角額壁蜂共生放線菌分離、鑒定及其發(fā)酵產物抗菌活性研究

張修梅，王哲，謝衛(wèi)東，劉旭，任玉紅，初曉藝

(1. 山東藥品食品職業(yè)學院，山東威海 264210；2. 山東大學，山東威海 264209)

自1928年青霉素發(fā)現(xiàn)，到1941年臨床應用，現(xiàn)代抗生素的使用拉開了帷幕(Brigitteetal., 1987; Kyriacosetal., 2009)?？股厮幬镏饕糜谥委熂毦腥疽鸬募膊?，一般不會產生嚴重的副作用，使得人們的生活質量及平均壽命得到很大的提高。

放線菌是產生抗生素最多的一類微生物，目前廣泛應用的抗生素中80%是由放線菌產生的，但一直以來對于放線菌的研究主要集中在土壤、水體等環(huán)境，趨同的環(huán)境和重復性的研究使得從中分離得到新天然化合物的幾率從上世紀80年代開始逐年降低(胡松英等，2011)。由于細菌耐藥性的出現(xiàn)，越來越多的疾病無藥可醫(yī)，傳統(tǒng)來源方向上的的天然產物已無法滿足人們對新結構特征或新作用特點化合物的需求(Gerardetal., 2007)。因此，為了發(fā)現(xiàn)新型結構的天然產物，急需尋找新的特境微生物資源，昆蟲共生菌是亟待研究開發(fā)的天然產物來源(胡松英等，2011)。

近年來對昆蟲共生菌的研究報道逐年增加，Susanne等(2008)和Barke等(2010)先后證實從切葉蟻中分離得到的共生菌，對病原真菌Escovopsis有很強的抑制活性。存在于培菌蟻角質層結構中的放線菌能夠抑制有害真菌炭角菌亞屬Pseudoxylaria的生長，對這個昆蟲真菌共生體系的穩(wěn)定，起到保護作用(Anna, 2011)。雌性歐洲狼蜂利用其觸角結構中的共生鏈霉菌屬放線菌來防御致病真菌的侵染，提高幼蟲的存活率(Ferrarietal., 2004; Johannesetal., 2010)。存在于昆蟲腸道中的共生菌還能為某些昆蟲提供飲食中缺乏的必需營養(yǎng)物質，像維生素B (Eichler and Schaub, 2002)、多種必需氨基酸(Douglas, 1998)、固醇(Sabreeetal., 2009)等，另外還可輔助寄主降解難以消化的大分子物質纖維素(Hosokawaetal., 2010; Watanabe and Tokuda, 2010；何剛強等，2009)，對昆蟲起到營養(yǎng)和物質代謝的作用。由此可見，昆蟲共生放線菌是值得深入研究的熱點領域。

角額壁蜂Osmiacornifrons是膜翅目切葉蜂科壁蜂屬營獨居傳粉昆蟲(Richardsetal., 2001)。壁蜂筑巢、產卵時采集潮濕泥沙作為巢室隔板材料，其卵和幼蟲與土壤密切接觸，常受到土壤環(huán)境病原菌威脅，為了提高幼蟲成活率，可能會與放線菌建立共生防御關系。因此，壁蜂共生放線菌在幼蟲抵御病原菌威脅和蜂糧長期儲藏過程中所起的作用及作用機制等問題值得深入研究。另外，角額壁蜂在我國分布廣泛，取材較容易。本文以三個地理種群角額壁蜂為研究對象，期望能夠分離得到具有抗菌活性的菌株，并通過16S rRNA序列分析，確定菌株的歸屬，同時對其菌群特征及規(guī)律進行初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1分離培養(yǎng)基高氏一號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g、KNO31 g、NaCl 0.5 g、K2HPO4·H2O 0.5 g、MgSO4·H2O 0.5 g、FeSO4·H2O 0.01 g、瓊脂20 g、水1 L，pH 7.4～7.6。

長孢培養(yǎng)基：酵母浸粉1.5 g、可溶性淀粉10 g、KNO31 g、瓊脂20 g、水1 L，pH 7.2。

S培養(yǎng)基：葡萄糖10 g、酵母浸粉4 g、K2HPO4·H2O 4 g、KH2PO4·H2O 2 g、MgSO4·H2O 0.5 g、瓊脂20 g、水1 L，pH 7.2～7.4。

PDA培養(yǎng)基：葡萄糖20 g、瓊脂20 g、水500 mL、馬鈴薯汁500 mL，pH自然所有培養(yǎng)基在溫度121℃、壓力0.1 MPa下蒸汽滅菌20 min。

1.1.2菌株鑒定材料DNA提取試劑盒、PCR擴增試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司，DNA Marker DL2000購自天根生化科技(北京)有限公司。放線菌16S rDNA正向引物Fd2 (5’-GAGTTTGATCATGGCTCAG-3′)和16Sr (5′-TTGCGGGACTTAACCCAACAT-3′)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.3指示菌株(1)細菌：枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis、大腸桿菌Escherichiacoli、金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus。

(2)真菌：大毛霉Mucormucedo、白色念珠菌Moniliaalbican、白僵菌Beauveriabassiana、綠僵菌Metarhiziumanisopliae、云南刺盤孢Colletotrichumyunnanse、楊生盾殼霉Coniothyriumceltidicola、黑白輪枝孢Verticilliumalbo-atrum和蘋果鏈格孢Alternariamali以上指示菌株細菌和真菌均來自山東大學。

1.1.4儀器和試劑GY-CJ-ID超凈工作臺、Gradient Cycler PTC-200 PCR儀、Bio-Rad HT 300電泳儀、eppendorf 5810R離心機、DNP-9082恒溫培養(yǎng)箱、BXM-30R高壓滅菌鍋、TS-2102恒溫搖床控制器、OSB-2000旋轉蒸發(fā)儀。培養(yǎng)基和試驗中所用到試劑均為國產分析純試劑。

1.2 試驗方法

1.2.1樣品采集

角額壁蜂及蜂巢樣品于2015年5月中旬以及2016年、2017年5月中旬分別采自煙臺市萊陽市和威海市乳山市。將采集到的樣品密封陰涼處保存，分別放入密封袋中，待進一步處理。

1.2.2樣品處理及菌株的分離、純化與保藏

無菌條件下將壁蜂巢室縱向剖開，分別從壁蜂蜂體、巢室隔間土、繭3個部位取樣。分別取巢室隔間土、蜂繭適量，研磨，分別加入10 mL無菌水，得到10-1稀釋液，梯度稀釋，得到10-2和10-3稀釋液；將角額壁蜂浸泡在10 mL的無菌水試管中，得到10-1稀釋液，梯度稀釋得到10-2稀釋液，獲得體表樣品10-1和10-2稀釋液；角額壁蜂體表用75%酒精進行滅菌處理，研磨，梯度稀釋，得到體內樣品10-2和10-3稀釋液(王哲，2018)。

將樣品處理得到的稀釋液分別取100 μL加到高氏一號、長孢和S培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中加入抗真菌劑重鉻酸鉀和抗細菌劑萘啶酸)上涂布接種，28℃下恒溫倒置培養(yǎng)一周，2 d后開始進行觀察。根據(jù)菌落顏色、形態(tài)等特征挑取單菌落至高氏一號培養(yǎng)基上純化，選取去重復后的純培養(yǎng)菌株接種到高氏一號培養(yǎng)基斜面上，菌落長滿后，儲存在4℃冰箱中。

1.2.3菌株的16S rRNA基因測序與序列分析

提取放線菌的16S rDNA序列，選擇引物Fd2和16Sr對菌株DNA模板進行PCR擴增(張修梅，2016)，將PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送到北京華大基因進行產物純化后序列測定。將測序后的16S rDNA序列提交到NCBI里，運用NCBI里的blastn (Basic Local Alignment Search Tool，序列比對工具)工具與數(shù)據(jù)庫中菌株16S rDNA序列進行相似性比對，并下載最高相似性菌株的16S rDNA序列，使用Clustal X2及MEGA (6.06) (Molecular Evolutionary Genetics Analysis，分子進化遺傳學分析)軟件比對后構建NJ (Neighbor-Joining, 鄰接法) (Saitou and Nei, 1987)系統(tǒng)發(fā)育樹進行系統(tǒng)發(fā)育分析。同時也將序列提交到RDP Release 11-sequence analysis tools (http://rdp.cme.msu.edu/)做序列比對，將兩種比對結果結合起來進行分析(張修梅，2016)。

1.2.4放線菌菌體抗真菌活性研究

放線菌菌體抗真菌活性篩選(菌塊對峙法)：將分離得到的菌株分別接種到高氏一號固體培養(yǎng)基上，32℃恒溫培養(yǎng)。將指示菌株分別接種到PDA固體培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)48 h待用。在指示菌株長好的平板上分別加入5 mL滅菌水，移液槍移取1 mL上清液稀釋到9 mL無菌水的試管中，得到10-1稀釋液，待用。將長勢較好且分布均勻的放線菌制成6 mm的菌塊，均分放置在接種了指示菌株的培養(yǎng)基上，做平行對照。指示菌株：大毛霉、白色念珠菌、白僵菌、綠僵菌、云南刺盤孢、楊生盾殼霉、黑白輪枝孢和蘋果鏈格孢，認真記錄菌株抑菌圈的大小(王哲，2018)。

1.2.5菌株發(fā)酵產物抗細菌活性研究

采用紙片擴散法(Eloff, 1998)進行放線菌菌株發(fā)酵產物抗細菌活性篩選：將放線菌菌株接種到高氏一號液體培養(yǎng)基上搖床培養(yǎng)(32℃，140 rpm，14天)，乙酸乙酯萃取，得到菌株發(fā)酵產物的粗提物。丙酮溶解，配置成10 mg/mL的溶液，分別加到6 mm的無菌紙片上制成藥敏紙片(100 μg/紙片)待用。將紙片均勻分布在涂布供試菌株的培養(yǎng)基上，三個平行。供試菌株：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌，陽性對照：氯霉素和萘啶酸，32℃恒溫培養(yǎng)。丙酮為空白對照，觀察記錄抑菌圈的大小(王哲，2018)。

2 結果與分析

2.1 放線菌的分離及形態(tài)特征

將兩個地理區(qū)域分布、不同時間、不同部位角額壁蜂及其相關樣品材料，分別用三種分離培養(yǎng)基，進行放線菌的分離純化，挑取不同培養(yǎng)基上菌落相對干燥，質地緊密且成顆粒狀，能產生孢子的單菌落進行分離純化。第一批2015年從煙臺采集的角額壁蜂樣品分離得到13株共生菌；第二批2016年從威海采集到的樣品分離得到11株共生菌；第三批2017年從威海采集到的樣品分離得到14株共生菌，三批共計得到38株共生菌。部分菌落圖片見圖1，三批菌株具體部位分布見表1(王哲，2018)。

2.2 菌株鑒定及其16S rDNA序列分析

對38株共生菌菌株DNA提取后，PCR擴增，得到約1420 bp(Base pair，堿基對)的基因片段，送至北京華大基因進行測序。

將測序后的16S rDNA序列提交至NCBI里進行序列相似性比對。將38株菌株分別做各自的系統(tǒng)發(fā)育樹(NJ tree)，基于16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育分析見圖2、圖3和圖4。

圖1 部分放線菌的菌落形態(tài)Fig.1 Morphological characteristics of some actinomycetes

表 1 不同部位菌株分布Table 1 Distribution of strains in different parts

圖2 13株菌株(煙臺(2015))及其相似菌16S rDNA序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phlogenetic tree constructed based on 16S rDNA sequences analysis showing the phylogenetic relationships among strains of 13 strains from yantai (2015) and their similar bacteria

表2 13株菌株(煙臺(2015))RDP Release 11序列對比結果Table 2 RDP Release 11 analysis of 13 strains from yantai (2015) and their similar bacteria

圖3 11株菌株(乳山(2016))及其相似菌16S rDNA序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree constructed based on 16S rDNA sequences analysis showing the phylogenetic relationships among strains of 11 strains from rushan (2016) and their similar bacteria

表3 11株菌株(乳山(2016)) RDP Release 11序列對比結果Table 3 RDP Release11 analysis of 11 strains from rushan (2016) and their similar bacteria

圖4 14株菌株(乳山(2017))及其相似菌16S rDNA序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree constructed based on 16S rDNA sequences analysis showing the phylogenetic relationships among strains of 14 strains from rushan (2017) and their similar bacteria

綜合NCBI里相似序列構建NJ tree系統(tǒng)發(fā)育樹分析與RDP Release11序列對比結果分析，兩者結果一致，支持率和相似度都相對較低，因此38株菌株均只能確定到屬。

從煙臺(2015)采集的角額壁蜂13株共生菌株屬于細菌域：放線菌門Actinobacteria，放線菌綱Actinobacteria，放線菌目Actinobacterales中2個科(Micromonosporaceae, Streptomycetaceae)中3個屬(Streptomyces,Micromonospora,Verrucosispora)。其中鏈霉菌(Streptomyces)屬占絕大部分(9株，69.2%)，小單孢菌屬(Micromonospora) 3株以及疣孢菌屬(Verrucosispora) 1株。其中已報道的疣孢菌屬的菌株較少且大部分來自于海洋、紅樹林等(Jiangetal., 2007；聶毅磊等，2010)。

從乳山(2016)采集到角額壁蜂11株共生菌株中10株菌屬于細菌域：放線菌門Actinobacteria，放線菌綱Actinobacteria，放線菌目Actinomycetales中3個科(Streptomycetaceae, Nocardiopsaceae, Thermomonosporaceae)中3個屬(Streptomyces,Nocardiopsis,Actinocorallia)。其中7株屬于鏈霉菌屬(Streptomyces)，珊瑚狀放線菌屬(Actinocorallia) 1株及擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis) 2株。來源于海洋中的擬諾卡氏菌屬由于其獨特的代謝功能，成為海洋放線菌次級代謝產物的重要來源(趙成英等，2013)。OC1611-6菌株為γ-變形菌綱中的假單胞菌屬(Pseudomonas)，不屬于放線菌。

表4 14株菌株(乳山(2017)) RDP Release 11序列對比結果Table 4 RDP Release 11 analysis of 14 strains from rushan (2017) and their similar bacteria

從乳山(2017)采集到的角額壁蜂14株共生菌株屬于細菌域：放線菌門Actinobacteria，放線菌綱Actinobacteria，放線菌目Actinomycetales中3個科(Streptomycetaceae, Propionibacteriaceae, Thermomonosporaceae)中3個屬(Streptomyces,Pseudonocardia,Actinomadura)。鏈霉菌屬(Streptomyces)有10株，占絕大部分(71.4%)，馬杜拉放線菌屬(Actinomadura) 3株和假諾卡氏菌屬 (Pseudonocardia) 1株。馬杜拉放線菌屬是一種稀有放線菌，可產生有高抗腫瘤活性的抗生素，像veractamycins、FR-900405同類物、esperamicins及barminomycins等(Badjietal., 2006；余成等，2018)。

2.3 放線菌菌體抗菌活性研究結果

采用菌塊對峙法測定從乳山2016年和2017年采集到的角額壁蜂的共生放線菌的抗真菌活性，菌塊為6 mm。

角額壁蜂(乳山(2016)) 11株共生菌的抗菌結果見表5。Streptomycessp. OC1611-8A抑菌活性最強，對8種致病真菌除綠僵菌外均有抑制作用，尤其對云南刺盤孢和楊生盾殼霉活性最高，抑菌圈直徑分別達到25 mm和31 mm。擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis) OC1611-1和OC1611-2菌株對大毛霉和楊生盾殼霉均有較強的抑制活性，抑菌圈直徑在15～21 mm之間。Streptomycessp. OC1610-4菌株對白僵菌和綠僵菌有較好的抑制活性，而Streptomycessp. OC1610-6、OC1610-8、OC1611-8B，Pseudomonassp. OC1611-6和Actinocoralliasp. OC1612-1這5種菌株對所有指示真菌均沒有抑制活性。

角額壁蜂(乳山(2017))14株放線菌的抗菌結果如表6。14株放線菌中Streptomycessp. R1706-8菌株對7種病原真菌均有抑制活性，尤其對楊生盾殼霉和白僵菌的抑菌圈直徑達到32 mm，Actinomadurasp. R1706-16除了對白色念珠菌無抑制作用外，對其它病原真菌均有抑制作用，但相對較弱。Streptomycessp. R1702-2菌株對楊生盾殼霉、白僵菌和云南刺盤孢都有較好活性，對楊生

表5 11株共生菌(乳山(2016))的抑菌活性結果Table 5 The results of antifungal activity of 11 actinomycetes from rushan (2016)

表6 14株放線菌(乳山(2017))的抑菌活性結果Table 6 The results of antifungal activity of 14 actinomycetes from rushan (2017)

盾殼霉抑菌圈直徑達到24 mm。Streptomycessp. R1706-3、R1706-4和R1712-1菌株均只對其中的一種病原真菌有較好的抑制活性。Streptomycessp. R1706-1、R1706-2、R1706-9菌株，Actinomadurasp. R1706-13菌株和Pseudonocardiasp. R1712-3菌株對所有供試病原真菌均無抑制活性。

2.4 菌株發(fā)酵產物抗菌活性研究結果

利用紙片法測定從煙臺(2015)采集到的角額壁蜂的13株共生菌發(fā)酵產物的抗細菌活性，紙片為6 mm?？咕钚匀绫?。13株共生菌中Streptomycessp. OC1401-2、OC1403-3，Micromonosporasp. OC1403-4、OC1403-6和Verrucosisporasp. OC1403-9的活性較強，尤其是Micromonosporasp. OC1403-4的抑菌活性最強，對三種供試菌株的活性接近陽性對照藥，抑菌圈直徑達到18 mm左右。Streptomycessp. OC1401-3、OC1401-4、OC1402-2和OC1402-3四種菌株的抑制活性相對較弱，抑菌圈直徑只有7～9 mm；Streptomycessp. OC1403-1、OC1428-1和Micromonosporasp. OC1428-5對三種供試細菌均無活性。

角額壁蜂菌株及發(fā)酵產物部分抑菌圖片見圖5。

本文以角額壁蜂為研究對象，在不同地域、不同部位樣品中共計分離得到38株共生菌，其中37株是放線菌，1株是真菌。對分離的菌株進行鑒定和16S rRNA序列分析，確定37株放線菌分別隸屬于5個科7個屬，絕大部分屬于鏈霉菌屬。將不同部位的菌株進行比較時，未發(fā)現(xiàn)相同菌株，因此無法通過比較來分析角額壁蜂的共生菌的水平和垂直傳遞問題；將從煙臺、威海兩地采集到角額壁蜂共生菌株進行比較，未發(fā)現(xiàn)相同菌株，因此不同區(qū)域種群之間存在差異；將2016年和2017年從乳山采集到的角額壁蜂共生菌進行比較，也未發(fā)現(xiàn)相同菌株，因此不同年份的兩個角額壁蜂共生菌種群也存在差異。

將38株菌進行序列對比得到相似菌株，通過查找相似菌株的研究文獻，了解菌株的次級代謝產物類型及活性，為接下來尋找活性菌株及其次級代謝產物做好參考與鋪墊。

表7 13株放線菌(煙臺(2015))發(fā)酵產物抗菌活性結果(mm)Table 7 The results of antibacterial activity of fermentation broth of 13 strains (yantai (2015)) of actinomycetes

圖5 部分抑菌活性圖片F(xiàn)ig.5 Some pictures of antibacterial and antifungal activity

3 結論與討論

昆蟲與微生物的共生是長期進化而獲得的一項生存技能，在共生中，大多數(shù)的共生體供給寄主營養(yǎng)，防御性共生體(多為放線菌)產生的次級代謝產物能夠對昆蟲微生物的共生起到保護作用，使這個體系更加的穩(wěn)定持續(xù)下去(張修梅，2016)。

樹蜂科大部分昆蟲均能與淀粉韌革菌屬真菌存在互利共生關系(李大鵬等，2015)，松樹蜂共生菌能夠引起寄主樹木的失水，引起細胞的死亡，進而營造出適合松樹蜂侵染寄主樹木適宜的干燥環(huán)境(Kingetal., 1966; Kile and Turnbull, 1974)。共生菌能夠產生胞外漆酶，在降解寄主樹木木質纖維素等物質從而破壞樹木內部結構起重要作用(Buchanan, 2001; Bordeaux, 2008)。Toru等(2012)首次從Coptotermesformosanus的腸道共生放線菌發(fā)酵液中分離得到actinomycin X2 (C62H84N12O17，色素肽內酯類抗生素)及其類似物actinomycin D (C62H86N12O16，首個有抗癌活性的抗生素)。與異小桿屬線蟲共生的發(fā)光桿菌能夠產生芪類衍生物(Timothyetal., 2014；張修梅，2016)；與苔蘚共生的細菌產生的化合物很多具有抗菌性質(Franzetal., 2006；張修梅，2016)。近期發(fā)現(xiàn)的的一個新型鏈霉菌屬衍生物mycangimycin能夠對南方松甲蟲瘤額大小蠹有益共生真菌的競爭性抑制真菌有選擇性抑制作用(Michaeletal., 2011；張修梅，2016)。

近年來，從膜翅目昆蟲共生放線菌中發(fā)現(xiàn)的化合物有抗霉素Antimycin (Michaeletal., 2011)、殺假絲菌素Candicidin D (Susanneetal., 2008)、制霉菌素Nystatin (Ryanetal., 2012)、殺粉蝶霉素Piericidin (Johannesetal., 2010)，羧肽類化合物Dentigerumycin (Ohetal., 2009)、Microtermolides (Carretal., 2012)、制霉菌素氨基糖苷類衍生物(Barkeetal., 2010)及從泥蜂共生鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)的大環(huán)內酯類化合物Sceliphrolactam (Ohetal., 2011)等等。由此可見，膜翅目昆蟲共生放線菌是極具潛力的新型抗菌藥物重要來源。昆蟲放線菌共生體系是一個很有前途的發(fā)現(xiàn)新型化合物的來源方向。

活性菌株的篩選在尋找有活性的次級代謝產物起重要的指導作用。本研究中在進行活性菌株篩選時，將菌塊對峙法和紙片擴散法兩種不同的抗菌方法相結合，此外，還需對菌株次級代謝產物產量及豐富度進行篩選，綜合抗菌活性、代謝產物產量和豐富度各方面因素選擇最優(yōu)活性菌株，進行次級代謝產物分離純化深入研究，以期找到新型結構化合物。