一株玫煙色蟲草對草地貪夜蛾的致病性研究

雷妍圓，呂利華*，王裕華，王德森

(1. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點實驗室，廣州 510640；2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣州 510642)

草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda，屬于鱗翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae，是一種原產(chǎn)于美洲的農(nóng)作物害蟲，具有寄主植物廣、繁殖能力強(qiáng)、遷飛擴(kuò)散快和為害嚴(yán)重等特點，已在美洲、非洲及亞洲對玉米生產(chǎn)造成了巨大損失(Casmuzeetal., 2010; Earlyetal., 2018; 姜玉英等，2019)。2019年1月首次在我國云南省發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)草地貪夜蛾入侵，至目前已在全國21個省份蔓延，危害程度逐日增加(姜玉英等，2019；王磊等，2019；楊普云等，2019)。入侵我國的草地貪夜蛾已確認(rèn)為玉米品系(張磊等，2019)，主要在幼蟲期取食為害。幼蟲共有6齡，取食玉米葉片、穗軸、籽粒和鉆蛀根基部，影響玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)，嚴(yán)重時導(dǎo)致植株死亡。廣東地處亞熱帶，氣候適宜且常年種植玉米，為草地貪夜蛾越冬提供了優(yōu)越的寄主條件，是草地貪夜蛾的周年繁殖區(qū)，防控任務(wù)艱巨(郭井菲等，2018；廖永林等，2019)。根據(jù)“長短結(jié)合、標(biāo)本兼治”的防治原則(楊普云等，2019)，昆蟲病原真菌作為生物防治的一個重要組成部分，在持續(xù)控制蟲害、保護(hù)生態(tài)平衡方面具有不可替代的作用(Shah and Pell, 2003; 張禮生和陳紅印, 2014)。篩選對草地貪夜蛾高特異性和高效率的生防病原真菌，是我國草地貪夜蛾可持續(xù)防控工作的重要任務(wù)。

據(jù)報道，白僵菌Beauveriaspp.和綠僵菌Metarhiziumanisopliae對草地貪夜蛾卵和低齡幼蟲有一定的防治效果(Lezama Gutiérrezetal., 2001; Garcíaetal., 2011; Thomazonietal., 2014)。在利用玫煙色蟲草Cordycepsfumosorosea[原玫煙色棒束孢Isariafumosorosea(Kepleretal., 2017) ]防治草地貪夜蛾方面，除了個別研究提到可用于防治低齡幼蟲(Lezama Gutiérrezetal., 1996)，其余未見相關(guān)研究和報道。玫煙色蟲草作為一類國際上研究和應(yīng)用較為廣泛的昆蟲病原真菌，能寄生同翅目、鱗翅目、雙翅目、鞘翅目和膜翅目等多種有害昆蟲(Meyeretal., 2008; 雷妍圓等, 2011; Huetal., 2011; Asietal., 2013)。本研究室曾報道一株高致病力的玫煙色蟲草SCAU-IFCF01(呂利華等, 2007)，其對鱗翅目害蟲小菜蛾P(guān)lutellaxylostlla2齡幼蟲的LT50僅1.72 d，LC50為1.17×104孢子/mL，表現(xiàn)出對該類害蟲巨大的防控應(yīng)用潛力。本文研究了該菌株對草地貪夜蛾幼蟲的侵染過程及致病力，以明確該菌株對草地貪夜蛾幼蟲的致病性、防治時期和防治劑量濃度等參數(shù)，為評價玫煙色蟲草對草地貪夜蛾的防治潛力，研發(fā)相關(guān)高效生防制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源和菌株

草地貪夜蛾幼蟲采集于廣東省廣州市白云區(qū)鐘落潭鎮(zhèn)廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院白云基地“粵甜28”甜玉米(ZeamaysL.)植株上，在實驗室用玉米葉和果穗飼養(yǎng)至化蛹，待其羽化產(chǎn)卵后建立實驗室種群作為供試蟲源。室內(nèi)飼養(yǎng)條件為26℃±1℃，相對濕度60%～90%，光照條件14 L ∶10 D。玫煙色蟲草菌株SCAU-IFCF01(雷妍圓等，2010)接種于薩氏培養(yǎng)基SDAY(葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，酵母膏10 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 L)平板上，27℃全黑暗條件下培養(yǎng)20 d待用。

1.2 玫煙色蟲草對草地貪夜蛾幼蟲侵染癥狀觀察

從SDAY平板上收集玫煙色蟲草IFCF01分生孢子，以滅菌0.05%吐溫-80溶液配制1×109孢子/mL濃度孢子懸浮液，分別接種草地貪夜蛾1～6齡幼蟲，每個齡期接種10頭，接種后每天觀察幼蟲存活情況及感染病蟲的外部特征，分別于處理后24 h、48 h、72 h、96 h和120 h時依次取樣。將死亡幼蟲保濕培養(yǎng)，24 h后檢查，蟲體表面長出白色菌絲或淺玫煙色分生孢子的視為玫煙色蟲草感染致死。

1.3 玫煙色蟲草對草地貪夜蛾幼蟲的致病力測定

采用浸蟲法處理草地貪夜蛾幼蟲，以滅菌0.05%吐溫-80溶液分別配制5個濃度梯度的孢子懸浮液(1×105、1×106、1×107、1×108和1×109孢子/mL)，每個濃度為一個處理，以滅菌0.05%吐溫-80溶液為對照。分別選擇個體大小、活力一致的1～6齡幼蟲，放入供試孢子濃度的懸浮液中，浸漬10 s后挑出，置于濾紙上吸去多余水分，移至皿底墊有濕潤濾紙片的培養(yǎng)皿(d=9 cm)中，皿內(nèi)放入新鮮玉米葉和果穗供其取食，置于人工智能箱中飼養(yǎng)(26±1℃，RH 90%±5%，14 L ∶10 D)。每個處理3個重復(fù)，每個重復(fù)處理10頭幼蟲。持續(xù)觀察5 d，每天記錄幼蟲的死亡數(shù)量，對死亡幼蟲進(jìn)行保濕培養(yǎng)，確定死亡原因。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel整理后，使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行處理分析，統(tǒng)計各處理幼蟲的累計死亡率。采用Probit方法計算致死中時(LT50)，求回歸方程及計算致死中濃度(LC50)。

2 結(jié)果與分析

2.1 感染玫煙色蟲草的草地貪夜蛾幼蟲癥狀

草地貪夜蛾1～6齡幼蟲均可被IFCF01感染(圖1 A-F)。接種后第5天，各齡期幼蟲出現(xiàn)玫煙色蟲草感染致死個體。感菌的低齡幼蟲(1～3齡)體表覆蓋菌絲和分生孢子，分生孢子呈淺玫煙色。感菌高齡幼蟲(4～6齡)死亡時間相對低齡較晚，蟲體表面被白色菌絲包裹。

以4齡幼蟲為例，在感菌初期，幼蟲取食行為、蟲體外部形態(tài)與健康幼蟲無差別(圖2 A)。接種48 h，幼蟲取食明顯減少或停止取食，部分幼蟲瀕死，蟲體呈油浸狀，出現(xiàn)強(qiáng)直癥狀，體色出現(xiàn)不均勻改變，對觸碰反應(yīng)遲鈍。幼蟲腹末、胸足基部、腹側(cè)體壁等區(qū)域出現(xiàn)菌絲，表明這些部位最易受到菌體侵染(圖2 B)。接種72 h，感菌幼蟲死亡，蟲體略縮短萎縮，除頭殼區(qū)域外，幼蟲大部分體表布滿菌絲(圖2 C)。接種96 h，幼蟲的頭部、胸部和腹部均被濃密的白色菌絲所覆蓋(圖2 D)。接種120 h，幼蟲體表的菌絲產(chǎn)孢，蟲體被玫煙色分生孢子覆蓋(圖2 E)。

2.2 玫煙色蟲草IFCF01對草地貪夜蛾幼蟲的致病力

用5個濃度玫煙色蟲草IFCF01孢子懸浮液處理草地貪夜蛾1～6齡幼蟲后，隨著孢子濃度增加和時間推移，幼蟲累計死亡率逐漸升高(圖3)。用1×105孢子/mL 濃度處理幼蟲，5 d后1～6齡幼蟲的累計死亡率分別為66.7%、54.5%、47.8%、36.7%、22.2%和2.23%。隨著濃度的升高，該菌株對各齡幼蟲的致死率逐漸升高。當(dāng)孢子濃度為1×109孢子/mL時，1～3齡幼蟲的累計死亡率均達(dá)100%，4齡和5齡幼蟲也達(dá)98.9%和50.0%，6齡幼蟲達(dá)21.1%。當(dāng)孢子濃度為1×105和1×106孢子/mL時，4齡、5齡和6齡幼蟲死亡率均低于50%，當(dāng)濃度增加到1×107和1×108孢子/mL時，5齡和6齡幼蟲死亡率低于50%，再增加到1×109孢子/mL，6齡幼蟲的也低于50%。

應(yīng)用Probit模型，計算玫煙色蟲草IFCF01處理的草地貪夜蛾1齡至5齡幼蟲LC50值(表1)，其分別為3.74×104、1.17×105、1.86×105、8.09×105和3.03×108孢子/mL。結(jié)果表明致死率50%的濃度，1齡幼蟲最低，104孢子/mL，2～4齡均為105，對5齡幼蟲的LC50最高，108孢子/mL。上述結(jié)果表明，草地貪夜蛾低齡(1～3齡)和4齡幼蟲對該菌株較敏感，5齡幼蟲其次，6齡幼蟲最難受到侵染并致死。

圖1 草地貪夜蛾各齡期幼蟲感染玫煙色蟲草IFCF01的外部癥狀(第5天)Fig.1 The external symptoms of Spodoptera frugiperda larvae infected by Cordyceps fumosorosea strain IFCF01 on the 5th day注：A，1齡；B，2齡；C，3齡；D，4齡；E，5齡；F，6齡。Note: A, 1st instar; B, 2nd instar; C, 3rd instar; D, 4th instar; E, 5th instar; F, 6th instar.

圖2 感染玫煙色蟲草IFCF01的草地貪夜蛾4齡幼蟲癥狀Fig.2 The symptoms of 4th instar larvae of Spodoptera frugiperda at the different stage after infection treatment注：A，接種后24 h；B，接種后48 h；C，接種后72 h；D，接種96 h；E，接種后120 h。Note: A, 24 h after inoculation; B, 48 h after inoculation; C, 72 h after inoculation; D, 96 h after inoculation; E, 120 h after inoculation.

圖3 玫煙色蟲草IFCF01對草地貪夜蛾幼蟲的致病力Fig.3 The pathogenicity of Cordyceps fumosorosea strain IFCF01 against Spodoptera frugiperda larvae注：A，1齡；B，2齡；C，3齡；D，4齡；E，5齡；F，6齡。Note: A, 1st instar; B, 2nd instar; C, 3rd instar; D, 4th instar; E, 5th instar; F, 6th instar.

表1 玫煙色蟲草IFCF01對草地貪夜蛾幼蟲的致病力回歸方程

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；“-”表示草地貪夜蛾幼蟲的最終死亡率低于50%，無法估算LC50。
Note: Data in a column are presented as Mean±S.D.; “-” represent that the mortality of infected larvae was less than 50%, LC50values cannot be estimated.

2.3 玫煙色蟲草IFCF01對草地貪夜蛾幼蟲的致死時間效應(yīng)

隨玫煙色蟲草IFCF01孢子懸浮液濃度的增加，草地貪夜蛾幼蟲的致死中時(LT50)縮短(表2)。孢子濃度越高，幼蟲的LT50值越小，在1.0×105～1.0×109孢子/mL范圍內(nèi)，1齡幼蟲LT50從3.62 d降至1.37 d，對2齡幼蟲的LT50從4.51 d降至1.65 d；在濃度為1.0×106～1.0×109孢子/mL的范圍內(nèi)，對3齡幼蟲的LT50從4.03 d降至1.82 d；在濃度為1.0×107～1.0×109孢子/mL范圍內(nèi)，對4齡幼蟲的LT50從3.47 d降至2.52 d；濃度為1.0×109孢子/mL時，5齡幼蟲的LT50為4.74 d。當(dāng)濃度為1.0×105和1.0×109孢子/mL時，3齡和6齡幼蟲的最終死亡率分別為47.8%和21.1%，均低于50%；1.0×105和1.0×106孢子/mL時，4齡幼蟲的最終死亡率從36.7%升至43.3%；濃度為1.0×105～1.0×108孢子/mL時，5齡和6齡幼蟲的最終死亡率分別從22.2%升至48.9%和2.23%升至16.7%，均低于50%，因此無LT50值。

表2 玫煙色蟲草IFCF01對草地貪夜蛾幼蟲的致死中時間

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；“-”表示草地貪夜蛾幼蟲的最終死亡率低于50%，無法估算LT50。
Note: Data in a column are presented as Mean±S.D.; “-”represent that the mortality of infected larvae was less than 50%, LT50values cannot be estimated.

3 結(jié)論與討論

寄主昆蟲的表皮是抵御病原真菌侵染的第一道屏障(Buttetal., 1995)，分生孢子在表皮的附著速度是影響菌株致病力的一個重要因素。玫煙色蟲草分生孢子在寄主表皮上附著能力越強(qiáng)，其致病力也越強(qiáng)(Altreetal., 1999; Altre and Vandenberg, 2001)。本研究中的供試玫煙色蟲草IFCF01接種于草地貪夜蛾4齡幼蟲，分生孢子能夠從腹末、胸足基部、腹側(cè)體壁等區(qū)域附著和萌發(fā)進(jìn)入體內(nèi)，且在后期可在幼蟲較堅硬的頭殼成功侵入和菌絲生長，說明菌株IFCF01對草地貪夜蛾幼蟲具有較好的附著和侵染能力。玫煙色蟲草IFCF01對草地貪夜蛾1齡至6齡幼蟲均有侵染效果，但齡期間的致病力差異較大，低齡幼蟲對玫煙色蟲草的敏感性高于高齡幼蟲，尤其是1齡幼蟲易受感染且致死時間短。在較適溫度下，草地貪夜蛾幼蟲生長發(fā)育迅速，尤其是低齡幼蟲的歷期更短，僅1～2 d，蛻皮快，因此真菌孢子容易隨幼蟲蛻皮而被剝離體表，但試驗中供試菌侏對低齡幼蟲仍有極高致病力，這可能與該菌株快速的入侵能力有關(guān)。與低齡幼蟲相比，高齡幼蟲的歷期較長，為孢子侵染提供了更充足的時間，然而本試驗中高濃度孢子懸浮液卻對6齡幼蟲的致死率僅21.1%(1.0×109孢子/mL)，推測這可能與高齡幼蟲的體壁結(jié)構(gòu)和免疫能力有關(guān)，即鱗翅目昆蟲的低齡幼蟲體壁較薄，真菌孢子更易穿透并完成侵染，而高齡幼蟲體壁蠟質(zhì)層增厚，表皮硬化加強(qiáng)、幼蟲免疫和代謝能力增強(qiáng)而更具抗病性(蒲蟄龍和李增智, 1996; Meyeretal., 2008)。

昆蟲病原真菌致病力是篩選高效菌株的主要依據(jù)之一，也是衡量其防效潛力的重要指標(biāo)之一。死亡率越高且LT50越短，意味著病原真菌具有更好的致病力。據(jù)報道，用35株球孢白僵菌Beauveriabassiana菌株和14株金龜子綠僵菌Metarhiziumanisopliae對草地貪夜蛾進(jìn)行致病力篩選，僅有1株球孢白僵菌菌株Unioeste 26可導(dǎo)致草地貪夜蛾3齡幼蟲44.5%死亡率(Thomazonietal., 2014)。此外，另有報道1株球孢白僵菌菌株Bb 42對草地貪夜蛾2齡幼蟲的LC50為5.92×103孢子/mL，且1.0×109孢子/mL時，其2齡幼蟲死亡率達(dá)96.6%，致死中時LT50為3.6 d(Garcíaetal., 2011)。本研究表明，對于齡期相同的2齡幼蟲，供試玫煙色蟲草IFCF01的LC50為1.17×105孢子/mL，略高于前者的5.92×103孢子/mL；當(dāng)處理孢子懸浮液也為1.0×109孢子/mL，1～3齡幼蟲的累計死亡率均達(dá)100%，而且4齡幼蟲的也達(dá)98.9%，較白僵菌的致病力強(qiáng)；再以 2齡幼蟲LT50值比較，本研究的僅為1.65 d，較前者的致死速度快。分析表明，本研究中供試玫煙色蟲草菌株具有較強(qiáng)的致病力。

本研究中的菌株IFCF01對高齡幼蟲的LC50遠(yuǎn)大于低齡幼蟲的LC50，在同一孢子濃度下對低齡幼蟲的致病力大于高齡幼蟲，尤其對草地貪夜蛾 4齡以下的幼蟲侵染效果最好，因此利用玫煙色蟲草防治草地貪夜蛾幼蟲的適期是低齡幼蟲種群的高峰期。由于草地貪夜蛾對昆蟲病原真菌的敏感性隨地理種群不同而產(chǎn)生變化(Lezama Gutiérrezetal., 2001)，因此菌株的致病力還可能與試蟲地理種群、菌株本身生物學(xué)特性以及實驗環(huán)境因素有關(guān)。本研究中的玫煙色蟲草IFCF01對草地貪夜蛾低齡幼蟲具有較強(qiáng)的致病力，具有較高的研究價值和市場潛力，但如何發(fā)揮該株玫煙色蟲草在草地貪夜蛾可持續(xù)防控中的作用仍需進(jìn)一步研究。