補(bǔ)坎益離丹慢性毒性初步研究

霍艷穎，王夢(mèng)婕，李 佳，姜代勛*，霍桂桃

(1. 北京農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2. 中國(guó)食品藥品檢定研究院國(guó)家藥物安全評(píng)價(jià)監(jiān)測(cè)中心，北京 100176)

隨著中國(guó)家庭寵物飼養(yǎng)條件的改善和獸醫(yī)診療水平的提高，犬等動(dòng)物的壽命得到很大提高。伴隨著犬老齡化的到來，犬心臟病的發(fā)病率大幅度升高，病犬主要表現(xiàn)出精神沉郁、食欲不振、咳嗽、呼吸困難、運(yùn)動(dòng)耐力降低、牙齦蒼白等癥狀。目前寵物診療機(jī)構(gòu)主要應(yīng)用多種西藥以減輕心臟負(fù)荷、增強(qiáng)心肌收縮力來緩解癥狀，寵物臨床上可供使用、有效治療犬心臟病的中藥方劑少之又少。

補(bǔ)坎益離丹是清末名醫(yī)鄭欽安為治療心病不安所設(shè)，主要用于心陽(yáng)不足等心病的治療，至今對(duì)人心臟病仍有良好的治療作用[1-3]。中國(guó)歷來存在醫(yī)方人畜通用，醫(yī)理人畜互參的比較醫(yī)學(xué)體系。將補(bǔ)坎益離丹用于犬等動(dòng)物心陽(yáng)虛證的治療和研究將擴(kuò)大該經(jīng)典方劑的應(yīng)用范圍。因該方劑中含有附子和桂心，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為二者均具有一定的毒性。本研究以小鼠為模型，研究補(bǔ)坎益離丹對(duì)其血常規(guī)、血生化指標(biāo)及五臟組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響，以確保補(bǔ)坎益離丹在犬等動(dòng)物心陽(yáng)虛證應(yīng)用上的安全性，具有重要的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)動(dòng)物(昆明小鼠60只，雌雄各半，24～26 g)及飼料均由斯貝福生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)分別為：SCXK(京)2016-0002、SCXK(京)2015-0015。試驗(yàn)在清潔級(jí)環(huán)境中進(jìn)行，室溫27 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，自然光線。飲用水為經(jīng)高壓滅菌的自來水。小鼠采食、飲水不限。

1.2 主要試劑

附子、桂心、炙甘草、蛤粉購(gòu)于北京同仁堂藥店大柵欄總店，生姜購(gòu)于北京農(nóng)學(xué)院家屬院便民商店，生化17項(xiàng)測(cè)試盒、血常規(guī)試劑盒購(gòu)于愛德士生物科技公司，蘇木素伊紅染色試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司，其他試劑等購(gòu)于北京化學(xué)試劑公司。

1.3 補(bǔ)坎益離丹的制備

補(bǔ)坎益離丹為清末名醫(yī)鄭欽安所創(chuàng)，包括附子八錢，桂心八錢，蛤粉五錢，炙甘草四錢，生姜5片。清朝一錢相當(dāng)于現(xiàn)在的3.72 g，該方可換算成：附子30 g，桂心30 g，蛤粉19 g，炙甘草15 g，生姜5片(約60 g)。所有藥材在煎煮前浸泡30 min，將浸泡后的附子(制)放入砂鍋加入適量的蒸餾水，煎煮1 h。隨后加入桂心、蛤粉、炙甘草、生姜。先武火煮沸后，再文火煎1 h，倒出煎液。加入適量熱水進(jìn)行二煎，文火再煎1 h，倒出煎液。合并2次煎液，濃縮至所需濃度。

1.4 慢性毒性試驗(yàn)

昆明小鼠60只，雌雄各半，隨機(jī)平均分為空白組、低劑量組和高劑量組。適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后，空白組每日灌胃生理鹽水0.5 ml、低劑量組每日灌胃0.1 g/mL補(bǔ)坎益離丹0.5 mL、高劑量組每日灌胃0.5 g/mL補(bǔ)坎益離丹0.5 mL，連續(xù)60 d。以50 kg成人體重為標(biāo)準(zhǔn)，補(bǔ)坎益離丹低劑量組相當(dāng)于人常規(guī)用藥量，高劑量組相當(dāng)于人常規(guī)用藥量的5倍。隨后各組小鼠摘眼球取血，IDEXX ProCyte Dx Hematology Analyzer檢測(cè)血常規(guī)指標(biāo)，IDEXX Catalyst One Analyzer檢測(cè)血生化指標(biāo)。取血后將小鼠脫椎處死，摘取肝臟、心臟、脾臟、肺臟、腎臟于4%多聚甲醛固定，常規(guī)方法制作組織切片。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)以平均值±偏差表示，采用t-檢驗(yàn)分析空白組與低劑量組、高劑量組差異顯著性。低劑量組、高劑量組與空白組比較，*表示差異顯著(P<0.05)。

2 結(jié) 果

2.1 臨床觀察

各組小鼠用藥期間被毛整潔，皮膚顏色正常，進(jìn)食、飲水及生長(zhǎng)狀況良好，對(duì)外界反應(yīng)靈敏，未見異常分泌物等。試驗(yàn)過程中，死亡7只小鼠。其中，空白組分別在第35天、第42天各死亡1只，低劑量組分別在第25天、第49天各死亡1只，高劑量組分別在第11天、第37天、第53天各死亡1只。

2.2 血常規(guī)指標(biāo)結(jié)果

低劑量組、高劑量組與空白組比較，血常規(guī)主要指標(biāo)如紅細(xì)胞數(shù)量、紅細(xì)胞比容、白細(xì)胞數(shù)量、中性粒細(xì)胞數(shù)量、淋巴細(xì)胞數(shù)量、單核細(xì)胞數(shù)量、血小板數(shù)量及血小板壓積等均未見明顯變化，差異不顯著(P>0.05)。低劑量組與空白組比較，平均紅細(xì)胞體積、網(wǎng)織紅細(xì)胞百分比、網(wǎng)織紅細(xì)胞顯著降低(P<0.05)，而嗜酸性粒細(xì)胞百分比顯著升高(P<0.05)。高劑量組與空白組比較，平均紅細(xì)胞體積、網(wǎng)織紅細(xì)胞百分比、平均血小板體積、血小板分布寬度顯著降低(P<0.05)，見表1。

表1 小鼠血常規(guī)指標(biāo)Tab.1 Results of blood routine indexes in mice

2.3 生化指標(biāo)結(jié)果

低劑量組、高劑量組與空白組比較，除低劑量組小鼠的尿素顯著高于空白組，存在顯著差異(P<0.05)外，其他生化指標(biāo)均無(wú)顯著變化(P>0.05)，見表2。

表2 小鼠血生化指標(biāo)Tab.2 Result of blood biochemical indexes in mice

2.4 組織切片

低劑量組、高劑量組與空白組比較，心臟心肌細(xì)胞均排列整齊、細(xì)胞核清晰完整、心肌纖維完整無(wú)斷裂；脾臟紅髓、白髓結(jié)構(gòu)完整，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；肺臟肺泡囊、肺泡管均結(jié)構(gòu)完整，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；腎臟腎小體、腎小管結(jié)構(gòu)均完整，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；肝臟肝細(xì)胞排列整齊、細(xì)胞核清晰完整，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，見圖1。

3 討 論

血常規(guī)是臨床最普遍的檢查方法之一[4-6]，是指通過觀察血細(xì)胞的數(shù)量變化、形態(tài)分布以判斷血液狀況、輔助疾病診斷。血常規(guī)中的具體指標(biāo)可敏感反映機(jī)體多種病理變化，其中以白細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白和血小板比較具有診斷價(jià)值。另外，血常規(guī)還是觀察藥物療效、副作用等常用參考指標(biāo)。由于小鼠血液量少、易凝固，在檢測(cè)時(shí)一些樣品出現(xiàn)不同程度凝固，導(dǎo)致可統(tǒng)計(jì)的樣本量較少，但仍有一定的參考價(jià)值。低劑量、高劑量連續(xù)給予小鼠60 d后，血常規(guī)主要指標(biāo)如白細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白及血小板等均沒有發(fā)生明顯改變，提示補(bǔ)坎益離丹長(zhǎng)期應(yīng)用對(duì)主要血細(xì)胞沒有不良影響。低劑量組、高劑量組平均紅細(xì)胞體積雖顯著降低，但與空白組比較下降幅度約為1/10，可忽略其影響；網(wǎng)織紅細(xì)胞是尚未完全成熟的紅細(xì)胞，在周圍血液中的數(shù)值可反映骨髓紅細(xì)胞的生成功能，低劑量組、高劑量組網(wǎng)織紅細(xì)胞百分比、網(wǎng)織紅細(xì)胞均明顯降低，雖提示紅細(xì)胞的生成減少，但紅細(xì)胞數(shù)跟空白組比較沒有發(fā)生顯著變化；低劑量組嗜酸性粒細(xì)胞百分比雖顯著升高，而嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)則沒有升高的變化。高劑量組平均血小板體積明顯下降提示血小板生成不良，血小板分布寬度降低表明血小板的均一性高，而高劑量組血小板數(shù)跟空白組比較沒有異常變化。因未見公認(rèn)的小鼠血常規(guī)指標(biāo)參考值范圍，若參考犬的血常規(guī)相關(guān)指標(biāo)正常變動(dòng)區(qū)間范圍，則以上小鼠異常變化的血常規(guī)指標(biāo)均應(yīng)在正常范圍內(nèi)。

血生化檢測(cè)是為臨床提供診斷、評(píng)價(jià)藥物作用的重要方法[7-9]，包括檢測(cè)血液中的糖類、酶類、離子、蛋白、脂類、代謝產(chǎn)物以及激素等。低劑量組、高劑量組用藥后，除低劑量組的尿素水平顯著升高外，主要生化指標(biāo)均無(wú)顯著差異。血中尿素主要經(jīng)腎小球?yàn)V過，通過尿液排出體外，當(dāng)腎小球受損時(shí)濾過率降低，血中尿素升高。尿素是反映腎小球?yàn)V過功能的重要指標(biāo)。低劑量組的尿素含量?jī)H高于對(duì)照組約1/5，臨床意義不大。提示補(bǔ)坎益離丹長(zhǎng)期應(yīng)用對(duì)主要血生化指標(biāo)沒有明顯不良影響。

石蠟切片不僅用于觀察正常組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，也是病理學(xué)、藥理學(xué)等研究疾病或藥物影響組織細(xì)胞形態(tài)變化的重要方法[10-12]。組織器官經(jīng)過固定、石蠟包埋、切片及染色等步驟能清晰辨認(rèn)其細(xì)胞結(jié)構(gòu)。與空白組比較，低劑量組、高劑量組肝臟、心臟、脾臟、肺臟、腎臟均無(wú)明顯變化。提示補(bǔ)坎益離丹長(zhǎng)期應(yīng)用對(duì)肝臟、心臟、脾臟、肺臟、腎臟組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)沒有不良影響。

空白組死亡2只小鼠，低劑量組死亡2只小鼠，高劑量組死亡3只小鼠。小鼠死亡后經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)肺臟均出現(xiàn)不同程度的充血或?qū)嵶?，而其他臟器無(wú)肉眼可見的變化。小鼠死亡原因可能與長(zhǎng)期灌胃造成氣管、肺部的損傷或操作失誤導(dǎo)致死亡有關(guān)。

低劑量、高劑量在長(zhǎng)期給藥的情況下，對(duì)小鼠臨床表現(xiàn)、血常規(guī)主要指標(biāo)、血生化指標(biāo)及五臟組織結(jié)構(gòu)均沒有不良影響，表明含有附子、桂心的補(bǔ)坎益離丹安全性良好，可為犬等寵物臨床用藥研究提供參考。