• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    角額壁蜂共生放線菌分離、鑒定及其發(fā)酵產物抗菌活性研究

    2020-03-09 02:50:36張修梅王哲謝衛(wèi)東劉旭任玉紅初曉藝
    環(huán)境昆蟲學報 2020年1期
    關鍵詞:放線菌共生真菌

    張修梅,王哲,謝衛(wèi)東,劉旭,任玉紅,初曉藝

    (1. 山東藥品食品職業(yè)學院,山東威海 264210;2. 山東大學,山東威海 264209)

    自1928年青霉素發(fā)現(xiàn),到1941年臨床應用,現(xiàn)代抗生素的使用拉開了帷幕(Brigitteetal., 1987; Kyriacosetal., 2009)??股厮幬镏饕糜谥委熂毦腥疽鸬募膊?,一般不會產生嚴重的副作用,使得人們的生活質量及平均壽命得到很大的提高。

    放線菌是產生抗生素最多的一類微生物,目前廣泛應用的抗生素中80%是由放線菌產生的,但一直以來對于放線菌的研究主要集中在土壤、水體等環(huán)境,趨同的環(huán)境和重復性的研究使得從中分離得到新天然化合物的幾率從上世紀80年代開始逐年降低(胡松英等,2011)。由于細菌耐藥性的出現(xiàn),越來越多的疾病無藥可醫(yī),傳統(tǒng)來源方向上的的天然產物已無法滿足人們對新結構特征或新作用特點化合物的需求(Gerardetal., 2007)。因此,為了發(fā)現(xiàn)新型結構的天然產物,急需尋找新的特境微生物資源,昆蟲共生菌是亟待研究開發(fā)的天然產物來源(胡松英等,2011)。

    近年來對昆蟲共生菌的研究報道逐年增加,Susanne等(2008)和Barke等(2010)先后證實從切葉蟻中分離得到的共生菌,對病原真菌Escovopsis有很強的抑制活性。存在于培菌蟻角質層結構中的放線菌能夠抑制有害真菌炭角菌亞屬Pseudoxylaria的生長,對這個昆蟲真菌共生體系的穩(wěn)定,起到保護作用(Anna, 2011)。雌性歐洲狼蜂利用其觸角結構中的共生鏈霉菌屬放線菌來防御致病真菌的侵染,提高幼蟲的存活率(Ferrarietal., 2004; Johannesetal., 2010)。存在于昆蟲腸道中的共生菌還能為某些昆蟲提供飲食中缺乏的必需營養(yǎng)物質,像維生素B (Eichler and Schaub, 2002)、多種必需氨基酸(Douglas, 1998)、固醇(Sabreeetal., 2009)等,另外還可輔助寄主降解難以消化的大分子物質纖維素(Hosokawaetal., 2010; Watanabe and Tokuda, 2010;何剛強等,2009),對昆蟲起到營養(yǎng)和物質代謝的作用。由此可見,昆蟲共生放線菌是值得深入研究的熱點領域。

    角額壁蜂Osmiacornifrons是膜翅目切葉蜂科壁蜂屬營獨居傳粉昆蟲(Richardsetal., 2001)。壁蜂筑巢、產卵時采集潮濕泥沙作為巢室隔板材料,其卵和幼蟲與土壤密切接觸,常受到土壤環(huán)境病原菌威脅,為了提高幼蟲成活率,可能會與放線菌建立共生防御關系。因此,壁蜂共生放線菌在幼蟲抵御病原菌威脅和蜂糧長期儲藏過程中所起的作用及作用機制等問題值得深入研究。另外,角額壁蜂在我國分布廣泛,取材較容易。本文以三個地理種群角額壁蜂為研究對象,期望能夠分離得到具有抗菌活性的菌株,并通過16S rRNA序列分析,確定菌株的歸屬,同時對其菌群特征及規(guī)律進行初步研究。

    1 材料與方法

    1.1 材料與設備

    1.1.1分離培養(yǎng)基高氏一號培養(yǎng)基:可溶性淀粉20 g、KNO31 g、NaCl 0.5 g、K2HPO4·H2O 0.5 g、MgSO4·H2O 0.5 g、FeSO4·H2O 0.01 g、瓊脂20 g、水1 L,pH 7.4~7.6。

    長孢培養(yǎng)基:酵母浸粉1.5 g、可溶性淀粉10 g、KNO31 g、瓊脂20 g、水1 L,pH 7.2。

    S培養(yǎng)基:葡萄糖10 g、酵母浸粉4 g、K2HPO4·H2O 4 g、KH2PO4·H2O 2 g、MgSO4·H2O 0.5 g、瓊脂20 g、水1 L,pH 7.2~7.4。

    PDA培養(yǎng)基:葡萄糖20 g、瓊脂20 g、水500 mL、馬鈴薯汁500 mL,pH自然所有培養(yǎng)基在溫度121℃、壓力0.1 MPa下蒸汽滅菌20 min。

    1.1.2菌株鑒定材料DNA提取試劑盒、PCR擴增試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司,DNA Marker DL2000購自天根生化科技(北京)有限公司。放線菌16S rDNA正向引物Fd2 (5’-GAGTTTGATCATGGCTCAG-3′)和16Sr (5′-TTGCGGGACTTAACCCAACAT-3′),由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

    1.1.3指示菌株(1)細菌:枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis、大腸桿菌Escherichiacoli、金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus。

    (2)真菌:大毛霉Mucormucedo、白色念珠菌Moniliaalbican、白僵菌Beauveriabassiana、綠僵菌Metarhiziumanisopliae、云南刺盤孢Colletotrichumyunnanse、楊生盾殼霉Coniothyriumceltidicola、黑白輪枝孢Verticilliumalbo-atrum和蘋果鏈格孢Alternariamali以上指示菌株細菌和真菌均來自山東大學。

    1.1.4儀器和試劑GY-CJ-ID超凈工作臺、Gradient Cycler PTC-200 PCR儀、Bio-Rad HT 300電泳儀、eppendorf 5810R離心機、DNP-9082恒溫培養(yǎng)箱、BXM-30R高壓滅菌鍋、TS-2102恒溫搖床控制器、OSB-2000旋轉蒸發(fā)儀。培養(yǎng)基和試驗中所用到試劑均為國產分析純試劑。

    1.2 試驗方法

    1.2.1樣品采集

    角額壁蜂及蜂巢樣品于2015年5月中旬以及2016年、2017年5月中旬分別采自煙臺市萊陽市和威海市乳山市。將采集到的樣品密封陰涼處保存,分別放入密封袋中,待進一步處理。

    1.2.2樣品處理及菌株的分離、純化與保藏

    無菌條件下將壁蜂巢室縱向剖開,分別從壁蜂蜂體、巢室隔間土、繭3個部位取樣。分別取巢室隔間土、蜂繭適量,研磨,分別加入10 mL無菌水,得到10-1稀釋液,梯度稀釋,得到10-2和10-3稀釋液;將角額壁蜂浸泡在10 mL的無菌水試管中,得到10-1稀釋液,梯度稀釋得到10-2稀釋液,獲得體表樣品10-1和10-2稀釋液;角額壁蜂體表用75%酒精進行滅菌處理,研磨,梯度稀釋,得到體內樣品10-2和10-3稀釋液(王哲,2018)。

    將樣品處理得到的稀釋液分別取100 μL加到高氏一號、長孢和S培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中加入抗真菌劑重鉻酸鉀和抗細菌劑萘啶酸)上涂布接種,28℃下恒溫倒置培養(yǎng)一周,2 d后開始進行觀察。根據(jù)菌落顏色、形態(tài)等特征挑取單菌落至高氏一號培養(yǎng)基上純化,選取去重復后的純培養(yǎng)菌株接種到高氏一號培養(yǎng)基斜面上,菌落長滿后,儲存在4℃冰箱中。

    1.2.3菌株的16S rRNA基因測序與序列分析

    提取放線菌的16S rDNA序列,選擇引物Fd2和16Sr對菌株DNA模板進行PCR擴增(張修梅,2016),將PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后,送到北京華大基因進行產物純化后序列測定。將測序后的16S rDNA序列提交到NCBI里,運用NCBI里的blastn (Basic Local Alignment Search Tool,序列比對工具)工具與數(shù)據(jù)庫中菌株16S rDNA序列進行相似性比對,并下載最高相似性菌株的16S rDNA序列,使用Clustal X2及MEGA (6.06) (Molecular Evolutionary Genetics Analysis,分子進化遺傳學分析)軟件比對后構建NJ (Neighbor-Joining, 鄰接法) (Saitou and Nei, 1987)系統(tǒng)發(fā)育樹進行系統(tǒng)發(fā)育分析。同時也將序列提交到RDP Release 11-sequence analysis tools (http://rdp.cme.msu.edu/)做序列比對,將兩種比對結果結合起來進行分析(張修梅,2016)。

    1.2.4放線菌菌體抗真菌活性研究

    放線菌菌體抗真菌活性篩選(菌塊對峙法):將分離得到的菌株分別接種到高氏一號固體培養(yǎng)基上,32℃恒溫培養(yǎng)。將指示菌株分別接種到PDA固體培養(yǎng)基上,28℃恒溫培養(yǎng)48 h待用。在指示菌株長好的平板上分別加入5 mL滅菌水,移液槍移取1 mL上清液稀釋到9 mL無菌水的試管中,得到10-1稀釋液,待用。將長勢較好且分布均勻的放線菌制成6 mm的菌塊,均分放置在接種了指示菌株的培養(yǎng)基上,做平行對照。指示菌株:大毛霉、白色念珠菌、白僵菌、綠僵菌、云南刺盤孢、楊生盾殼霉、黑白輪枝孢和蘋果鏈格孢,認真記錄菌株抑菌圈的大小(王哲,2018)。

    1.2.5菌株發(fā)酵產物抗細菌活性研究

    采用紙片擴散法(Eloff, 1998)進行放線菌菌株發(fā)酵產物抗細菌活性篩選:將放線菌菌株接種到高氏一號液體培養(yǎng)基上搖床培養(yǎng)(32℃,140 rpm,14天),乙酸乙酯萃取,得到菌株發(fā)酵產物的粗提物。丙酮溶解,配置成10 mg/mL的溶液,分別加到6 mm的無菌紙片上制成藥敏紙片(100 μg/紙片)待用。將紙片均勻分布在涂布供試菌株的培養(yǎng)基上,三個平行。供試菌株:大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌,陽性對照:氯霉素和萘啶酸,32℃恒溫培養(yǎng)。丙酮為空白對照,觀察記錄抑菌圈的大小(王哲,2018)。

    2 結果與分析

    2.1 放線菌的分離及形態(tài)特征

    將兩個地理區(qū)域分布、不同時間、不同部位角額壁蜂及其相關樣品材料,分別用三種分離培養(yǎng)基,進行放線菌的分離純化,挑取不同培養(yǎng)基上菌落相對干燥,質地緊密且成顆粒狀,能產生孢子的單菌落進行分離純化。第一批2015年從煙臺采集的角額壁蜂樣品分離得到13株共生菌;第二批2016年從威海采集到的樣品分離得到11株共生菌;第三批2017年從威海采集到的樣品分離得到14株共生菌,三批共計得到38株共生菌。部分菌落圖片見圖1,三批菌株具體部位分布見表1(王哲,2018)。

    2.2 菌株鑒定及其16S rDNA序列分析

    對38株共生菌菌株DNA提取后,PCR擴增,得到約1420 bp(Base pair,堿基對)的基因片段,送至北京華大基因進行測序。

    將測序后的16S rDNA序列提交至NCBI里進行序列相似性比對。將38株菌株分別做各自的系統(tǒng)發(fā)育樹(NJ tree),基于16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育分析見圖2、圖3和圖4。

    圖1 部分放線菌的菌落形態(tài)Fig.1 Morphological characteristics of some actinomycetes

    表 1 不同部位菌株分布Table 1 Distribution of strains in different parts

    圖2 13株菌株(煙臺(2015))及其相似菌16S rDNA序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phlogenetic tree constructed based on 16S rDNA sequences analysis showing the phylogenetic relationships among strains of 13 strains from yantai (2015) and their similar bacteria

    表2 13株菌株(煙臺(2015))RDP Release 11序列對比結果Table 2 RDP Release 11 analysis of 13 strains from yantai (2015) and their similar bacteria

    圖3 11株菌株(乳山(2016))及其相似菌16S rDNA序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree constructed based on 16S rDNA sequences analysis showing the phylogenetic relationships among strains of 11 strains from rushan (2016) and their similar bacteria

    表3 11株菌株(乳山(2016)) RDP Release 11序列對比結果Table 3 RDP Release11 analysis of 11 strains from rushan (2016) and their similar bacteria

    圖4 14株菌株(乳山(2017))及其相似菌16S rDNA序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree constructed based on 16S rDNA sequences analysis showing the phylogenetic relationships among strains of 14 strains from rushan (2017) and their similar bacteria

    綜合NCBI里相似序列構建NJ tree系統(tǒng)發(fā)育樹分析與RDP Release11序列對比結果分析,兩者結果一致,支持率和相似度都相對較低,因此38株菌株均只能確定到屬。

    從煙臺(2015)采集的角額壁蜂13株共生菌株屬于細菌域:放線菌門Actinobacteria,放線菌綱Actinobacteria,放線菌目Actinobacterales中2個科(Micromonosporaceae, Streptomycetaceae)中3個屬(Streptomyces,Micromonospora,Verrucosispora)。其中鏈霉菌(Streptomyces)屬占絕大部分(9株,69.2%),小單孢菌屬(Micromonospora) 3株以及疣孢菌屬(Verrucosispora) 1株。其中已報道的疣孢菌屬的菌株較少且大部分來自于海洋、紅樹林等(Jiangetal., 2007;聶毅磊等,2010)。

    從乳山(2016)采集到角額壁蜂11株共生菌株中10株菌屬于細菌域:放線菌門Actinobacteria,放線菌綱Actinobacteria,放線菌目Actinomycetales中3個科(Streptomycetaceae, Nocardiopsaceae, Thermomonosporaceae)中3個屬(Streptomyces,Nocardiopsis,Actinocorallia)。其中7株屬于鏈霉菌屬(Streptomyces),珊瑚狀放線菌屬(Actinocorallia) 1株及擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis) 2株。來源于海洋中的擬諾卡氏菌屬由于其獨特的代謝功能,成為海洋放線菌次級代謝產物的重要來源(趙成英等,2013)。OC1611-6菌株為γ-變形菌綱中的假單胞菌屬(Pseudomonas),不屬于放線菌。

    表4 14株菌株(乳山(2017)) RDP Release 11序列對比結果Table 4 RDP Release 11 analysis of 14 strains from rushan (2017) and their similar bacteria

    從乳山(2017)采集到的角額壁蜂14株共生菌株屬于細菌域:放線菌門Actinobacteria,放線菌綱Actinobacteria,放線菌目Actinomycetales中3個科(Streptomycetaceae, Propionibacteriaceae, Thermomonosporaceae)中3個屬(Streptomyces,Pseudonocardia,Actinomadura)。鏈霉菌屬(Streptomyces)有10株,占絕大部分(71.4%),馬杜拉放線菌屬(Actinomadura) 3株和假諾卡氏菌屬 (Pseudonocardia) 1株。馬杜拉放線菌屬是一種稀有放線菌,可產生有高抗腫瘤活性的抗生素,像veractamycins、FR-900405同類物、esperamicins及barminomycins等(Badjietal., 2006;余成等,2018)。

    2.3 放線菌菌體抗菌活性研究結果

    采用菌塊對峙法測定從乳山2016年和2017年采集到的角額壁蜂的共生放線菌的抗真菌活性,菌塊為6 mm。

    角額壁蜂(乳山(2016)) 11株共生菌的抗菌結果見表5。Streptomycessp. OC1611-8A抑菌活性最強,對8種致病真菌除綠僵菌外均有抑制作用,尤其對云南刺盤孢和楊生盾殼霉活性最高,抑菌圈直徑分別達到25 mm和31 mm。擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis) OC1611-1和OC1611-2菌株對大毛霉和楊生盾殼霉均有較強的抑制活性,抑菌圈直徑在15~21 mm之間。Streptomycessp. OC1610-4菌株對白僵菌和綠僵菌有較好的抑制活性,而Streptomycessp. OC1610-6、OC1610-8、OC1611-8B,Pseudomonassp. OC1611-6和Actinocoralliasp. OC1612-1這5種菌株對所有指示真菌均沒有抑制活性。

    角額壁蜂(乳山(2017))14株放線菌的抗菌結果如表6。14株放線菌中Streptomycessp. R1706-8菌株對7種病原真菌均有抑制活性,尤其對楊生盾殼霉和白僵菌的抑菌圈直徑達到32 mm,Actinomadurasp. R1706-16除了對白色念珠菌無抑制作用外,對其它病原真菌均有抑制作用,但相對較弱。Streptomycessp. R1702-2菌株對楊生盾殼霉、白僵菌和云南刺盤孢都有較好活性,對楊生

    表5 11株共生菌(乳山(2016))的抑菌活性結果Table 5 The results of antifungal activity of 11 actinomycetes from rushan (2016)

    表6 14株放線菌(乳山(2017))的抑菌活性結果Table 6 The results of antifungal activity of 14 actinomycetes from rushan (2017)

    盾殼霉抑菌圈直徑達到24 mm。Streptomycessp. R1706-3、R1706-4和R1712-1菌株均只對其中的一種病原真菌有較好的抑制活性。Streptomycessp. R1706-1、R1706-2、R1706-9菌株,Actinomadurasp. R1706-13菌株和Pseudonocardiasp. R1712-3菌株對所有供試病原真菌均無抑制活性。

    2.4 菌株發(fā)酵產物抗菌活性研究結果

    利用紙片法測定從煙臺(2015)采集到的角額壁蜂的13株共生菌發(fā)酵產物的抗細菌活性,紙片為6 mm??咕钚匀绫?。13株共生菌中Streptomycessp. OC1401-2、OC1403-3,Micromonosporasp. OC1403-4、OC1403-6和Verrucosisporasp. OC1403-9的活性較強,尤其是Micromonosporasp. OC1403-4的抑菌活性最強,對三種供試菌株的活性接近陽性對照藥,抑菌圈直徑達到18 mm左右。Streptomycessp. OC1401-3、OC1401-4、OC1402-2和OC1402-3四種菌株的抑制活性相對較弱,抑菌圈直徑只有7~9 mm;Streptomycessp. OC1403-1、OC1428-1和Micromonosporasp. OC1428-5對三種供試細菌均無活性。

    角額壁蜂菌株及發(fā)酵產物部分抑菌圖片見圖5。

    本文以角額壁蜂為研究對象,在不同地域、不同部位樣品中共計分離得到38株共生菌,其中37株是放線菌,1株是真菌。對分離的菌株進行鑒定和16S rRNA序列分析,確定37株放線菌分別隸屬于5個科7個屬,絕大部分屬于鏈霉菌屬。將不同部位的菌株進行比較時,未發(fā)現(xiàn)相同菌株,因此無法通過比較來分析角額壁蜂的共生菌的水平和垂直傳遞問題;將從煙臺、威海兩地采集到角額壁蜂共生菌株進行比較,未發(fā)現(xiàn)相同菌株,因此不同區(qū)域種群之間存在差異;將2016年和2017年從乳山采集到的角額壁蜂共生菌進行比較,也未發(fā)現(xiàn)相同菌株,因此不同年份的兩個角額壁蜂共生菌種群也存在差異。

    將38株菌進行序列對比得到相似菌株,通過查找相似菌株的研究文獻,了解菌株的次級代謝產物類型及活性,為接下來尋找活性菌株及其次級代謝產物做好參考與鋪墊。

    表7 13株放線菌(煙臺(2015))發(fā)酵產物抗菌活性結果(mm)Table 7 The results of antibacterial activity of fermentation broth of 13 strains (yantai (2015)) of actinomycetes

    圖5 部分抑菌活性圖片F(xiàn)ig.5 Some pictures of antibacterial and antifungal activity

    3 結論與討論

    昆蟲與微生物的共生是長期進化而獲得的一項生存技能,在共生中,大多數(shù)的共生體供給寄主營養(yǎng),防御性共生體(多為放線菌)產生的次級代謝產物能夠對昆蟲微生物的共生起到保護作用,使這個體系更加的穩(wěn)定持續(xù)下去(張修梅,2016)。

    樹蜂科大部分昆蟲均能與淀粉韌革菌屬真菌存在互利共生關系(李大鵬等,2015),松樹蜂共生菌能夠引起寄主樹木的失水,引起細胞的死亡,進而營造出適合松樹蜂侵染寄主樹木適宜的干燥環(huán)境(Kingetal., 1966; Kile and Turnbull, 1974)。共生菌能夠產生胞外漆酶,在降解寄主樹木木質纖維素等物質從而破壞樹木內部結構起重要作用(Buchanan, 2001; Bordeaux, 2008)。Toru等(2012)首次從Coptotermesformosanus的腸道共生放線菌發(fā)酵液中分離得到actinomycin X2 (C62H84N12O17,色素肽內酯類抗生素)及其類似物actinomycin D (C62H86N12O16,首個有抗癌活性的抗生素)。與異小桿屬線蟲共生的發(fā)光桿菌能夠產生芪類衍生物(Timothyetal., 2014;張修梅,2016);與苔蘚共生的細菌產生的化合物很多具有抗菌性質(Franzetal., 2006;張修梅,2016)。近期發(fā)現(xiàn)的的一個新型鏈霉菌屬衍生物mycangimycin能夠對南方松甲蟲瘤額大小蠹有益共生真菌的競爭性抑制真菌有選擇性抑制作用(Michaeletal., 2011;張修梅,2016)。

    近年來,從膜翅目昆蟲共生放線菌中發(fā)現(xiàn)的化合物有抗霉素Antimycin (Michaeletal., 2011)、殺假絲菌素Candicidin D (Susanneetal., 2008)、制霉菌素Nystatin (Ryanetal., 2012)、殺粉蝶霉素Piericidin (Johannesetal., 2010),羧肽類化合物Dentigerumycin (Ohetal., 2009)、Microtermolides (Carretal., 2012)、制霉菌素氨基糖苷類衍生物(Barkeetal., 2010)及從泥蜂共生鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)的大環(huán)內酯類化合物Sceliphrolactam (Ohetal., 2011)等等。由此可見,膜翅目昆蟲共生放線菌是極具潛力的新型抗菌藥物重要來源。昆蟲放線菌共生體系是一個很有前途的發(fā)現(xiàn)新型化合物的來源方向。

    活性菌株的篩選在尋找有活性的次級代謝產物起重要的指導作用。本研究中在進行活性菌株篩選時,將菌塊對峙法和紙片擴散法兩種不同的抗菌方法相結合,此外,還需對菌株次級代謝產物產量及豐富度進行篩選,綜合抗菌活性、代謝產物產量和豐富度各方面因素選擇最優(yōu)活性菌株,進行次級代謝產物分離純化深入研究,以期找到新型結構化合物。

    猜你喜歡
    放線菌共生真菌
    人與熊貓 和諧共生
    高等大型真菌與人類
    科學(2020年2期)2020-08-24 07:56:56
    共生
    肺曲霉菌合并肺放線菌感染一例
    優(yōu)生共生圈培養(yǎng)模式探索
    優(yōu)生共生圈培養(yǎng)模式探索
    真菌造房子
    艾滋病合并侵襲性真菌感染的診治
    南大西洋深海沉積物中可培養(yǎng)放線菌的多樣性
    黃花蒿內生放線菌A5次生代謝產物分離鑒定
    欧美日韩亚洲高清精品| 寂寞人妻少妇视频99o| 欧美日韩亚洲高清精品| 欧美成人a在线观看| 3wmmmm亚洲av在线观看| 日韩国内少妇激情av| 亚洲国产成人一精品久久久| 禁无遮挡网站| eeuss影院久久| 成人亚洲欧美一区二区av| 成年女人在线观看亚洲视频 | 国产视频首页在线观看| 欧美精品一区二区大全| 国产淫语在线视频| 国产69精品久久久久777片| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频 | 一级片'在线观看视频| 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲精品自拍成人| 欧美xxⅹ黑人| 亚洲国产日韩一区二区| 精品视频人人做人人爽| 男人和女人高潮做爰伦理| 免费大片18禁| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 成人免费观看视频高清| 一级爰片在线观看| 在线观看av片永久免费下载| 别揉我奶头 嗯啊视频| 综合色av麻豆| 国产高潮美女av| 黄色欧美视频在线观看| 亚洲色图综合在线观看| 国产 一区精品| 国产免费一级a男人的天堂| 在线观看一区二区三区激情| 色视频在线一区二区三区| 久久99热这里只有精品18| 高清午夜精品一区二区三区| a级一级毛片免费在线观看| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产亚洲精品久久久com| 一级a做视频免费观看| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲经典国产精华液单| 亚洲欧美一区二区三区国产| 99久久精品热视频| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲精品一二三| 亚洲精品一区蜜桃| 简卡轻食公司| 日日摸夜夜添夜夜爱| 亚洲内射少妇av| 又大又黄又爽视频免费| 午夜福利高清视频| 亚洲在久久综合| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 久久久久国产精品人妻一区二区| 卡戴珊不雅视频在线播放| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲三级黄色毛片| 在线观看人妻少妇| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 亚洲伊人久久精品综合| 日本免费在线观看一区| 亚洲丝袜综合中文字幕| 久久精品国产亚洲网站| 美女内射精品一级片tv| av一本久久久久| 亚洲怡红院男人天堂| 日韩一本色道免费dvd| 色综合色国产| 亚洲丝袜综合中文字幕| 亚洲美女搞黄在线观看| 一本一本综合久久| 青青草视频在线视频观看| 大码成人一级视频| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国产高潮美女av| 精品少妇黑人巨大在线播放| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 一级av片app| 简卡轻食公司| 成人特级av手机在线观看| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲精品视频女| 欧美区成人在线视频| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 一级毛片aaaaaa免费看小| 男女那种视频在线观看| 一区二区三区免费毛片| 69人妻影院| 91久久精品国产一区二区成人| 亚洲精品久久午夜乱码| 成人国产av品久久久| 久久精品国产a三级三级三级| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国内精品宾馆在线| 69人妻影院| 嫩草影院精品99| 亚州av有码| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国产免费一级a男人的天堂| h日本视频在线播放| 国产毛片在线视频| 亚洲成人久久爱视频| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产免费视频播放在线视频| 2018国产大陆天天弄谢| 国产黄a三级三级三级人| 麻豆国产97在线/欧美| 国内揄拍国产精品人妻在线| freevideosex欧美| 全区人妻精品视频| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 免费av不卡在线播放| 久久亚洲国产成人精品v| 新久久久久国产一级毛片| 欧美成人午夜免费资源| 51国产日韩欧美| 色婷婷久久久亚洲欧美| 午夜老司机福利剧场| 国产综合精华液| 日韩强制内射视频| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 欧美bdsm另类| 免费看a级黄色片| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 成年女人看的毛片在线观看| 成人免费观看视频高清| 亚洲最大成人中文| 中文资源天堂在线| 日韩一区二区视频免费看| 一级爰片在线观看| 乱码一卡2卡4卡精品| 欧美成人午夜免费资源| 亚洲成人一二三区av| 国产一级毛片在线| 高清在线视频一区二区三区| 日本一本二区三区精品| 特大巨黑吊av在线直播| 97精品久久久久久久久久精品| 青春草国产在线视频| 日韩欧美精品免费久久| 国产综合精华液| eeuss影院久久| 午夜日本视频在线| 日韩av在线免费看完整版不卡| 亚洲国产高清在线一区二区三| 亚洲成人av在线免费| av天堂中文字幕网| 国产黄片美女视频| 亚洲经典国产精华液单| 白带黄色成豆腐渣| 亚洲色图av天堂| 亚洲经典国产精华液单| 国产黄片美女视频| 国产精品一区二区在线观看99| 五月开心婷婷网| 国产黄片美女视频| av福利片在线观看| 欧美区成人在线视频| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 久久久久国产网址| 伊人久久精品亚洲午夜| 亚洲av二区三区四区| 成年女人看的毛片在线观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| av在线观看视频网站免费| 国产黄色免费在线视频| 亚洲精品视频女| 亚洲欧美精品专区久久| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 2021天堂中文幕一二区在线观| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 国产精品偷伦视频观看了| 国产真实伦视频高清在线观看| 一区二区三区精品91| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产伦精品一区二区三区视频9| 亚州av有码| 视频区图区小说| av免费观看日本| 国产成年人精品一区二区| 亚洲国产av新网站| 99热网站在线观看| 国产精品三级大全| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 久久久久久九九精品二区国产| 1000部很黄的大片| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 青青草视频在线视频观看| 免费大片18禁| 最近最新中文字幕免费大全7| 精品一区二区免费观看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国产精品久久久久久精品电影| av在线播放精品| 99热这里只有是精品在线观看| 一级毛片我不卡| 2021少妇久久久久久久久久久| 亚洲国产色片| 国产成人aa在线观看| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 又大又黄又爽视频免费| 26uuu在线亚洲综合色| 色吧在线观看| 久久人人爽人人爽人人片va| 午夜日本视频在线| 国产亚洲5aaaaa淫片| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 18+在线观看网站| 国产淫语在线视频| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产精品久久久久久久电影| 久久久久久久久久久免费av| 十八禁网站网址无遮挡 | 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 一区二区三区精品91| 精品国产乱码久久久久久小说| 黄片wwwwww| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 亚洲国产欧美在线一区| 久久精品综合一区二区三区| 成人漫画全彩无遮挡| 有码 亚洲区| 国产精品三级大全| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产男人的电影天堂91| 五月玫瑰六月丁香| 超碰av人人做人人爽久久| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲成人一二三区av| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 成年av动漫网址| 欧美97在线视频| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 中文天堂在线官网| 少妇丰满av| 精品久久久久久久久av| 免费大片18禁| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 99久国产av精品国产电影| 老司机影院成人| 干丝袜人妻中文字幕| 免费黄频网站在线观看国产| 99久久九九国产精品国产免费| 日韩av不卡免费在线播放| 国产亚洲5aaaaa淫片| 日韩精品有码人妻一区| 搡老乐熟女国产| 午夜福利视频精品| 日本欧美国产在线视频| 秋霞在线观看毛片| 男女那种视频在线观看| 亚洲在久久综合| kizo精华| 十八禁网站网址无遮挡 | 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 在线 av 中文字幕| 51国产日韩欧美| 九九爱精品视频在线观看| 国产日韩欧美在线精品| 国产精品人妻久久久久久| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 亚洲av日韩在线播放| 精品人妻视频免费看| 大码成人一级视频| 69av精品久久久久久| 好男人在线观看高清免费视频| 久久久久久久久久久丰满| 国产伦在线观看视频一区| 九九在线视频观看精品| 中文字幕av成人在线电影| 亚洲成人中文字幕在线播放| 一区二区av电影网| 国产高清国产精品国产三级 | 激情 狠狠 欧美| 国内精品宾馆在线| 香蕉精品网在线| 成人一区二区视频在线观看| 久久久久久久久久成人| 美女被艹到高潮喷水动态| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 日韩欧美 国产精品| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产精品女同一区二区软件| 91精品伊人久久大香线蕉| 最近2019中文字幕mv第一页| 高清毛片免费看| 人妻 亚洲 视频| 亚洲成色77777| 2022亚洲国产成人精品| 美女国产视频在线观看| 午夜亚洲福利在线播放| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 春色校园在线视频观看| 国产69精品久久久久777片| 联通29元200g的流量卡| 国产免费福利视频在线观看| 亚洲精品视频女| 少妇丰满av| 99九九线精品视频在线观看视频| 亚洲精品国产av成人精品| 人妻系列 视频| 国产日韩欧美在线精品| 精品酒店卫生间| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 亚州av有码| 免费大片18禁| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 极品教师在线视频| 国产探花极品一区二区| 亚洲第一区二区三区不卡| 午夜福利在线在线| 精品午夜福利在线看| 卡戴珊不雅视频在线播放| 99热这里只有是精品在线观看| 精品视频人人做人人爽| 成年女人看的毛片在线观看| 搡女人真爽免费视频火全软件| 免费大片18禁| 人妻系列 视频| 午夜免费男女啪啪视频观看| 中文资源天堂在线| 国内精品美女久久久久久| 亚洲国产精品专区欧美| 嫩草影院入口| 亚洲人成网站在线播| 成人一区二区视频在线观看| 最近中文字幕2019免费版| eeuss影院久久| 丰满乱子伦码专区| av国产久精品久网站免费入址| 女人被狂操c到高潮| 看黄色毛片网站| 2021天堂中文幕一二区在线观| 激情 狠狠 欧美| 99久国产av精品国产电影| 亚洲图色成人| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 黄片无遮挡物在线观看| 成人特级av手机在线观看| 亚洲最大成人手机在线| 成人亚洲精品av一区二区| 欧美激情国产日韩精品一区| 中文字幕av成人在线电影| 国产av不卡久久| 国产免费一区二区三区四区乱码| 少妇熟女欧美另类| 联通29元200g的流量卡| 中文字幕av成人在线电影| 久久久久久久午夜电影| 狂野欧美激情性bbbbbb| 联通29元200g的流量卡| 两个人的视频大全免费| 搡女人真爽免费视频火全软件| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 久久久久久九九精品二区国产| 2018国产大陆天天弄谢| 春色校园在线视频观看| 免费黄频网站在线观看国产| 熟女电影av网| 亚洲怡红院男人天堂| 欧美zozozo另类| 亚洲不卡免费看| 日韩国内少妇激情av| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 精品久久国产蜜桃| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 久久99精品国语久久久| 搡老乐熟女国产| 久久精品夜色国产| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 成人毛片60女人毛片免费| 激情五月婷婷亚洲| 直男gayav资源| 国产乱人视频| 精品午夜福利在线看| 国产精品熟女久久久久浪| 天堂网av新在线| 日本-黄色视频高清免费观看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 性色avwww在线观看| 日日啪夜夜爽| 国产男女超爽视频在线观看| 99久久精品热视频| 精品久久久精品久久久| 新久久久久国产一级毛片| 国产精品久久久久久久电影| 色吧在线观看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 免费人成在线观看视频色| 国产永久视频网站| 国产成人福利小说| 久久久久性生活片| 在线精品无人区一区二区三 | 久久热精品热| 欧美另类一区| 晚上一个人看的免费电影| 一个人看的www免费观看视频| 各种免费的搞黄视频| 97精品久久久久久久久久精品| 久久亚洲国产成人精品v| 精华霜和精华液先用哪个| 毛片一级片免费看久久久久| 国产色爽女视频免费观看| 国内精品美女久久久久久| 亚洲精品乱久久久久久| 成年人午夜在线观看视频| 欧美变态另类bdsm刘玥| 男人舔奶头视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 干丝袜人妻中文字幕| 免费看光身美女| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 美女内射精品一级片tv| 国产综合懂色| 交换朋友夫妻互换小说| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 超碰97精品在线观看| 白带黄色成豆腐渣| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频 | 亚洲国产精品999| 亚洲精品日韩av片在线观看| av卡一久久| 最近最新中文字幕大全电影3| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 搡老乐熟女国产| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 91aial.com中文字幕在线观看| 大香蕉97超碰在线| 黄色一级大片看看| 爱豆传媒免费全集在线观看| 韩国av在线不卡| 老司机影院毛片| 欧美少妇被猛烈插入视频| 国产爽快片一区二区三区| 中文天堂在线官网| 色播亚洲综合网| 午夜精品一区二区三区免费看| 亚洲精品成人久久久久久| 久久精品夜色国产| 欧美高清成人免费视频www| 国产精品无大码| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 别揉我奶头 嗯啊视频| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 观看美女的网站| 亚洲人成网站高清观看| 2022亚洲国产成人精品| 亚洲精品影视一区二区三区av| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 日本色播在线视频| av女优亚洲男人天堂| 天天一区二区日本电影三级| 日韩制服骚丝袜av| 下体分泌物呈黄色| 麻豆成人av视频| 高清日韩中文字幕在线| 国产精品一区www在线观看| 久久精品国产亚洲av涩爱| 亚洲av.av天堂| 日韩 亚洲 欧美在线| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产男人的电影天堂91| 成人二区视频| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 一级毛片电影观看| 九九爱精品视频在线观看| 国内精品美女久久久久久| 久久影院123| 国产大屁股一区二区在线视频| 久久久午夜欧美精品| 久久韩国三级中文字幕| 精品视频人人做人人爽| 精品国产乱码久久久久久小说| 在线 av 中文字幕| 内射极品少妇av片p| 国产成人福利小说| 成年av动漫网址| 22中文网久久字幕| 天美传媒精品一区二区| 亚洲丝袜综合中文字幕| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 狂野欧美激情性bbbbbb| 精品国产露脸久久av麻豆| 视频中文字幕在线观看| 日韩电影二区| 国产一区二区三区av在线| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲色图av天堂| 亚洲欧洲日产国产| 香蕉精品网在线| 日韩一本色道免费dvd| 久久久久九九精品影院| 亚洲无线观看免费| xxx大片免费视频| 九九爱精品视频在线观看| 中文欧美无线码| 国产精品熟女久久久久浪| 国产精品.久久久| 欧美性感艳星| 国产 一区 欧美 日韩| 日韩中字成人| 乱系列少妇在线播放| 国产精品久久久久久久电影| 一二三四中文在线观看免费高清| kizo精华| 欧美精品国产亚洲| 韩国高清视频一区二区三区| 欧美三级亚洲精品| 欧美zozozo另类| 18+在线观看网站| av免费在线看不卡| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 日韩免费高清中文字幕av| 国产毛片在线视频| 亚洲内射少妇av| 亚洲天堂国产精品一区在线| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 高清欧美精品videossex| 九草在线视频观看| 久久影院123| 久久久久久久亚洲中文字幕| 欧美日韩视频精品一区| 午夜爱爱视频在线播放| 国产高清不卡午夜福利| 偷拍熟女少妇极品色| 国产色婷婷99| 亚洲综合色惰| 欧美日韩亚洲高清精品| 午夜福利高清视频| 亚洲国产最新在线播放| 看免费成人av毛片| 国产精品精品国产色婷婷| 一级爰片在线观看| 99久久精品热视频| 九九爱精品视频在线观看| 街头女战士在线观看网站| 乱系列少妇在线播放| 九九在线视频观看精品| 国产免费视频播放在线视频| 国产成人freesex在线| 偷拍熟女少妇极品色| 国产在线男女| 日韩av免费高清视频| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产精品一及| 熟妇人妻不卡中文字幕| 日本色播在线视频| 国产精品伦人一区二区| 免费看a级黄色片| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产高潮美女av| 亚洲精品国产av成人精品| 成人免费观看视频高清| 一级毛片久久久久久久久女| 少妇的逼水好多| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 欧美区成人在线视频| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 国产伦在线观看视频一区| a级毛片免费高清观看在线播放| 夜夜爽夜夜爽视频| 欧美日韩精品成人综合77777| 超碰97精品在线观看| 亚洲真实伦在线观看| 午夜激情福利司机影院| 我的老师免费观看完整版| 亚洲综合精品二区| 国产精品一区二区在线观看99| 丝袜美腿在线中文| 国产成人freesex在线| 青青草视频在线视频观看| 国产成人午夜福利电影在线观看| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产色婷婷99| 欧美精品国产亚洲| 久久久久久久亚洲中文字幕| 久久久久久伊人网av| 欧美高清性xxxxhd video| 在线观看一区二区三区| 国产爽快片一区二区三区| 深夜a级毛片| a级毛色黄片| 欧美日韩视频精品一区| 免费看日本二区| 亚洲天堂av无毛| 18禁动态无遮挡网站| 亚洲精品成人久久久久久| 一级av片app| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 国产91av在线免费观看| 在线观看一区二区三区| 中文字幕免费在线视频6| 26uuu在线亚洲综合色| 亚洲美女搞黄在线观看| 久久久成人免费电影| 亚洲天堂国产精品一区在线| 高清日韩中文字幕在线| 亚洲天堂国产精品一区在线| 亚洲精品乱久久久久久| 夜夜爽夜夜爽视频|