過XCMS Online 軟件進(jìn)行肝組織樣品數(shù)據(jù)采集,得到各組典型TIC,通過TIC 中提取的峰面積一一在NIST 譜庫(kù)中進(jìn)行對(duì)比找到33 種共有代謝物質(zhì),通過參照文獻(xiàn)[18]進(jìn)行查詢比對(duì)出14 種可能的內(nèi)源性代謝物。見圖2。

    2.2.2 PLS-DA 結(jié)果 歸一化后峰面積相對(duì)值的PLS-DA 分析結(jié)果見圖3,可看出模型組各小鼠間比較分散,這可能是模型復(fù)制后個(gè)體差異造成的。3D圖中對(duì)照組與模型組兩組間有差異,且具有明顯的聚類特征。表明小鼠肝組織的生理環(huán)境及物質(zhì)代謝發(fā)生變化可能是CCl4致肝損傷[19]。

    圖1 CCl4 誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠肝組織的組織病理學(xué)觀察 (HE×400)

    圖2 GC-MS 各代謝物質(zhì)譜圖譜

    2.2.3 差異性代謝物及潛在生物學(xué)標(biāo)志物 根據(jù)對(duì)照組和模型組內(nèi)源性代謝物相對(duì)峰面積的差異,分析發(fā)現(xiàn)5 種可能的差異性代謝物(P<0.05),包括葡萄糖醛酰胺、D-酪氨酸、腺嘌呤、D-葡萄糖和麥角固醇。由表中的VIP>1 同時(shí)結(jié)合t檢驗(yàn)結(jié)果可以說明這5種代謝差異物是CCl4肝損傷的可能潛在代謝標(biāo)志物。見表1。

    2.2.4 通路分析 將10個(gè)通過模式識(shí)別篩選出的差異代謝物導(dǎo)入Metabo Analyst 3.0 網(wǎng)站進(jìn)行代謝通路分析??芍狢Cl4模型復(fù)制后主要對(duì)機(jī)體的甲硫氨酸代謝、苯丙氨酸代謝、嘌呤代謝等代謝通路產(chǎn)生影響。見 圖4。

    圖3 兩組小鼠肝組織樣品3D PLS-DA 得分圖

    表1 與CCl4 誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷相關(guān)的差異代謝物

    圖4 兩組差異代謝物引起的代謝通路變化

    3 討論

    本研究采用GC-MS 技術(shù)對(duì)CCl4所致急性肝損傷小鼠進(jìn)行肝組織的代謝組學(xué)研究。采用PLS-DA 等多元分析模式識(shí)別方法及傳統(tǒng)的SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)進(jìn)行分析,共篩選出5個(gè)生物標(biāo)志物,分別是葡萄糖醛酰胺、D-酪氨酸、腺嘌呤、D-葡萄糖、麥角固醇。經(jīng)Metabo Analyst 3.0 數(shù)據(jù)分析,CCl4所致急性肝損傷小鼠主要對(duì)機(jī)體的甲硫氨酸代謝、苯丙氨酸代謝、嘌呤代謝等代謝通路產(chǎn)生影響。

    CCl4是一種經(jīng)典的肝毒藥物,從代謝組學(xué)角度找出一些具有特異性變化規(guī)律的代謝物,全面揭示其生物效應(yīng)。小鼠經(jīng)CCl4模型復(fù)制后,肝組織切片表明其肝細(xì)胞明顯壞死,表明小鼠肝組織的生理環(huán)境及物質(zhì)代謝發(fā)生變化可能是CCl4致肝損傷[19]。對(duì)肝臟組織中的代謝物查找發(fā)現(xiàn)其肝臟組織損傷主要表現(xiàn)在能量供給阻礙,以及氨基酸代謝紊亂,小鼠肝細(xì)胞循環(huán)受到抑制,并且由于脂蛋白合成受阻,是脂肪酸從肝臟到血漿的分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)能明顯下降。特別是肝組織中酪氨酸物質(zhì)含量下降,這種結(jié)果很可能是由于氨基酸在肝臟的轉(zhuǎn)運(yùn)受到阻礙,因此其相互轉(zhuǎn)化受阻,其直接的表現(xiàn)為參與機(jī)體能量代謝的相關(guān)通路和循環(huán)比如苯丙氨酸代謝通路及三羧酸循環(huán)受到抑制,進(jìn)而引發(fā)一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng),最終表現(xiàn)出肝衰竭的相應(yīng) 表征。

    苯丙酸屬于芳香族氨基酸是苯丙酮酸和酪氨酸的主要合成原料,均在苯丙氨酸代謝通路中有著重要作用,機(jī)體內(nèi)酪氨酸的含量會(huì)引起某些代謝中間產(chǎn)物的變化而導(dǎo)致肝功能損傷或腎小管缺陷。甲硫氨酸是含硫必需氨基酸,機(jī)體內(nèi)甲硫氨酸不足會(huì)使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成受到影響,進(jìn)而引起肝功能障礙。YADAK等[20]研究發(fā)現(xiàn)嘌呤脫氧核苷可導(dǎo)致肝臟發(fā)生毒性,嘌呤脫氧核苷在機(jī)體內(nèi)的變化最終體現(xiàn)在嘌呤代謝通路中。本研究中小鼠肝組織酪氨酸物質(zhì)含量下降及嘌呤代謝物變化可能與代謝通路間密切相關(guān),但具體影響急性肝損傷嘌呤代謝通路的物質(zhì)并不清楚,有待進(jìn)一步深入研究。

    本研究成功地將代謝組學(xué)分析方法引入急性肝損傷的研究中,并通過在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析影響肝臟病理變化的相關(guān)代謝通路,為深入探討急性肝損傷模型的作用機(jī)制奠定了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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