響應(yīng)面優(yōu)化紅香木樹(shù)皮浸泡酒抗氧化活性以及成分分析

張言，高定烽，李思敏，石峰，熊華斌，2，3，*，高云濤，李曉芬，楊志

（1.云南民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，云南昆明650500；2.云南省跨境民族地區(qū)生物質(zhì)資源清潔利用國(guó)際聯(lián)合研究中心，云南昆明650500；3.民族地區(qū)礦產(chǎn)資源綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650500）

紅香樹(shù)（Anneslea fragrans Wall）為山茶科茶梨屬常綠喬木，又名豬頭果[1]、紅楣和香葉樹(shù)[2]。紅香樹(shù)生命力極強(qiáng)，在云南普洱思茅等地的山坡路旁以及雜草從中都可以找到紅香樹(shù)。紅香木樹(shù)皮研磨成粉末食用可以達(dá)到健胃、舒肝、退熱；其樹(shù)皮直接煮水食用可以治消化不良、腸炎、肝炎[3]。隨著生活水平的提高，人們對(duì)功能食品越來(lái)越關(guān)注。開(kāi)始出現(xiàn)利用功能植物的浸泡酒，如瑪咖浸泡酒[4]、魚(yú)腥草泡酒[5]等。但紅香木樹(shù)皮浸泡酒還缺乏系統(tǒng)報(bào)道。

本試驗(yàn)分別利用紫外分光光度計(jì)（ultraviolet spectrophotometer，UV） 和氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography coupled with mass spectrometry，GC-MS）對(duì)紅香木樹(shù)皮浸泡酒的成分以及抗氧化活性進(jìn)行分析，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用紅香木樹(shù)皮浸泡酒提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅香木樹(shù)皮采自于云南普洱思茅縣，分布于低緯高原南亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，樹(shù)皮均來(lái)自同一棵紅香樹(shù)。在試驗(yàn)中使用的紅香樹(shù)樹(shù)皮均被粉碎，并且過(guò)60目篩子，備用。

95%乙醇（分析純）、DPPH：美國(guó)Sigma 公司；實(shí)驗(yàn)室用水為超純水。

1.2 材料與設(shè)備

SJIA-2012 超聲波細(xì)胞破碎機(jī)：寧波雙嘉儀器有限公司；8453 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：美國(guó)安捷倫公司；FA2004 電子分析天平：上海上平儀器公司；HH-4 水浴鍋：力辰科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紅香木樹(shù)皮提取物最大吸收峰的測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取3.0 g 紅香木樹(shù)皮干粉，按液固比10 ∶1（mL/g）加入乙醇，置于 60 ℃水浴中萃取 2 h，以4 000 r/min 離心10 min，取上清液，備測(cè)。備測(cè)樣品均用對(duì)應(yīng)溶劑稀釋50 倍，再進(jìn)行200 nm～800 nm 的光譜掃描，得到紅香木樹(shù)皮溶液的吸收光譜和最大吸收峰。

1.3.2 不同體積的乙醇的浸泡物對(duì)DPPH 自由基的清除效果

準(zhǔn)確稱(chēng)取3.0g 紅香木樹(shù)皮干粉共6 份，分置于6個(gè)200 mL 燒杯中，以保鮮膜封口，按液固比 10 ∶1（mL/g）分別加入體積分?jǐn)?shù)為0%、10%、30%、50%、70 %和95%的乙醇開(kāi)展試驗(yàn)，均置于50 ℃水浴中浸提2 h，然后取濾液離心。取10 mL 配置好的DPPH（A=0.7±0.1）溶液于比色管中，加入0.5 mL 的濾液，測(cè)定其吸光度，并計(jì)算溶液對(duì)DPPH 自由基的清除率。

1.3.3 不同料液比的紅香木樹(shù)皮溶液對(duì)DPPH 自由基的清除效果

準(zhǔn)確稱(chēng)取3.0g 紅香木樹(shù)皮干粉共6 份，分置于6個(gè)200 mL 燒杯中，以保鮮膜封口，按液固比 5 ∶1、10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1（mL/g）加入乙醇開(kāi)展試驗(yàn)，均置于50 ℃水浴中浸提2 h，然后取濾液離心。取10mL配置好的DPPH 自由基（A=0.7±0.1）溶液于比色管中，加入0.5 mL 的濾液，測(cè)定其吸光度，并計(jì)算溶液對(duì)DPPH 自由基的清除率。

1.3.4 不同超聲功率的紅香木樹(shù)皮溶液對(duì)DPPH 自由基的清除效果

精確稱(chēng)取3.0 g 紅香木樹(shù)皮干粉共6 份，置于6 個(gè)200mL 燒杯中，以保鮮膜封口并置液固比為10∶1（mL/g）、50 ℃水浴中浸提2 h，然后取出各燒杯，設(shè)置超聲時(shí)間為 20 min，分別超聲提取 150、225、300、375、450、525 W，然后取濾液離心。取10 mL 配置好的DPPH 自由基（A=0.7±0.1）溶液于比色管中，加入 0.5 mL 的濾液，測(cè)定其吸光度，并計(jì)算溶液對(duì)DPPH 自由基的清除率。

1.3.5 不同超聲時(shí)間的紅香木樹(shù)皮溶液對(duì)DPPH 自由基的清除效果

準(zhǔn)確稱(chēng)取6 份3 g 紅香木樹(shù)皮干粉，置于200 mL 燒杯中，將瓶口以保鮮膜封口并置液固比為10 ∶1（mL/g）、60 ℃水浴中浸提2 h，然后取出各燒杯，設(shè)置超聲功率為 200 W，分別超聲提取 5、10、20、30、40、50、60 min，然后取濾液離心。取10 mL 配置好的DPPH 自由基（A=0.7±0.1）溶液于比色管中，加入 0.5 mL 的濾液，測(cè)定其吸光度，并計(jì)算溶液對(duì)DPPH 自由基的清除率。

1.3.6 中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)（central composite design，CCD）設(shè)計(jì)及其試驗(yàn)結(jié)果

在探究對(duì)DPPH 自由基清除的過(guò)程中，適當(dāng)超聲的引入有利于提高乙醇對(duì)紅香木樹(shù)皮有效物質(zhì)的浸出，從而使清除率增加，但大功率的超聲的使用則產(chǎn)生反作用，由此可見(jiàn)，超聲功率是構(gòu)建紅香木樹(shù)皮乙醇浸出物對(duì)DPPH 自由基清除的關(guān)鍵性因素，故選取超聲功率作為響應(yīng)面分析的影響因素。此外，在單因素試驗(yàn)中，一定范圍內(nèi)的液固比和超聲時(shí)間對(duì)清除率的影響較為顯著，故將其作為響應(yīng)面分析的影響因素。因此，采用Expert 8.1.6 軟件中的CCD 法對(duì)清除體系中液固比、超聲時(shí)間和超聲功率對(duì)DPPH 自由基清除率的影響進(jìn)行探究。根據(jù)CCD 設(shè)計(jì)原理，液固比、超聲時(shí)間和超聲功率各設(shè)置3 個(gè)水平，因素水平表見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化超聲輔助清除DPPH 自由基試驗(yàn)的因素與水平值Table 1 Response surface optimization of ultrasound-assisted removal of DPPH free radical test factors and levels

1.3.7 紅香木樹(shù)皮泡酒的抗氧化活性分析

準(zhǔn)確稱(chēng)取3 g 紅香木樹(shù)皮干粉，置于200 mL 燒杯中，加入30 mL 的色譜級(jí)乙醇，在60 ℃水浴中浸提2 h，待測(cè)；取 10 mL 配置好的 DPPH 自由基（A=0.7±0.1）溶液于比色管中，加入0.5 mL 的濾液，待測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅香木樹(shù)皮提取物最大吸收峰的測(cè)定

紅香木樹(shù)皮和DPPH 自由基的紫外譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 紅香木樹(shù)皮和DPPH 自由基的紫外譜圖Fig.1 UV spectrum of Anneslea fragrans Wall.bark and DPPH free radical

由圖1 可知，紅香木樹(shù)皮溶液的吸收光譜在400 nm～800 nm 之間并沒(méi)有吸收峰，DPPH 溶液在 328、517 nm 處出現(xiàn)2 個(gè)較強(qiáng)的特征吸收峰，而紅香木樹(shù)皮溶液在218 nm 處出現(xiàn)較強(qiáng)的特征吸收峰。所以本試驗(yàn)選用的紅香木樹(shù)皮溶液的最大吸收波長(zhǎng)為218 nm。

不同提取溫度的紅香木樹(shù)皮溶液對(duì)DPPH 自由基的清除率見(jiàn)圖2。

由圖2 可知，溫度在提取過(guò)程中可以分為2 個(gè)階段，一是加速提??；二是緩慢提取。在45 ℃～50 ℃之間的紅香木樹(shù)皮樹(shù)皮的溶液對(duì)DPPH 自由基清除率的影響隨溫度的升高而升高，但從50 ℃～65 ℃之間的紅香木樹(shù)皮的溶液，隨著溫度的升高清除率緩慢增加，其原因可能是因?yàn)樵谔崛∵^(guò)程中溫度慢慢接近于乙醇的沸點(diǎn)溫度78 ℃[6]，一部分乙醇蒸發(fā)；還可能是從紅香木樹(shù)皮提取出來(lái)的物質(zhì)具有熱敏性，溫度過(guò)高導(dǎo)致一些熱敏性成分損失[7]，所以在提取過(guò)程中所用溫度均為 50 ℃。

圖2 不同提取溫度的紅香木樹(shù)皮溶液對(duì)DPPH 自由基的清除Fig.2 Removal of DPPH free radicals by Anneslea fragrans Wall.bark solution at different extraction temperatures

不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇浸泡液對(duì)DPPH 自由基的清除率見(jiàn)圖3。

圖3 不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇浸泡液對(duì)DPPH 自由基的清除率Fig.3 Removal of DPPH free radicals by different volume fractions of ethanol soaking solution

由圖3 可知，在不同體積的乙醇浸泡液試驗(yàn)中可以看出0%～50%體積分?jǐn)?shù)的乙醇對(duì)DPPH 自由基的清除效果呈明顯上升的趨勢(shì)。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到了50%時(shí)，紅香木樹(shù)皮提取物清除DPPH 自由基的效果達(dá)到了最大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到了95 %時(shí)，對(duì)DPPH 自由基的清除效果并沒(méi)有顯著增加。由此可以認(rèn)為對(duì)于紅香木樹(shù)皮提取溶液的選擇是極為重要的，對(duì)DPPH 自由基有清除效果的物質(zhì)不單單是醇溶，也不都為水溶。很多文獻(xiàn)顯示不同溶劑提取物對(duì)DPPH自由基清除能力有不同的影響[8-9]。從此試驗(yàn)中可以得出市場(chǎng)上的適度白酒可以最大化的將紅香木樹(shù)皮的有效物質(zhì)提取出，而且提取過(guò)程中單純使用水溶液提取的液體容易霉變，不便于保存。

2.2 不同液固比的紅香木樹(shù)皮溶液對(duì)DPPH自由基的清除效果

不同液固比的紅香木樹(shù)皮溶液對(duì)DPPH 自由基的清除率見(jiàn)圖4。

圖4 不同液固比的紅香木樹(shù)皮溶液對(duì)DPPH 自由基的清除Fig.4 Removal of DPPH free radicals by Anneslea fragrans Wall.bark solution with different ratios of material to liquid

由圖 4 可知，在液固比 5 ∶1（mL/g）～15 ∶1（mL/g），清除率隨液固比呈快速上升趨勢(shì)，對(duì)DPPH 自由基的清除率達(dá)到最大值，液固比大于 15 ∶1（mL/g）時(shí)，清除率反而隨液固比的增加而顯著變化，這是由于隨著紅香木樹(shù)皮干粉質(zhì)量增加，溶解也在增加，但是乙醇體積有限，溶解能力有限[10]，無(wú)法將紅香木樹(shù)皮干粉全部溶解，故乙醇溶液已經(jīng)達(dá)到飽和狀態(tài)，所以清除率不再有變化。

2.3 不同超聲功率的紅香木樹(shù)皮溶液對(duì)DPPH的清除效果

不同超聲功率的紅香木樹(shù)皮溶液對(duì)DPPH 的清除率見(jiàn)圖5。

圖5 不同超聲功率的紅香木樹(shù)皮溶液對(duì)DPPH 的清除率Fig.5 Clearance of DPPH by Anneslea fragrans Wall.bark solution with different ultrasonic power

超聲功率為150 W～525 W 時(shí)的清除率呈整體下降趨勢(shì)。相對(duì)于超聲功率為450 W～525 W，150 W～450 W時(shí)的清除率下降較為緩慢。對(duì)這種影響超聲功率的增加，清除率反而有所下降，這可能是由于超聲功率過(guò)高，超聲波對(duì)紅香木樹(shù)皮干粉的組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了破壞作用[11]，體系中有大量的色素分子，這一部分色素在加入DPPH 自由基的過(guò)程中對(duì)吸光度有影響，從而造成清除率降低的現(xiàn)象。

2.4 不同超聲時(shí)間的紅香木樹(shù)皮溶液對(duì)DPPH自由基的清除效果

不同超聲時(shí)間的紅香木樹(shù)皮溶液對(duì)DPPH 自由基的清除率見(jiàn)圖6。

圖6 不同超聲時(shí)間的紅香木樹(shù)皮溶液對(duì)DPPH 自由基的清除率Fig.6 Removal of DPPH free radicals by Anneslea fragrans Wall.bark solution at different ultrasonic times

由圖6 可知，在 10 ∶1（mL/g）的液固比，200 W 超聲功率的條件下，研究不同的超聲時(shí)間下對(duì)DPPH 自由基清除的影響。在20 min～30 min 時(shí)，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，清除率呈直線上升趨勢(shì)；與20 min～30 min 時(shí)相比，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，30 min～70 min 時(shí)提取液的吸光度值較平緩，這可能是由于隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，溶劑體系的滲透壓接近平衡，色素隨著溶劑向細(xì)胞外緩慢擴(kuò)散[12]。

2.5 超聲輔助提取的響應(yīng)面法優(yōu)化

2.5.1 CCD 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

據(jù)CCD 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以液固比、超聲時(shí)間和超聲功率3 個(gè)因素作為自變量A、B、C，紅香木樹(shù)皮乙醇的浸出物對(duì)DPPH 自由基的清除率作為響應(yīng)值R，通過(guò)Expert 8.1.6 分析軟件獲得的試驗(yàn)方案及其采用該方案獲得的試驗(yàn)結(jié)果如表2 所示。

表2 CCD 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 CCD test design and experimental results

續(xù)表2 CCD 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Continue table 2 CCD test design and experimental results

2.5.2 回歸和方差分析

以紅香木樹(shù)皮乙醇浸出物對(duì)DPPH 自由基清除率為響應(yīng)值，在響應(yīng)面分析軟件中對(duì)液固比、超聲時(shí)間和超聲功率進(jìn)行回歸擬合，響應(yīng)值R 清除率與各影響因子間的回歸方程為：

所得模擬方程具有較好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為R2=0.988 4。此外，對(duì)回歸模型進(jìn)行了方差分析，結(jié)果如表3 所示。

表3 清除DPPH 自由基回歸方差分析結(jié)果Table 3 Elimination of DPPH free radical regression analysis of variance results

建立模型的P＜0.000 1，具有極顯著性，失擬項(xiàng)的P＞0.1，無(wú)顯著性，由此可見(jiàn)，所建模型可用于清除DPPH 自由基的響應(yīng)面分析。此外，A、B、C、BC、A2、B2、C2項(xiàng)的P 值均小于0.05，表現(xiàn)出顯著性，這表明固液比、超聲時(shí)間和超聲功率均為清除DPPH 自由基過(guò)程中影響清除率的主要因素，其中，A、C、C2項(xiàng)的 P＜0.001，即液固比和超聲時(shí)間對(duì)DPPH 自由基的清除率的影響高度顯著，而B(niǎo) 的P＜0.05，表明超聲功率對(duì)DPPH 自由基的清除率的影響效果要明顯弱于液固比和超聲時(shí)間。AB、AC、BC 項(xiàng)中，僅有 BC 的 P＜0.01，這表明超聲時(shí)間和超聲功率對(duì)DPPH 自由基的清除率的影響在一定程度上表現(xiàn)出交互作用，而其他因素間則無(wú)此效應(yīng)。

2.5.3 響應(yīng)面分析

各因素及其交互作用對(duì)超聲輔助提取影響的響應(yīng)面見(jiàn)圖7。

圖7 各因素及其交互作用對(duì)超聲輔助提取影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface diagram of the effects of various factors and their interactions on ultrasound-assisted extraction

圖7 顯示了液固比（A）、超聲功率（B）和超聲時(shí)間（C）三因素對(duì)DPPH 自由基清除率的等高線圖a、圖c、圖 e 和 3D 響應(yīng)面圖 b、圖 d、圖 f，3D 響應(yīng)曲面在二維平面上的投影就是等高線圖。由圖7a 可以看出，沿著B(niǎo)因素（超聲功率）向峰值方向移動(dòng)，其等高線的密度明顯低于沿A 因素（液固比）方向，由此可見(jiàn)，相對(duì)于超聲功率，液固比對(duì)DPPH 自由基清除率的影響更為顯著。由對(duì)應(yīng)的3D 響應(yīng)面圖7b 也能獲取相同的結(jié)果，在B因素方向，響應(yīng)面曲線較為平緩，說(shuō)明超聲功率對(duì)DPPH 自由基清除率影響較小，隨超聲功率的增加，清除效果有增加的趨勢(shì)，但增加的程度并不大，影響并不十分顯著，而沿A 因素方向則出現(xiàn)了較為明顯的變化，響應(yīng)面曲線較陡，液固比引起清除率的變化較大，說(shuō)明液固比對(duì)DPPH 自由基清除率的影響大于超聲功率。

圖7c 和圖7d 則顯示了A 因素（液固比）和C 因素（超聲時(shí)間）對(duì)DPPH 自由基清除率的影響。由等高線圖可以看出，沿著C 因素（超聲時(shí)間）向峰值方向移動(dòng)的等高線密度也要相對(duì)低于沿A 因素（液固比）方向。由3D 響應(yīng)面圖則可以看出，在A 因素方向響應(yīng)面曲線有一定的坡度，但是，在C 因素方向，響應(yīng)面曲線較為平緩，說(shuō)明超聲時(shí)間對(duì)DPPH 自由基清除率的影響較小，隨超聲時(shí)間的增加，對(duì)DPPH 自由基清除率有增加的趨勢(shì)，但增加的程度并不大，影響并不十分顯著。由此可見(jiàn)，A 因素變化對(duì)結(jié)果的影響要高于C 因素，即相對(duì)于超聲時(shí)間，液固比的影響更大。

由圖7e 和圖7f 可以比較B 因素（超聲功率）和C因素（超聲時(shí)間）對(duì)DPPH 自由基清除率的影響。由兩因素沿峰值方向的等高線密度及其3D 響應(yīng)面圖中響應(yīng)面曲線的陡峭程度可以看出，B、C 兩因素的影響也存在較大差異，相對(duì)于超聲功率，超聲時(shí)間的影響較弱一些。響應(yīng)面分析直觀反映了各因素的影響情況，其效果優(yōu)于單因素試驗(yàn)，綜合分析可以發(fā)現(xiàn)，3 個(gè)因素對(duì)清除率的影響有所不同，其程度大小為：液固比＞超聲功率＞超聲時(shí)間。

此外，通過(guò)響應(yīng)面分析模型對(duì)DPPH 自由基清除率條件進(jìn)行了優(yōu)化分析，預(yù)測(cè)的最優(yōu)條件是液固比為20 ∶1（mL/g）、超聲時(shí)間為 21.65 min、超聲功率為232.31 W，預(yù)測(cè)的最優(yōu)清除率為95.15%。通過(guò)試驗(yàn)檢驗(yàn)最優(yōu)預(yù)測(cè)條件下的提取效果，清除率與預(yù)測(cè)值相接近，達(dá)到91.6%，相差3.56%。

2.6 紅香木樹(shù)皮泡酒的GC-MS分析

紅香木樹(shù)皮在色譜級(jí)的乙醇中浸泡24 h 的氣相色譜圖見(jiàn)圖8，紅香木樹(shù)皮溶液成分分析見(jiàn)表4。

圖8 紅香木樹(shù)皮氣相色譜圖Fig.8 Gas chromatogram of Anneslea fragrans Wall.tree bark

表4 紅香木樹(shù)皮溶液成分分析Table 4 Composition analysis of Anneslea fragrans wall.bark solution

從圖8 和表4 中可以看出，從浸泡液中分離出了8 種物質(zhì)。

本研究采用氣相色譜儀對(duì)浸泡液清除DPPH 自由基的成分進(jìn)行了分析，并利用氣質(zhì)色譜聯(lián)用儀對(duì)色譜中出現(xiàn)的各峰進(jìn)行解析，加入紅香木樹(shù)皮后溶液氣相色譜見(jiàn)圖9。

圖9 加入紅香木樹(shù)皮后溶液氣相色譜圖Fig.9 Gas chromatogram of the solution after adding Anneslea fragrans Wall.bark

從圖9 可知，從中分離出4 種物質(zhì)。

3 結(jié)論

經(jīng)優(yōu)化后，紅香木樹(shù)皮浸泡酒預(yù)測(cè)的最優(yōu)條件是液固比為 20 ∶1（mL/g）、超聲時(shí)間為 21.65 min、超聲功率為232.31 W，預(yù)測(cè)的最優(yōu)去除率為95.15%。通過(guò)試驗(yàn)檢驗(yàn)最優(yōu)預(yù)測(cè)條件下的提取效果，清除率與預(yù)測(cè)值相接近，達(dá)到91.6%，相差3.56%。

紅香木樹(shù)皮浸泡酒因紅香木樹(shù)皮的特有成分，營(yíng)養(yǎng)豐富，感官指標(biāo)良好，風(fēng)格獨(dú)特，具有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用的價(jià)值。