棉鈴蟲幾丁質(zhì)合成酶1基因的時(shí)空表達(dá)分析及氟啶脲對(duì)其表達(dá)的影響

臺(tái)術(shù)蕾,馬 龍,張春妮

(西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,陜西楊凌 712100)

幾丁質(zhì)(Chitin)是由N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetyl glucosamine, GlcNAc)聚合而成的多糖單分子聚合物，是無(wú)脊椎動(dòng)物外殼以及真菌藻類細(xì)胞壁的重要組成成分，在個(gè)體生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要的作用(Merzendorfer and Zimoch, 2003; Merzendorfer, 2011; Wangetal., 2012; Tetreauetal., 2015)。在昆蟲中，幾丁質(zhì)是表皮、氣管以及中腸圍食膜等結(jié)構(gòu)的重要組成物質(zhì)(Merzendorfer, 2006，2011)。幾丁質(zhì)合成酶(chitin synthase, CHS)主要作用于幾丁質(zhì)代謝過(guò)程，對(duì)昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育發(fā)揮關(guān)鍵作用。它與幾丁質(zhì)降解酶系共同作用，維持昆蟲幾丁質(zhì)水平的動(dòng)態(tài)平衡(Kramer and Koga, 1986；樊東等，2005；劉曉健等，2014)。

目前研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲中的幾丁質(zhì)合成酶主要由幾丁質(zhì)合成酶1(CHS1)和幾丁質(zhì)合成酶2(CHS2)兩個(gè)基因編碼，二者存在于同一條染色體上，可能從同一祖先的基因復(fù)制進(jìn)化而來(lái)(Zimoch and Merzendorfer, 2002; Arakaneetal., 2004; Hogenkampetal., 2005; Merzendorfer, 2006；張文慶等，2011；劉曉健等，2014)。CHS1和CHS2基因在昆蟲體內(nèi)具有不同功能，其中CHS1基因主要負(fù)責(zé)外胚層相關(guān)細(xì)胞如氣管細(xì)胞的幾丁質(zhì)合成，其在氣管和表皮等組織中高度表達(dá)，而CHS2基因則參與圍食膜細(xì)胞中幾丁質(zhì)的合成，主要在昆蟲中腸上皮細(xì)胞中表達(dá)(Tellametal., 2000; Gagouetal., 2002; Devineetal., 2005; Zimochetal., 2005; Hogenkampetal., 2005; Merzendorfer, 2006；張文慶等，2011；劉曉健等，2014)。有研究表明，果蠅DrosophilamelanogasterDmCHSA在幼蟲蛻皮和成蛹過(guò)程中表達(dá)量很高(Gagouetal., 2002)。煙草天蛾Manducasexta中，MsCHSA在幼蟲蛻皮期和蛹中期表達(dá)較高(Zhuetal., 2002)。

氟啶脲(chlorfluazuron)是一種苯甲?；孱悮⑾x劑(benzoylphenylureas insecticides, BUPs)，作用于害蟲的幾丁質(zhì)合成過(guò)程(楊光富等，1999；楊惠和張金桐，2001；米娜等，2009；馬龍等，2014)，對(duì)鱗翅目害蟲具有較好的防治效果。由于幾丁質(zhì)合成酶是昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵性酶(劉曉健等，2014)，其作為苯甲?；孱悮⑾x劑的潛在藥物靶標(biāo)一直備受關(guān)注(Merzendorfer and Zimoch, 2003；劉曉健等，2010)。棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(Hübner)屬于鱗翅目夜蛾科，是重要的世界性農(nóng)業(yè)害蟲之一；不僅嚴(yán)重影響棉花生產(chǎn)，還可危害十字花科、豆科、茄科甚至禾本科植物(Martinetal., 2005)。目前尚未有關(guān)于棉鈴蟲幾丁質(zhì)合成酶功能研究的報(bào)道。為此，本研究以棉鈴蟲為研究對(duì)象，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR, RT-qPCR)分析方法明確棉鈴蟲幾丁質(zhì)合成酶基因1(HaCHS1)在不同的發(fā)育時(shí)期和組織的表達(dá)情況，測(cè)定了苯甲酰基脲類殺蟲劑氟啶脲對(duì)棉鈴蟲HaCHS1表達(dá)水平的影響，以期為研究棉鈴蟲HaCHS1基因的功能研究奠定良好的基礎(chǔ)，同時(shí)為棉鈴蟲生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中機(jī)制的探索及基于幾丁質(zhì)合成途徑中關(guān)鍵靶點(diǎn)的新藥研發(fā)提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

棉鈴蟲敏感品系由本實(shí)驗(yàn)室采用人工飼料飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件：溫度27±1℃，相對(duì)濕度70%±5%，光照周期(L ∶D)為16 h ∶8 h，用10%蜂蜜水供給成蟲營(yíng)養(yǎng)。

1.2 棉鈴蟲幾丁質(zhì)合成酶基因1的克隆

按照RNAiso Plus(TaKaRa)試劑說(shuō)明書，對(duì)棉鈴蟲3齡幼蟲進(jìn)行總RNA的提取，取1.0 μg總RNA作為模板，按照PrimeScriptTM1stStrand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)試劑盒說(shuō)明書，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

采用cDNA末端快速擴(kuò)增(rapid amplification cDNA ends, RACE)技術(shù)，基于實(shí)驗(yàn)室前期獲得的棉鈴蟲幾丁質(zhì)合成酶1基因片段序列，分別在3′端設(shè)計(jì)特異性上游引物CHS1-3F1(5′-TGAGCC AATCGGTTTAGTGTTCGTGT-3′)和CHS1-3F2(5′-ACGATTATGACAACGACTCGGGCTC-3′)，然后分別與3′ RACE擴(kuò)增中的錨定引物3 R-outer和3 R-inner組合，進(jìn)行巢式PCR，獲得HaCHS1基因3′端cDNA序列。在5′端設(shè)計(jì)特異性下游引物CHS1-5R1(5′-CGTGAAAGCAAGCCAAGTATCG-3′)和CHS1-5R2(5′-CCACATCCACGCCACTCGCTCT-3′)，分別與5′ RACE實(shí)驗(yàn)中的接頭引物5 R-outer和5 R-inner組合，進(jìn)行巢式PCR，獲得HaCHS1基因5′端cDNA序列。將測(cè)序獲得的3′端片段、5′端片段及中間保守區(qū)域序列由Contig Express(http://www.invitrogen.com)軟件重新組裝后獲得棉鈴蟲幾丁質(zhì)合成酶1基因全長(zhǎng)cDNA序列。根據(jù)這段序列設(shè)計(jì)引物ORF1(5′-AACATGGCGACGTCGGG AGG-3′)和ORF2(5′-CATTTAAAATCTACCCT GGAAGG-3′)用于ORF序列的驗(yàn)證。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸5 min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收后與pMD-18T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，菌落PCR鑒定正確后進(jìn)行測(cè)序。

1.3 生物信息學(xué)分析

采用在線軟件ProtParam(http://web.expasy. org/protparam/)對(duì)蛋白質(zhì)的分子量和等電點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用SignalP-4.0 Server(http://www.cbs. dtu.dk/service/SignalP/)和NetNGlyc(http://www.cbs.dtu.dk/services/Net NGlyc/)分別對(duì)信號(hào)肽結(jié)構(gòu)和糖基化位點(diǎn)進(jìn)行分析；運(yùn)用TMHMM 2.0 Server軟件(http://www.ch.embnet.org/)分析蛋白質(zhì)跨膜區(qū)；采用NCBI在線工具BLAST(http://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行同源搜索；應(yīng)用MEGA 5.05軟件Neighbor-Joining法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系的分析。

1.4 HaCHS1基因在不同發(fā)育時(shí)期和組織中的表達(dá)

1.4.1RNA提取與cDNA合成

收集生長(zhǎng)狀況良好且蟲體大小均一的1齡、2齡幼蟲、3～6齡的第1～3天幼蟲、預(yù)蛹期及第1、2和3天蛹，共3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。另外，取棉鈴蟲6齡中期幼蟲15～20頭，借助體視顯微鏡在生理鹽水中迅速解剖，分離棉鈴蟲頭部、馬氏管、氣管、中腸、表皮和脂肪體等組織，共3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。材料收集后立即放于液氮中冷激，后保存于-80℃冰箱備用。

按照RNAiso Plus(TaKaRa)試劑說(shuō)明書，對(duì)各組樣品進(jìn)行總RNA的提取及純化，取1.0 μg總RNA作為模板，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)試劑盒說(shuō)明書，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

1.4.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

根據(jù)獲得的棉鈴蟲HaCHS1a基因序列設(shè)計(jì)RT-qPCR特異性引物CHS1-QF：5′-GGTTTAGTGT TCGTGTTTT-3′和CHS1-QR：5′-GCATTCTTATCTA GCAGAGC-3′。同時(shí)以EF-1α(GenBank登錄號(hào)：AY325496)為內(nèi)參基因。20 μL反應(yīng)體系：10×cDNA模板2 μL，上下游引物各0.5 μL(10 mM)，2×Ultra SYBR Mixture 10 μL，7 μL ddH2O。反應(yīng)在iQ 5實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)上進(jìn)行，PCR反應(yīng)條件為：95°C 10 min；95°C 15 s，52°C 30 s，72°C 30 s，共40個(gè)循環(huán)；根據(jù)熔解曲線，確定引物及擴(kuò)增特異性。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，并進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。RT-qPCR的檢測(cè)結(jié)果采用Ct值的相對(duì)定量法(2-ΔΔCt)計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量(Livak and Schmittgen, 2001)。

1.5 氟啶脲對(duì)HaCHS1基因表達(dá)的影響

實(shí)驗(yàn)室前期數(shù)據(jù)計(jì)算得出氟啶脲LC10為60 mg/L。參照馬龍等(2014)的方法：挑選大小一致、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的棉鈴蟲3齡中期幼蟲，饑餓處理8 h，隨后將試蟲在氟啶脲LC10(60 mg/L)藥劑中直接浸藥10 s取出，放于干凈的濾紙上吸干藥液，隨后放入飼養(yǎng)盒中飼喂新鮮的飼料。以0.1%吐溫處理作為對(duì)照，設(shè)3組生物學(xué)重復(fù)，每組15頭試蟲。飼喂處理24 h、48 h、72 h后分別收集對(duì)照組和處理組棉鈴蟲，然后提取整蟲RNA，進(jìn)行cDNA第一鏈的合成及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，具體方法和步驟同1.4.1和1.4.2。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)”表示。采用SPSS 17.0軟件對(duì)時(shí)空表達(dá)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析；用studentt-test方法對(duì)藥劑處理前后的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 HaCHS1基因的生物信息學(xué)分析

通過(guò)RT-PCR和RACE技術(shù)克隆獲得棉鈴蟲HaCHS1基因全長(zhǎng)cDNA序列(GenBank登錄號(hào)：MK568465)。HaCHS1全長(zhǎng)為5 247 bp，ORF為4 698 bp，編碼1 565個(gè)氨基酸，5′非翻譯區(qū)為168 bp，3′非翻譯區(qū)為381 bp。使用在線軟件ExPASy分析發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲HaCHS1蛋白的理論分子量為180.7 kDa，等電點(diǎn)(pI)為6.50，預(yù)測(cè)分子式為C14203H23710N4698O5937S1002；使用TMHMM 2.0 Server軟件對(duì)其進(jìn)行跨膜區(qū)分析，發(fā)現(xiàn)HaCHS1具有16個(gè)跨膜螺旋(圖1)，故推測(cè)HaCHS1為跨膜蛋白。HaCHS1存在3個(gè)結(jié)構(gòu)域：結(jié)構(gòu)域A位于N端，包含9個(gè)跨膜螺旋；結(jié)構(gòu)域B在中心區(qū)，其含有兩個(gè)標(biāo)簽序列EDR和QRRRW，并且含有兩個(gè)其他的保守序列CATMWHET和QMFEY；結(jié)構(gòu)域C位于C端，包含7個(gè)跨膜螺旋和另一個(gè)標(biāo)簽序列SWGTR。用NetNGlyc軟件對(duì)HaCHS1可能存在的N糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，HaCHS1中存在6個(gè)N-糖基化位點(diǎn)(NVTL、NISS、NWTS、NDSD、NITY和NISV)，分別位于第359、905、944、1 191、1 306和1 518位氨基酸(圖1)。利用軟件SignalP-4.0 Server進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該蛋白不存在信號(hào)肽結(jié)構(gòu)。

圖1 棉鈴蟲HaCHS1基因cDNA序列及推斷的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of HaCHS1 cDNA from Helicoverpa armigera注：起始密碼子(ATG)與終止密碼子(TGA)用黑色著重標(biāo)示，跨膜區(qū)域用陰影部分標(biāo)示，預(yù)測(cè)的保守區(qū)域用方框標(biāo)示，下劃線表示糖基化位點(diǎn)。Note: The start codon (ATG), stop codon (TAA) and putative polyadenylation signal (ATTAAA) are highlighted in black. The 16 hydrophobic, transmembrane α-helices predicted by TMHMM Server v.2.0 are shaded. The potential conserved motifs are in box. The 6 putative N-glycosylation sites predicted by PROSCAN are underlined.

2.2 HaCHS1基因的同源性比對(duì)及分子系統(tǒng)發(fā)育分析

利用ClustalW軟件將棉鈴蟲HaCHS1基因與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中已公布的部分昆蟲的CHS1基因的氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)分析，結(jié)果表明HaCHS1與已知的CHS1基因的氨基酸序列同源性為66%～99%，其中與美洲棉鈴蟲HelicoverpazeaHzCHS1a和HzCHS1b的氨基酸序列同源性最高。

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中選取具有代表性昆蟲物種的10種幾丁質(zhì)合成酶氨基酸序列，利用ClustalX軟件進(jìn)行完全比對(duì)后，再用MEGA 6.06軟件中的Neighbor-Joining方法進(jìn)行分子系統(tǒng)進(jìn)化分析，分析得到的昆蟲幾丁質(zhì)合成酶基因分子進(jìn)化樹(如圖2)。從系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果可以看出，幾丁質(zhì)合成酶基因被分為兩支，即幾丁質(zhì)合成酶1(CHS1)和幾丁質(zhì)合成酶2(CHS2)。所有鱗翅目昆蟲的幾丁質(zhì)合成酶1(HaCHS1、HzCHS1、SeCHS1、MsCHS1和PxCHS1)形成了一個(gè)亞分支，其中HaCHS1與美洲棉鈴蟲、甜菜夜蛾Spodopteraexigua(Hübner)、煙草天蛾Manducasexta和小菜蛾P(guān)lutellaxylostella幾丁質(zhì)合成酶1親緣關(guān)系較近，這與傳統(tǒng)上的分類一致。

圖2 基于氨基酸序列構(gòu)建的棉鈴蟲及其他昆蟲幾丁質(zhì)合成酶基因CHS的分子進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on the amino acid sequences of insect chitin synthases注：所選生物物種的幾丁質(zhì)合成酶基因序列包括岡比亞按蚊Anopheles gambiae (AgCHS1, XP_321336), 意大利蜜蜂Apis mellifera (AmCHS1, XP_395677; AmCHS2, XP_001121152), 黑腹果蠅Drosophila melanogaster (DmCHS1, NP524233; DmCHS2, NP001137997), 絲光綠蠅Lucilia cuprina (LcCHS1, AAG09712), 煙草天蛾Manduca sexta (MsCHS1, AAL38051; MsCHS2, AAX20091), 小菜蛾P(guān)lutella xylostella (PxCHS1, BAF47974), 甜菜夜蛾Spodoptera exigua (SeCHS1, AAZ03545; SeCHS2, ABI96087), 斜紋夜蛾Spodoptera frugiperda (SfCHS2, AAS12599), 赤擬谷盜Tribolium castaneum (TcCHS1, AAQ55059; TcCHS2, AAQ55061), 美洲棉鈴蟲Helicoverpa zea (HzCHS1, ADX66429).

2.3 HaCHS1基因在棉鈴蟲不同發(fā)育時(shí)期和組織中的表達(dá)分析

選取1齡、2齡幼蟲、3～6齡第1～3天幼蟲、預(yù)蛹期及第1、2和3天蛹，對(duì)HaCHS1基因的表達(dá)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)HaCHS1基因在4齡～5齡幼蟲的中期表達(dá)量較低，而在前期或后期表達(dá)量較高；在預(yù)蛹期表達(dá)量最低，在蛹期第一天表達(dá)量達(dá)到最高，隨后逐漸降低(圖3)。

圖3 幾丁質(zhì)合成酶1基因(HaCHS1)在棉鈴蟲不同發(fā)育時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Relative expression levels of chitin synthase 1 gene (HaCHS1) in different developmental stages注：以表達(dá)量最低P0為1；1L，1齡幼蟲；2L，2齡幼蟲；3L1，3齡幼蟲第1天；3L2，3齡幼蟲第2天；P0，預(yù)蛹期；P1，蛹期第一天。柱狀圖上不同的小寫字母表示5%水平差異顯著(Student-Newman-Keuls (SNK)單因素方差分析)。Note: The relative expression was calculated based on the value of the lowest expression which was ascribed an arbitrary value of 1. The age in days of the insects is indicated, e.g., 1L, first-instar larvae; 2L, second-instar larvae; 3L1, first day of third-instar larvae; 3L2, second day of third-instar larvae; P0, the stage of prepupae; and P1, first day of pupae. Different lower-letters above the bars indicate significant differences (P<0.05, Student-Newman-Keuls (SNK) in one way ANOVA).

對(duì)棉鈴蟲6齡中期幼蟲不同組織HaCHS1基因表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明(圖4)，HaCHS1基因在頭部表達(dá)量最高，其次是表皮，而在中腸、氣管、馬氏管和脂肪體中的表達(dá)量均極低。

圖4 幾丁質(zhì)合成酶1基因(HaCHS1)在棉鈴蟲不同組織相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Relative expression levels of HaCHS1 in different tissues of Helicoverpa armigera注：以組織最低表達(dá)量為1；IN，MG，HE，TR，MT和FB分別表示表皮、中腸、頭部、氣管、馬氏管和脂肪體；柱子表示平均值±SE，3個(gè)生物學(xué)重復(fù)；不同的字母表示差異顯著(P<0.05，Student-Newman-Keuls (SNK)單因素方差分析)。Note: Expression levels in integument (IN), midgut (MG), head (HE), trachea (TR), malpighian tubules (MT) and fatbody (FB) were detected by qPCR. Different letters above the bars indicate significant differences (P<0.05, Student-Newman-Keuls (SNK) in one way ANOVA).

2.4 氟啶脲對(duì)棉鈴蟲幾丁質(zhì)合成酶基因 HaCHS1表達(dá)的影響

用LC10濃度(60 mg/L)氟啶脲藥劑處理棉鈴蟲3齡中期幼蟲，利用RT-qPCR對(duì)處理后不同時(shí)間試蟲體內(nèi)的HaCHS1基因表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖5)：氟啶脲處理后HaCHS1基因呈現(xiàn)出“抑制-激活-再抑制”的作用。處理后24 h和72 h，HaCHS1表達(dá)水平顯著低于對(duì)照(P<0.05)，而在處理后48 h，處理組HaCHS1表達(dá)水平則顯著高于對(duì)照(P<0.05)。

圖5 氟啶脲處理棉鈴蟲3齡幼蟲后不同時(shí)間HaCHS1基因相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative expression levels of HaCHS1 after exposure to chlorfluazuron注：表達(dá)量最低為1；柱子上的*表示處理組與對(duì)照組相比顯著差異P<0.05(Student t-test檢驗(yàn))。Note: The lowest expression is ascribed an arbitrary value of 1; * on the column indicates a significant difference between the treatment group and the control group (P<0.05, Student t-test).

3 結(jié)論與討論

幾丁質(zhì)合成酶(CHS)是參與幾丁質(zhì)生物合成過(guò)程的重要酶類，是幾丁質(zhì)合成途徑最后一步的關(guān)鍵酶，在生物體中尤其在昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育等方面發(fā)揮著重要作用。本研究克隆獲得棉鈴蟲HaCHS1基因cDNA序列，HaCHS1全長(zhǎng)為5 247 bp，ORF為4 698 bp，編碼1 565個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)HaCHS1存在16個(gè)跨膜區(qū)。煙草天蛾ManducasextaMsCHS1基因編碼1 564個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)存在16個(gè)跨膜螺旋(Zhuetal., 2002)。昆蟲幾丁質(zhì)合成酶基因跨膜螺旋的數(shù)目(15～18)比真菌(5～7)多，推測(cè)這些豐富的跨膜螺旋可能參與了幾丁質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程(Zhuetal., 2002; Tellametal., 2000)。HaCHS1存在3個(gè)結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域A位于N端，包含9個(gè)跨膜螺旋。不同昆蟲結(jié)構(gòu)域A具有不同數(shù)量的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，序列相似性最小。跨膜螺旋的數(shù)量決定N端位于膜的不同側(cè)面，面向細(xì)胞外環(huán)境或細(xì)胞質(zhì)(Merzendorfer and Zimoch, 2003)。HaCHS1結(jié)構(gòu)域B在中心區(qū)，包含兩個(gè)獨(dú)特的標(biāo)簽序列，EDR和QRRRW，它們存在于所有類型的幾丁質(zhì)合成酶中，是催化機(jī)制中必不可少的(Merzendorfer and Zimoch, 2003; Tellametal., 2000)；結(jié)構(gòu)域C位于C端，包含7個(gè)跨膜螺旋和另一個(gè)標(biāo)簽序列SWGTR，具有較小的序列相似性。

昆蟲的CHS1表達(dá)具有明顯的組織特異性。甜菜夜蛾SeCHS1主要在表皮、氣管和中腸組織表達(dá)，而在脂肪體和馬氏管表達(dá)量很低或幾乎沒(méi)有表達(dá)(Chenetal., 2007)。梨小食心蟲GrapholithamolestaGmCHS1主要在體壁、頭部和氣管中表達(dá)，在中腸中的表達(dá)量遠(yuǎn)低于體壁(楊靜等，2017)。通過(guò)RT-qPCR對(duì)棉鈴蟲不同組織HaCHS1基因表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因主要在棉鈴蟲表皮和頭部組織中表達(dá)，而在中腸、氣管、脂肪體和馬氏管等其他組織中表達(dá)量很低，結(jié)果與先前在東亞飛蝗Locustamigratoriamanilensis(劉曉健，2010；Zhangetal., 2010)、煙草天蛾(Hogenkampetal., 2005)和赤擬谷盜Triboliumcastaneum(Arakaneetal., 2005)中的研究是一致的。

在甜菜夜蛾中，SeCHS1基因在預(yù)蛹期表達(dá)量較低，而進(jìn)入蛹期以后表達(dá)量又顯著增加(Chenetal., 2007)。此外，在玉米螟Ostriniafurnacalis中也呈現(xiàn)出一致的結(jié)果(Qu and Yang, 2011)。本研究結(jié)果表明，HaCHS1在4齡和5齡幼蟲的前期或后期表達(dá)量較高，而在中期表達(dá)較低。在預(yù)蛹期表達(dá)量最低，但進(jìn)入蛹期之后表達(dá)量急劇上升，且蛹期第一天表達(dá)量最高。這就說(shuō)明HaCHS1在棉鈴蟲蛻皮過(guò)程以及從幼蟲期向蛹期變態(tài)轉(zhuǎn)化過(guò)程中起著重要的作用，可能參與棉鈴蟲變態(tài)過(guò)程中幾丁質(zhì)的合成(Arakaneetal., 2004; Ampasalaetal., 2011；張文慶等，2011)。Arakane等(2005)報(bào)道利用RNA干擾(RNA interference, RNAi)沉默赤擬谷盜TcCHS1基因后，在幼蟲到下一齡幼蟲階段、幼蟲化蛹階段以及蛹羽化為成蟲階段的蛻皮都受到不同程度的影響。抑制中華稻蝗Oxyachinensis的CHS1基因表達(dá)后，導(dǎo)致其蛻皮時(shí)間延遲，出現(xiàn)不能正常完成蛻皮過(guò)程或部分個(gè)體腹部皺縮致死的現(xiàn)象(余志濤等，2012)。利用RNAi技術(shù)抑制甜菜夜蛾CHS1基因表達(dá)后，導(dǎo)致幼蟲出現(xiàn)蛻皮障礙、新的幾丁質(zhì)層不能正常形成或氣管發(fā)育畸形現(xiàn)象(Kramer and Koga, 1986; Chenetal., 2008)。

苯甲?；孱悮⑾x劑能干擾靶標(biāo)害蟲的幾丁質(zhì)合成過(guò)程，抑制蟲體內(nèi)幾丁質(zhì)的合成，從而導(dǎo)致害蟲死亡或不育。研究表明，氟蟲脲(flufenoxuron)能夠上調(diào)東亞飛蝗和中華稻蝗中CHS1基因的表達(dá)水平(劉曉健等，2010)。然而，氟啶脲處理后小菜蛾CHS1基因表達(dá)沒(méi)有顯著變化(Ashfaqetal., 2007)，可能與藥劑處理后促進(jìn)了蛻皮期間表皮的分離和消化有關(guān)(Xiaetal., 2014)。本研究結(jié)果表明，氟啶脲在亞致死濃度(60 mg/L)下對(duì)棉鈴蟲HaCHS1基因呈現(xiàn)出“抑制-激活-再抑制”的作用。此外，除蟲脲diflubenzuron 能夠顯著提高四斑按蚊Anophelesquadrimaculatus(Zhang and Zhu, 2006)、大豆芽Aphisglycines(Bansaletal., 2012)和褐色橘蚜Toxopteracitricida(Shangetal., 2016)中CHS1的表達(dá)水平，但對(duì)果蠅(Gangishettietal., 2009)和赤擬谷盜(Merzendorferetal., 2012)的CHS1基因表達(dá)沒(méi)有影響。除蟲脲處理后，四斑按蚊幾丁質(zhì)合成酶活性降低，導(dǎo)致幾丁質(zhì)含量減少，CHS1基因表達(dá)增加可能是昆蟲體內(nèi)一種補(bǔ)償酶含量減少的反饋調(diào)節(jié)機(jī)制(Zhang and Zhu, 2006)。由于幾丁質(zhì)生物合成過(guò)程嚴(yán)密復(fù)雜，昆蟲生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)其生物合成機(jī)制的影響還需進(jìn)一步研究。