偃松松塔多糖的單糖組成分析及活性研究

李子江, 劉 慰, 吳 磊, 王 丹, 司傳領(lǐng)*

(1.天津科技大學(xué) 天津市制漿造紙重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300457； 2.山東商業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,山東濟(jì)南 250103； 3.江西省科學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所,江西 南昌 330096； 4.中國林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所;江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210042)

偃松(Pinuspumila(Pall.) Regel)，又稱日本石松、西伯利亞矮松樹或Haimatsu,是分布在中國東北部、日本北部、韓國北部、耶尼斯河和東西伯利亞海拔1 000～2 300 m的特有植物[1-2]。偃松種子、芽、枝條、針葉、油樹脂和根部在東北亞民間藥物中被用于治療神經(jīng)痛、皮膚病、風(fēng)濕病、黃癬、關(guān)節(jié)炎和肺結(jié)核等疾病[3]，以及制備利尿劑與驅(qū)蟲藥。從偃松的松脂中可分離出單萜、二萜和三萜類化合物[4-6]，偃松松塔一直作為副產(chǎn)物，附加值較低，不僅浪費(fèi)生物資源，而且嚴(yán)重污染環(huán)境，而松塔富含蛋白質(zhì)、多糖和多酚等生物活性物質(zhì)[7]。多糖是一種高分子聚合物，常見于植物、動(dòng)物和微生物中，不僅對(duì)生物的生長發(fā)育起著重要作用，而且具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤和抗炎等生物活性[8-10]。大多數(shù)多糖是相對(duì)無毒的，不會(huì)產(chǎn)生副作用。因此，利用多糖開發(fā)無毒天然食品和食品添加劑引起了食品和制藥行業(yè)研究人員的極大興趣。本課題組在前期的研究中，采用95%乙醇從松塔中提取并通過柱色譜分離得到7個(gè)甾醇和木脂素類物質(zhì)，在此基礎(chǔ)上，利用提取后的殘?jiān)?，采用熱水提取、噴霧干燥以及醇沉等方法，制備松塔多糖，通過Sevag法脫除蛋白、然后再用過氧化氫和活性炭相結(jié)合的方法對(duì)多糖進(jìn)行脫色純化處理，最后再進(jìn)行純化后多糖的結(jié)構(gòu)表征以及活性的測(cè)定，以期為偃松松塔后期的綜合開發(fā)利用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

偃松松塔，2018年1月采集于黑龍江省大興安嶺，由中國林業(yè)科學(xué)院林業(yè)研究所的王軍輝研究員鑒定為偃松(Pinuspumila(Pall.) Regel)。植物樣本PPC-20180101存放于天津科技大學(xué)天津市制漿造紙重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本室。

阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖購自阿拉丁試劑股份有限公司；二苯基苦基肼(DPPH)標(biāo)準(zhǔn)品，2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑- 6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、脂多糖(LPS)、二甲基亞砜(DMSO)以及甲氮甲唑藍(lán)(MTT)均購于Sigma公司；胰蛋白酶、RPMI 1640培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS，pH值7.4)和胎牛血清均購于Gibco公司；肌醇、三氟乙酸、鹽酸羥胺、吡啶、醋酸酐、苯酚、硫酸、N-1-萘乙二胺鹽酸鹽和對(duì)氨基苯磺酰胺等試劑，均為市售分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FDU-1200型冷凍干燥機(jī)，日本東京理化公司；TD6A-WS PPR型,Sykam S501 Series 高效液相色譜儀,S-3250 示差檢測(cè)器,TSKG5000色譜柱(300 mm×7.8 mm),Sykam色譜工作站，德國賽卡姆；GC-2010型氣相色譜儀，Shimadzu公司；FID氣相色譜檢測(cè)器，WondaCap5型毛細(xì)管柱(0.25 mm×30.0 m×0.25 μm)；YC-1800型實(shí)驗(yàn)室低溫噴霧干燥機(jī)，上海雅程儀器設(shè)備有限公司；Tecan infinite M200 PRO型酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司；FTIR-7600型傅里葉紅外光譜儀，Lambad公司；KQ-500B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；MCO-15AC型二氧化碳培養(yǎng)箱，日本Sanyo公司。

1.3 偃松松塔多糖的制備

1.3.1偃松松塔粗多糖提取 按文獻(xiàn)[11]方法操作，將陰干的4 000.00 g偃松松塔粉碎至0.075 mm，以95%乙醇超聲波提取3次，料液比1 ∶10(g ∶L)，每次2 h，將所得到的偃松松塔渣在烘箱中烘干，去除乙醇?xì)埩?。所得松塔渣采用蒸餾水作為提取用的溶劑，松塔渣和蒸餾水的比例為1 ∶50(g ∶mL)，在100 ℃ 下用熱回流提取兩次，提取時(shí)間為2 h/次，離心，取上清液。將噴霧干燥機(jī)的入風(fēng)口溫度設(shè)為125 ℃，出風(fēng)口溫度設(shè)為85 ℃，壓強(qiáng)0.4 MPa，然后加入上清液進(jìn)行操作，得到偃松松塔的粗提物。所得偃松松塔粗提物在熱水中復(fù)溶，將4倍體積的95%乙醇水溶液與其混合在一起，攪拌均勻，放置于4 ℃的冰箱中，第二天再進(jìn)行離心操作，收集多糖沉淀，先后用無水乙醇、丙酮、無水乙醚洗滌3次，隨后將得到的樣品冷凍干燥，制得偃松松塔粗多糖。

1.3.2偃松松塔多糖的純化 將所得偃松松塔粗多糖用熱水溶解，加入Sevage試劑(氯仿-正丁醇，體積比5 ∶1)，振蕩1 h，靜置分層，保留上層液體，重復(fù)3次。上層液體經(jīng)減壓濃縮除去殘留的Sevage試劑，把溶液的pH值調(diào)整為9，分別取占溶液體積10%的雙氧水和溶液質(zhì)量2%的活性炭加入其中，在150轉(zhuǎn)/min、 50 ℃條件下充分振蕩3 h，隨后上旋蒸儀。取截留分子質(zhì)量為 3 000 u 的透析袋，把抽濾濃縮后的溶液裝入其中，先用自來水透析，再用蒸餾水透析，時(shí)間均為48 h，冷凍干燥后得到純化偃松松塔多糖(PPCP)[12]。

1.4 多糖的含量測(cè)定及結(jié)構(gòu)表征

1.4.1多糖含量測(cè)定 使用苯酚-硫酸法[13]在490 nm處測(cè)定吸光值，以葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算多糖含量。

1.4.2紅外光譜分析 按照文獻(xiàn)[14]取KBr(光譜純)少許，置于160 ℃環(huán)境下6 h烘干，而后置于干燥器中，備用。采用KBr壓片法，取多糖樣品2.0 mg，KBr 150.0 mg。紅外燈照射下于瑪瑙研缽中輕輕研磨，將多糖樣品和溴化鉀晶體充分研磨并混合均勻。將得到的樣品上壓片機(jī)，壓成透明的薄片，進(jìn)行背景采集后，在400～4000 cm-1紅外光區(qū)，用顯微紅外光譜儀進(jìn)行掃描。

1.4.3標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生物的制備 取6支10 mL具塞試管，分別放入10 mg準(zhǔn)確稱取的鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的標(biāo)準(zhǔn)品，添加10 mg的鹽酸羥胺和內(nèi)標(biāo)8 mg，加吡啶0.5 mL，振蕩搖勻，90 ℃水浴中加熱反應(yīng)30 min,間歇振蕩。取出后冷卻至室溫，加醋酸酐0.5 mL，90 ℃下繼續(xù)反應(yīng)30 min。70 ℃水浴中將反應(yīng)產(chǎn)物旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加1 mL氯仿振蕩溶解，取樣進(jìn)行氣相色譜分析。

1.4.4分子質(zhì)量測(cè)定 PPCP的分子質(zhì)量采用高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。流動(dòng)相為0.1 mol/L的PBS(pH值 7.2)，流速0.5 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL，運(yùn)行時(shí)間20 min，以標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖的保留時(shí)間和分子質(zhì)量各取自然對(duì)數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算純化多糖的分子質(zhì)量。

1.4.5多糖的水解和衍生化 稱取PPCP(50.0 mg)放入密封玻璃管中，在100 ℃下用5 mL的4 mol/L三氟乙酸(TFA)進(jìn)行水解6 h，取出于70 ℃真空減壓濃縮至干。水解后的PPCP樣品，按照1.5.2節(jié)方法將單糖衍生化。

1.4.6氣相色譜分析 取衍生化后的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品用氣相色譜檢測(cè)。氮?dú)?0.0 mL/min；氫氣40.0 mL/min；空氣400 mL/min，進(jìn)樣壓力100.0 kPa；進(jìn)樣溫度240 ℃；檢測(cè)器溫度260 ℃；柱溫 140 ℃ 保留3 min，以10 ℃/min的速度增加到240 ℃，最后保持15 min；進(jìn)樣體積為1 μL。

1.5 多糖抗氧化活性測(cè)定

1.5.1清除DPPH自由基的能力 根據(jù)文獻(xiàn)[15]方法稍作修改，將200 μmol/L的DPPH溶液100 μL先后加入到100 μL不同濃度的樣品溶液中，將混合物搖勻，在黑暗中靜置30 min。在這個(gè)試驗(yàn)中，抗壞血酸(Vc)被用作陽性對(duì)照。用酶標(biāo)儀在517 nm處測(cè)定吸光度，測(cè)定時(shí)每份樣品都取平行操作3次后的平均值，計(jì)算DPPH自由基(DPPH·)清除率：

Y(DPPH·)=(A3-A1+A2)/A3×100%

式中：Y(DPPH·)—清除率，%；A1—DPPH溶液與樣品液混合后的吸光度；A2—樣品液與提取溶劑混合后的吸光度；A3—DPPH溶液與提取溶劑混合后的吸光度。

1.5.2清除ABTS自由基的能力 按照文獻(xiàn)[16]稍作修改，制備ABTS儲(chǔ)備液。將等體積的7 mmol/L的ABTS溶液(用pH值7.4的PBS進(jìn)行配制)和2.45 mmol/L過硫酸鉀充分混勻，在室溫且避光的條件下反應(yīng)12～16 h，用PBS將ABTS儲(chǔ)備液進(jìn)行稀釋，使其在734 nm波長處吸光度為0.66±0.03。取96孔透明酶標(biāo)板，分別加上20 μL不同濃度的多糖溶液，再取濃度為0.2 mmol/L的ABTS儲(chǔ)備液各150 μL 加入其中，對(duì)照PBS，在室溫下放置10 min，測(cè)定其517 nm下的吸光度，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，每次3組平行，取平均值，計(jì)算ABTS自由基(·ABTS+)清除率。

Y(·ABTS+)=(A0-A)/A0×100%

式中：Y(·ABTS+)—清除率，%；A0—ABTS+工作液與PBS混合后的吸光度；A—ABTS+工作液與樣品液混合后的吸光度。

1.5.3Fe3+還原能力 按照文獻(xiàn)[17]稍作修改，向2 mL的離心管中依次分別加入0.2 mL不同濃度多糖溶液，0.5 mL PBS(0.2 mol/L pH值6.6)，0.5 mL鐵氰化鉀(1%)，混合充分，在50 ℃ 水浴中反應(yīng)20 min，取出離心管，然后加入0.5 mL的三氯乙酸(10%)，振蕩混勻后靜置10 min，吸取上述離心管中反應(yīng)后的溶液0.5 mL加入新的離心管，分別向新的離心管中依次加入0.5 mL蒸餾水和0.1 mL 的三氯化鐵(0.1%)，振蕩混勻后靜置10 min，分別吸取200 μL加入到96孔板中，采用酶標(biāo)儀在波長700 nm下測(cè)量吸光度。Vc作陽性對(duì)照，3次平行實(shí)驗(yàn)，取平均值，吸光度越大，說明多糖還原能力越強(qiáng)。

1.6 多糖的免疫調(diào)節(jié)活性

1.6.1細(xì)胞培養(yǎng)和藥液配制 小鼠巨噬細(xì)胞系RAW 264.7用RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含有10%胎牛血清(56 ℃水浴中滅活30 min)、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2，每2～3天更換一次培養(yǎng)基。當(dāng)融合率達(dá)80%，細(xì)胞傳代培養(yǎng)。將PPCP與DMSO混合，用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋成DMSO不超過0.1%的供試藥液[17]。

1.6.2細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn) 采用傳統(tǒng)的MTT實(shí)驗(yàn)法[18]測(cè)定了PPCP對(duì)原代RAW 264.7細(xì)胞活力的影響，對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞在96孔板上以1×106個(gè)細(xì)胞/孔接種。18 h后，向懸浮液中加入不同濃度的PPCP，培養(yǎng)24 h，抽吸上清液，加入100 μL MTT溶液(0.5 g/L)繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞3 h，然后向96孔板中加入100 μL MTT停止液(10%十二烷基磺酸鈉(SDS)，0.01 mol/L)，繼續(xù)進(jìn)行16～20 h的培養(yǎng)，在550 nm處用酶標(biāo)儀測(cè)定其吸光度，實(shí)驗(yàn)平行做3次，通過計(jì)算得到細(xì)胞的相對(duì)存活率。細(xì)胞相對(duì)存活率=(實(shí)驗(yàn)組孔吸光度-空白組孔吸光度)/(對(duì)照組孔吸光度-空白組孔吸光度)×100%。

1.6.3對(duì)RAW 264.7細(xì)胞NO分泌的影響 取96孔板，將RAW 264.7細(xì)胞以1×106細(xì)胞/孔的比例接種。18 h后，在懸浮液中加入不同濃度的PPCP，然后孵育24 h。設(shè)置陽性對(duì)照組，為加入1 mg/L LPS處理的細(xì)胞。用Griess法[19]測(cè)定細(xì)胞上清液中一氧化氮的分泌量。NaNO2用作標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算NO的濃度。

1.7 數(shù)據(jù)處理方法

所有試驗(yàn)均進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，重復(fù)3次，結(jié)果顯示有平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，P<0.05 認(rèn)為有顯著性差異，P>0.05則無顯著性差異。數(shù)據(jù)分析和處理采用Excel 2013及Sigmaplot 10.0軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 偃松松塔多糖的提取與純化

圖1 PPCP的紅外光譜圖Fig.1 IR spectra of polysaccharides of P.pumila cones(PPCP)

偃松松塔粗多糖和純化多糖的質(zhì)量分別為123.18和69.24 g，經(jīng)計(jì)算兩者的得率分別為3.08%和1.73%，純化多糖經(jīng)苯酚-硫酸法測(cè)得梯度葡萄糖的吸光值，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為：Y=0.003 1X+0.018 2，R2=0.999 3，其中Y為吸光度，X為濃度。測(cè)得偃松松塔多糖(PPCP)純度為68.78%，這可能由于在多糖純化過程中，選擇了單一的純化方式，所得純化的多糖中可能還含有大分子物質(zhì)和微粒，如水溶性高聚物、殘留蛋白質(zhì)、多肽、核酸以及殘留色素等雜質(zhì)成分。

2.2 紅外光譜分析

2.3 單糖組成及其分子質(zhì)量分析

通過對(duì)7種標(biāo)準(zhǔn)單糖和偃松多糖樣品先后進(jìn)行氣相色譜分析。由圖2得知，多糖在此色譜下分離完全，有主要的4個(gè)峰。與混合標(biāo)準(zhǔn)單糖的色譜圖對(duì)照，偃松松塔多糖主要由阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖與未知單糖。14.96 min處的單糖由于缺少相應(yīng)單糖標(biāo)品，暫時(shí)未分析出來。通過峰面積之比得出，4種單糖的物質(zhì)的量比為2.33 ∶1.00 ∶2.20 ∶1.94。

1.鼠李糖rhamnose； 2.阿拉伯糖arabinose； 3.木糖xylose； 4.甘露糖mannose；5.葡萄糖glucose； 6.半乳糖galactose； 7.肌醇inositol

多糖的分子質(zhì)量有相對(duì)性的特征，可以代表平均分布的相似鏈長，一般都通過多糖分子質(zhì)量的大小來統(tǒng)計(jì)平均值[22]。通過高效液相凝膠色譜分析法，分別取葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和分子質(zhì)量，取其自然對(duì)數(shù)后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再測(cè)定其分子質(zhì)量。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和PPCP的保留時(shí)間，計(jì)算PPCP的分子質(zhì)量為189.65 ku。

2.4 偃松松塔多糖的體外抗氧化活性

2.4.1對(duì)DPPH·的清除效果 DPPH自由基(DDPH·)清除模型是評(píng)價(jià)多糖清除自由基能力的常用方法。DPPH·清除的抗氧化機(jī)理是基于DPPH·對(duì)氫的接受，從而將DPPH·轉(zhuǎn)化為非自由基形式(DPPH-H)。因此抗氧化活性是由于多糖的供氫能力[23-24]，多糖中的羥基對(duì)其抗氧化活性起著重要作用。偃松松塔多糖對(duì)DPPH·的清除作用如圖3(a)所示，0.02～2.0 g/L內(nèi)，PPCP對(duì)DPPH·清除活性表現(xiàn)出劑量依賴性且隨著濃度的增加逐漸增大，在質(zhì)量濃度為2 g/L時(shí)，PPCP對(duì)DPPH·清除率(79.72%)達(dá)到最大。王薇薇[24]報(bào)道的質(zhì)量濃度為10.0 g/L的紅松松塔多糖，經(jīng)過純化后的與未純化的清除DPPH·的效果差不多，都能達(dá)到清除率為80%的效果，與本研究相比略高，這可能由于偃松與紅松兩種植物本身的差異引起的。由此可見，偃松松塔多糖對(duì)DPPH·具有較強(qiáng)清除能力。

2.4.2對(duì)·ABTS+的清除效果 ABTS實(shí)驗(yàn)經(jīng)常被用來評(píng)價(jià)植物中單體化合物和混合物的總抗氧化能力。需要強(qiáng)調(diào)的是，體外活性只能在生物系統(tǒng)中被視為潛在相關(guān)，而體內(nèi)活性也取決于生物利用度和生物轉(zhuǎn)化[25]。本研究對(duì)多糖在0.02～2.0 g/L范圍內(nèi)的·ABTS+清除能力進(jìn)行了測(cè)定。從圖3(b)可知，當(dāng)質(zhì)量濃度在0.02～2.0 g/L，多糖清除·ABTS+的能力隨著濃度的增大而增強(qiáng)且清除能力較強(qiáng)，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到2.0 g/L時(shí)，清除率最大，達(dá)到39.63%，與對(duì)照組Vc對(duì)·ABTS+的清除能力相比，明顯較低。與Zhang等[20]研究的紅松松塔多糖對(duì)·ABTS+的清除能力相比也要弱，這可能是因?yàn)闃悠返牟町?，?dǎo)致其中多糖的種類、組分的不同以及含有的蛋白、多酚類物而引起的。

2.4.3Fe3+還原力的測(cè)定 Fe3+還原力包括還原能力、防止鏈起始、過渡金屬離子催化的結(jié)合、過氧化物的分解、防止繼續(xù)吸氫和自由基清除等各種機(jī)制，都被認(rèn)為是解釋抗氧化活性的原因[25]，偃松松塔多糖Fe3+還原能力如圖3(c)所示，化合物的還原能力可作為潛在指示劑，表示抗氧化性的強(qiáng)弱。偃松松塔粗多糖及純化后多糖在0.02～2.0 g/L內(nèi)，Vc與PPCP的還原能力隨著濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，溶液質(zhì)量濃度為2.0 g/L時(shí)，其還原能力分別達(dá)到最大，最大值分別為1.83和0.78。同一濃度下，與Vc還原能力相比，PPCP的還原能力較弱。

a.DPPH·; b.·ABTS+；c.還原力reducing power ability

2.5 偃松松塔多糖的生物活性

圖4 偃松松塔多糖對(duì)RAW 264.7細(xì)胞存活率與NO釋放的影響Fig.4 The effects of polysaccharide on cells viability and on NO production in RAW 264.7

2.5.1對(duì)細(xì)胞存活率的影響 采用MTT法測(cè)定多糖對(duì)RAW 264.7細(xì)胞存活率的影響，結(jié)果如圖4所示。與空白對(duì)照組相比(多糖為0 mg/L時(shí))，在給藥范圍(0～200 mg/L)內(nèi)，對(duì)偃松松塔多糖對(duì)細(xì)胞存活率基本上無影響。而在多糖質(zhì)量濃度為300 mg/L時(shí)，偃松松塔多糖對(duì)細(xì)胞存在一定的毒性，存活率為(82.38±2.15)%。為了避免由于細(xì)胞毒性對(duì)細(xì)胞因子釋放的影響，選取0～200 mg/L進(jìn)行后期研究。

綜上所述，偃松松塔多糖具有一定的抗氧化、免疫調(diào)節(jié)活性，可對(duì)其資源進(jìn)一步開發(fā)，作為一種新型的天然抗氧化劑和免疫調(diào)節(jié)劑應(yīng)用于保健食品、化妝品和生物制藥等行業(yè)。接下來的研究方向是分析偃松松塔多糖的結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系。

3 結(jié) 論

3.1以偃松松塔乙醇提取后渣為原料提取偃松松塔多糖，并進(jìn)行GC分析，結(jié)果表明:偃松松塔多糖是一種雜多糖，主要由阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，具有典型的多糖紅外光譜特征，4種單糖物質(zhì)的量比為2.33 ∶1.00 ∶2.20 ∶1.94。

3.2通過測(cè)定偃松松塔多糖清除DPPH自由基、ABTS自由基的能力以及還原能力評(píng)價(jià)抗氧化活性，然后通過體外實(shí)驗(yàn)評(píng)估其對(duì)RAW 264.7巨噬細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活性,結(jié)果表明：偃松松塔多糖對(duì)DPPH·和·ABTS+都有較強(qiáng)清除能力和還原能力，偃松松塔多糖以濃度依賴性方式表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性，多糖為2.0 g/L時(shí)，DPPH·和·ABTS+清除率分別為79.72%和39.63%。另外，松塔多糖能夠刺激RAW 264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量的NO，并沒有對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響。