菌酶融合工藝制作高肽發(fā)酵豆粕的研究及高肽發(fā)酵豆粕在保育料中替代魚粉的應(yīng)用

王曉明 毛 悅 唐香山 鄧 敦 舒劍成 羅 杰 李 慧

（唐人神集團股份有限公司，湖南株洲 412000）

大豆及其加工副產(chǎn)品因具有較高營養(yǎng)價值而被廣泛應(yīng)用于食品和飼料工業(yè)。 豆粕作為大豆主要副產(chǎn)品之一， 是非常優(yōu)秀的畜禽植物蛋白飼料原料，蛋白質(zhì)占40～48%，脂肪占1～2%，碳水化合物占10～15%，并含有多種礦物質(zhì)、維生素和必需氨基酸，在畜禽日糧中廣泛使用。

但豆粕中也還有很多抗?fàn)I養(yǎng)因子， 比如蛋白酶抑制因子、不良寡糖、抗原蛋白等，嚴(yán)重限制了其在幼齡動物上的應(yīng)用。從二十世紀(jì)初期開始，人們就對大豆中抗?fàn)I養(yǎng)因子進行研究， 隨著科技的發(fā)展， 應(yīng)用發(fā)酵或體外酶解的方法消除豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高豆粕的消化率，從而替代或部分替代日益看漲的動物蛋白（魚粉、血漿蛋白等）已經(jīng)成為人們研究的熱點。 本文將利用體外酶解和發(fā)酵聯(lián)合處理的方法， 研究出一種制作高肽發(fā)酵豆粕的生產(chǎn)工藝， 并研究此發(fā)酵豆粕在保育料中替代魚粉的應(yīng)用。

1 材料與方法

豆粕顏色淺黃色，烤大豆香味，呈不規(guī)則碎片狀，不含過量雜質(zhì)，粗蛋白46.08%（實測）。

堿性蛋白酶（2.4AU/g，諾維信）、風(fēng)味蛋白酶（500LAPU/g，諾維信），中性蛋白酶(0.8AU/g，諾維信)、酸性蛋白酶(10 萬U/g)、植物乳桿菌（實驗室篩選菌株）。

試劑：氫氧化鈉、丙烯酰胺、無水酒精、甘氨酸、Tris、考馬斯亮藍R250、甲醇、冰醋酸、甘油、β-疏基乙醇、溴酚蘭、鹽酸、正丙醇、正磷酸等。

儀器：電泳儀、電泳槽、高速離心機、微量進樣器、移液槍、PH 計、硅膠板、層析缸、烘箱、噴霧干燥機。

1.4.1 實驗室指標(biāo)

（1）水分：參照GB/T 6435-2014 飼料中水分的測定；

（2）粗蛋白：參照GB/T 6432-1994 飼料中粗蛋白測定方法；

（3）酸溶蛋白（小肽）：參照GB/T 22492-2008大豆肽粉；

（4）大豆抗原蛋白定性檢測：聚丙烯酰胺凝膠電泳法（SDS-PAGE）；按照常規(guī)方法配置12%的分離膠和5%的濃縮膠。取酶解豆粕烘干樣品1.0g， 加入20.00ml 0.03mol/L 的Tris-Hcl（ph=8，包括0.01mol/L 的β-巰基乙醇）在室溫下浸泡1 小時（每10 分鐘攪拌一次），然后10000rpm 下離心20 分鐘，取上清液40 微升， 加入10 微升5×樣品緩沖液（5×loading buffer 藍色），沸水浴5 分鐘，然后取10 微升點樣，進行SDS-PAGE 電泳；

（5）發(fā)酵豆粕中不良寡糖定性檢測：薄板層析法（TLC）；

利用不同大小的糖分子在硅膠板上的擴散速度的大小不同，將發(fā)酵豆粕中的寡糖分開。

①分別稱取寡糖標(biāo)樣0.01g 溶于80%的乙醇溶液中，4℃保藏備用。

②準(zhǔn)確稱取發(fā)酵豆粕樣品5.00g 于250ml 三角瓶中， 加入50ml 80%的乙醇溶液，70℃水浴浸提1h。取2ml 浸提液，10000rpm 離心10min，4℃保藏備用。

③在預(yù)制硅膠板上點樣，點樣量為5 微升，點樣干燥后在展開液中展開， 展開至離硅膠板前沿2cm 處。 自然晾干后，噴淋顯色液，在140℃下烘5min 顯色。

1.4.2 動物實驗指標(biāo)

平均日采食量、平均日增重、料肉比、腹瀉率

2 結(jié)果與分析

本實驗通過一系列單因素試驗研究了堿性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶對豆粕中抗原蛋白、酸溶蛋白及酶解液味道的影響，并在單因素的基礎(chǔ)上做了復(fù)合酶試驗及菌酶融合聯(lián)合處理試驗， 最終確定高肽發(fā)酵豆粕制作工藝如下：

豆粕進行超微粉碎→加入自來水， 料水比為1:10→滅菌處理（80℃處理30min）→加入20%的NaOH 溶液， 把酶解液的初始PH 值調(diào)節(jié)為8.0→加入0.5%堿性蛋白酶、1%風(fēng)味蛋白酶和0.1%中性蛋白酶（酶添加量以豆粕計）， 保溫50℃酶解4h→加入5%植物乳桿菌菌液和0.1%酸性蛋白酶，37℃發(fā)酵48h→低溫干燥→發(fā)酵豆粕T （高肽發(fā)酵豆粕）

2.2.1 抗原蛋白去除結(jié)果

大豆抗原蛋白指大豆蛋白中能夠刺激機體產(chǎn)生抗體，并能與這些抗體結(jié)合，引起特異性免疫反應(yīng)的物質(zhì)。 大豆種子蛋白中， 大豆球蛋白約占40%，β-伴大豆球蛋白約占30%，α-伴大豆球蛋白約占15%，γ-伴大豆球蛋白約占3%，其中能引起仔豬過敏反應(yīng)的主要是大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白。 大豆球蛋白是一種沉淀系數(shù)為11S 的球蛋白，β-伴大豆球蛋白是7S 球蛋白， 其中大豆球蛋白主要由酸性亞基A1、A2、A3、A4 和堿性亞基Basic 組成，β-伴大豆球蛋白主要由亞基α’、α 和β 組成。

由圖1 知，使用新工藝生產(chǎn)的發(fā)酵豆粕T 中的抗原蛋白已經(jīng)被全部去除掉， 效果優(yōu)于目前市售的發(fā)酵豆粕、酶解豆粕和膨化大豆。

2.2.2 新工藝生產(chǎn)的發(fā)酵豆粕中的酸溶蛋白含量和不良寡糖去除情況

表1 發(fā)酵豆粕T 中的酸溶蛋白含量

由表1 和圖2 知， 目前市售的發(fā)酵豆粕中的酸溶蛋白含量在8%左右，而使用菌酶聯(lián)合處理生產(chǎn)的發(fā)酵豆粕T 中的酸溶蛋白含量可以達到36.5%，而且發(fā)酵豆粕T 中的水蘇糖和棉子糖也被全部去除掉了。

由以上實驗結(jié)果知， 使用菌酶融合工藝生產(chǎn)的發(fā)酵豆粕T， 其酸溶蛋白含量可以達到36.5%（是目前市售發(fā)酵豆粕的4 倍）， 而且其中的大豆抗原蛋白和不良寡糖也被全部去除。

選擇8～9kg 保育豬150 頭，按體重相近、性別一致原則隨機分為2 個處理組， 每個處理5 個重復(fù)，每個重復(fù)15 頭豬。分別飼喂兩種試驗日糧：對照組（魚粉組），實驗組（使用發(fā)酵豆粕T 替代魚粉）。 試驗期間，安排專人負責(zé)飼養(yǎng)，自然通風(fēng)，自由采食飲水，保持欄舍清潔衛(wèi)生。試驗過程中發(fā)現(xiàn)試驗豬生病，及時治療，3 天內(nèi)不能康復(fù)即淘汰，進行為期12 天試驗。

由表3 知， 對照組和實驗組之間的平均日采食量、 平均日增重、 料肉比和腹瀉率沒有明顯差異，而且實驗組的平均日增重還略高于對照組，料肉比也降低了0.12。

試驗結(jié)果表明，在保育料中可以使用4%的發(fā)酵豆粕T 替代3%的魚粉，而不會降低仔豬的生長性能。

3 結(jié)論

本實驗研究了菌酶融合制作高肽發(fā)酵豆粕的新工藝，經(jīng)過新工藝制作出的高肽發(fā)酵豆粕，不僅可以去除豆粕中的抗原蛋白和不良寡糖， 而且使豆粕中酸溶蛋白含量由2%提高到了36.5%（是普通發(fā)酵豆粕酸溶蛋白含量的4 倍）。 經(jīng)過動物實驗， 在保育料中可以用4%的發(fā)酵豆粕T 替代3%的魚粉，而不會降低仔豬的生長性能。

表2 日糧原料組成及主要營養(yǎng)指標(biāo)

表3 不同試驗料對保育豬生長性能的影響

參考文獻（略）