不同產(chǎn)地板藍根藥材中(R,S)-告依春含量測定與分析

孟文文，鐘昆芮，周艷飛，王亞芳*，董 虹*

(1.北京農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室，北京 102206；2.北京市獸藥監(jiān)察所，北京 102629)

板藍根(Isatidis Radix)為十字花科(Cruciferrae)植物菘藍(IsatisindigoticaFort.)的干燥根，為中國傳統(tǒng)中藥，具有清熱解毒、涼血和抗病毒的功效，臨床常用于發(fā)熱發(fā)斑、風(fēng)熱感冒、咽喉腫爛、腮腺炎等[1-2]。研究表明，板藍根具有抗菌、抗病毒以及抗內(nèi)毒素的功效，能增強動物機體的抵抗力，現(xiàn)已廣泛用于抗病毒、抗感染類獸藥的生產(chǎn)與合成[3]。由于其抗病毒療效顯著，且適應(yīng)性強，中國南北地區(qū)都有種植[4]。不同地區(qū)生產(chǎn)的板藍根有效成分含量差異較大，藥材質(zhì)量參差不齊。(R,S)-告依春(又名表告依春)是板藍根的主要抗病毒成分[5]，板藍根藥材中(R,S)-告依春含量的高低，能較好反應(yīng)藥材質(zhì)量情況。本試驗通過測定不同產(chǎn)地(R,S)-告依春的含量，并調(diào)查不同產(chǎn)地的緯度、溫度、降水、日照時間等自然條件，以闡明產(chǎn)地因素對其有效成分含量的影響，為合理選擇板藍根種植區(qū)域提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器及藥品

高效液相色譜儀(Waters公司，型號e 2695)；檢測器(Waters公司，型號2998 PDA)；HC-C18(2)色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm，Agilent公司)；分析天平(Mettler Toledo公司，型號XP 205)；離心機(賽默飛世爾公司，型號Heraeus Pico 17)；超純水儀(默克密理博Elix公司)。

(R,S)-告依春對照品(中國食品藥品檢定研究院，編號111753-201706，含量100%)；甲醇(色譜級，賽默飛世爾公司)；超純水；磷酸(色譜級，賽默飛世爾公司)。10批次的板藍根藥材來源見表1。不同產(chǎn)地的主要生態(tài)因子見表2，數(shù)據(jù)來源于人地系統(tǒng)主題數(shù)據(jù)庫。

表1 板藍根藥材產(chǎn)地及來源Tab.1 Origin and source of Isatidis Radix

表2 各產(chǎn)地主要生態(tài)因子Tab.2 Main ecological factors of each producing area

注：本數(shù)據(jù)來源于人地系統(tǒng)主題數(shù)據(jù)庫。

Note: This data comes from the human system topic database.

1.2 試驗方法

色譜條件：色譜柱為Agilent HC-C18(2)色譜柱；流動相為甲醇-0.02%磷酸溶液(7∶93)，流速為1.0 mL/min；檢測波長為245 nm；進樣量為10 μL。

對照品溶液制備：取(R,S)-告依春對照品10 mg，精密稱定至250 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成每1 mL含對照品40 μg的對照品溶液，搖勻，即得。

供試品制備：取板藍根藥材，制成粉末(過0.3 mm篩)，精密稱定約1 g置具塞錐形瓶中，精密加入50 mL超純水，稱定重量，煎煮2 h，放至室溫，再稱定重量，用超純水補足減失的重量，搖勻，靜置5 min，吸取上清液，13 000 r/min離心6 min，取上清液，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

1.3 方法學(xué)研究

線性關(guān)系考察：取(R,S)-告依春對照品適量，精密稱定置容量瓶中，加甲醇分別制成每1 mL含5、10、20、40、80 μg的溶液。在1.2色譜條件下，分別精密吸取10 μL對照品溶液注入液相色譜儀，測定峰面積；并以濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

精密度試驗：精密吸取40 μg/mL的對照品溶液10 μL注入液相色譜儀，在1.2色譜條件下連續(xù)進樣6次。測定(R,S)-告依春峰面積并計算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

穩(wěn)定性試驗：取同一份供試品溶液，在1.2色譜條件下，在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h分別進樣，測定(R,S)-告依春峰面積并計算RSD值。

重復(fù)性試驗：取同一批板藍根藥材，連續(xù)制備6份供試品溶液，在1.2色譜條件下，測定(R,S)-告依春平均含量并計算其RSD值。

回收率試驗：采用加樣回收法，取同一批次板藍根藥材，其含量為0.366 mg/g，精密稱定5份，分別精密加入(R,S)-告依春對照品適量，在1.2色譜條件下進行測定，計算其平均回收率及RSD值。

1.4 樣品含量測定

按1.2的供試品制備方法分別對5個不同產(chǎn)地共10批板藍根藥材進行處理，制成供試品溶液，并按1.2色譜條件對(R,S)-告依春進行含量測定，每批樣品平行測定2份，以外標(biāo)法計算(R,S)-告依春含量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用GraphPad Prism 5軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析與多組間比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)研究

線性關(guān)系考察結(jié)果顯示，其回歸方程為Y=65 327X-439.25，R2=1.0000，表明(R,S)-告依春在5～80 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

精密度試驗結(jié)果顯示，其對照品峰面積的RSD為0.24%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗結(jié)果顯示，(R,S)-告依春含量在0～24 h內(nèi)RSD為1.88%，表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗結(jié)果顯示，(R,S)-告依春含量平均值為0.21 mg/g，RSD為2.48%，表明本試驗重復(fù)性良好。

回收率試驗結(jié)果顯示，其平均回收率為100.82%，RSD為2.54%，表明此檢測方法準(zhǔn)確度良好。具體數(shù)據(jù)見表3。

表3 (R,S)-告依春加樣回收率Tab.3 (R, S)-goitrin sample recovery rate

2.2 (R,S)-告依春含量與分析

對照品與供試品色譜圖見圖1。如圖2所示，5個產(chǎn)地的板藍根藥材中(R,S)-告依春含量范圍在0.197～0.590 mg/g之間，其中河北和山東地區(qū)含量較高，分別為0.590 mg/g和0.481 mg/g，其次為甘肅、東北和安徽地區(qū)，分別為0.375 mg/g、0.263 mg/g和0.197 mg/g，安徽所產(chǎn)的含量最低。其中河北和山東地區(qū)與甘肅、東北以及安徽地區(qū)的(R,S)-告依春含量均存在極顯著差異(P<0.001)。不同產(chǎn)地所產(chǎn)的板藍根有效成分差異顯著，說明產(chǎn)地因素會對藥材的質(zhì)量品質(zhì)產(chǎn)生影響。

2.3 不同產(chǎn)地板藍根藥材HPLC圖譜分析

由圖3可以看出，不同產(chǎn)地板藍根藥材HPLC圖譜有很大差異，這種差異不僅表現(xiàn)在各有效成分的含量差異，還表現(xiàn)在有效成分的種類差異。如13～15 min保留時間內(nèi)，河北與山東產(chǎn)地均含有3個物質(zhì)峰，而甘肅、東北以及安徽產(chǎn)地僅有1個或2個物質(zhì)峰。說明生長在不同地區(qū)的板藍根藥材，其有效成分的累積確實會受到產(chǎn)地因素影響。

3 討 論

本試驗考察各產(chǎn)地生態(tài)因子對板藍根有效成分含量的影響，所選取的生態(tài)因子均為影響其有效成分含量的主要生態(tài)因子。板藍根適應(yīng)性較強，對氣候的要求并不嚴(yán)格，其習(xí)性喜濕暖，能耐寒、忌高溫、怕水澇，中國南北地區(qū)均可種植[6]。比較各地的生態(tài)因子，其中河北和山東地區(qū)年平均氣溫分別為10.2 ℃和12.1 ℃，年降水量分別為681.3 mm和654.4 mm，其氣候溫暖，降水量豐富的特點與板藍根的生長習(xí)性較為符合，且其有效成分含量也較高，是較為適宜的種植區(qū)域；甘肅地區(qū)雖溫度較為適宜，但可能因降水量較低(年降水量為326.5 mm)，氣候較為干燥，不利于土壤水分積累以及植物的生長，因此其有效成分含量較河北地區(qū)低，是適宜的種植區(qū)域；東北地區(qū)近年來產(chǎn)量較大，成為板藍根的主產(chǎn)區(qū)，但因其氣候較為寒冷，年平均氣溫僅為4.0 ℃，與板藍根喜溫暖的習(xí)性較不相符，其有效成分含量較低，適宜性較差；安徽地區(qū)的年平均溫度和年降水量分別為14.8 ℃和960.4 mm，是5個產(chǎn)地中最高，與板藍根忌高溫，怕水澇的習(xí)性較為不符，其有效成分含量較低，適應(yīng)性較差。

圖1 對照品(A)與供試品(B)色譜圖Fig.1 Chromatogram of reference substance (A) and test sample (B)

注：ns表示無顯著差異(P>0.5)，*表示差異顯著(P<0.05)，***表示差異極顯著(P<0.001)。Note: ns indicates no significant difference (P>0.5), * indicates significant difference (P<0.05), *** indicates that the difference is extremely significant (P<0.001).圖2 各產(chǎn)地板藍根的(R,S)-告依春含量差異Fig.2 Differences in (R,S)-goitrin content of Isatidis Radix from each producing area

板藍根成分復(fù)雜，且含有多種有效成分。板藍根中的總生物堿具有抗炎、抗病毒、解熱的作用[7]，其中(R,S)-告依春為板藍根的主要抗病毒成分[5,8-9]，因此本試驗以(R,S)-告依春的含量作為評價指標(biāo)，能較好反映板藍根藥材質(zhì)量的高低。

目前，板藍根尚無一致的公認道地藥材，對其道地產(chǎn)區(qū)一直存在爭議，有文獻記載河北省為道地產(chǎn)區(qū)，但具體地區(qū)并不明確[7]。除河北、河南、安徽、陜西等幾個形成較早的老產(chǎn)區(qū)以外，黑龍江、內(nèi)蒙古、甘肅等地有較大面積種植[10]。不同區(qū)域生產(chǎn)的板藍根藥材的有效成分含量差異很大，并會直接影響其質(zhì)量品質(zhì)以及臨床藥效。施峰等[2]比較不同產(chǎn)地的板藍根中水楊酸含量的差異，不同產(chǎn)地的板藍根藥材中水楊酸含量差別較大，安徽亳州產(chǎn)的比安徽阜陽產(chǎn)的高4倍多；吳國學(xué)[7]比較不同產(chǎn)地板藍根中有效成分表告依春的含量差異，河北省板藍根內(nèi)表告依春含量最高，其次為安徽阜陽和黑龍江大慶，其余產(chǎn)地含量較低；胡曉燕等[10]比較20批不同產(chǎn)地的板藍根藥材中的表告依春含量，安徽、內(nèi)蒙古以及黑龍江產(chǎn)區(qū)的含量較高，明顯高于其他產(chǎn)區(qū)，河南以及甘肅產(chǎn)區(qū)的含量較低，均小于0.02%，且不符合《中國藥典》的要求。產(chǎn)地因素確實能影響中藥材的有效成分含量，并導(dǎo)致質(zhì)量的差異。確立道地產(chǎn)區(qū)對于保障中藥材的質(zhì)量品質(zhì)以及藥效具有重要意義。本試驗與吳國學(xué)[7]以及胡曉燕等[10]的結(jié)論不一致可能是所采集樣本的批次不同所致，且板藍根在全國范圍內(nèi)分布廣泛，本研究僅對幾個大產(chǎn)區(qū)的部分樣品進行考察，要想進一步確立板藍根的道地產(chǎn)區(qū)，應(yīng)在更大范圍內(nèi)進行采集。本試驗采用高效液相色譜法測定板藍根中有效物質(zhì)的含量，精密度高，重復(fù)性以及穩(wěn)定性良好，可以用于(R,S)-告依春的含量測定，并為評價藥材質(zhì)量的高低提供參考。

注：A.河北；B:山東；C:甘肅；D:東北；E:安徽圖3 不同產(chǎn)地板藍根HPLC色譜圖Fig.3 Isatidis Radix HPLC chromatogram from different origins

通過比較不同產(chǎn)地的生態(tài)因子，分析其對有效成分含量的影響，不同產(chǎn)地板藍根質(zhì)量差異較大，其生長、代謝以及有效物質(zhì)的積累很大程度上受到產(chǎn)地溫濕度、光照、土壤養(yǎng)分、水分等因素的影響[4]，從而導(dǎo)致不同產(chǎn)地板藍根的有效成分含量差異明顯。王玲娜等[11]比較分析產(chǎn)地生態(tài)因子對金銀花活性的影響，海拔高度是影響綠原酸與木犀草苷的主導(dǎo)生態(tài)因子，隨著海拔的升高，綠原酸與木犀草苷呈增加趨勢。趙文龍等[6]采用最大熵模型計算各生態(tài)因子對板藍根適應(yīng)性的貢獻率，最干季節(jié)降水、年平均氣溫、最濕季節(jié)均溫是貢獻率較高的3個生態(tài)因子。其結(jié)論與本文結(jié)論較為一致，可見產(chǎn)地的氣溫和降水因素是影響板藍根生長和分布的主要生態(tài)因子?？茖W(xué)分析中藥材的適生區(qū)域，并充分了解相關(guān)生態(tài)因子對其品質(zhì)的影響規(guī)律，對保證藥材質(zhì)量品質(zhì)以及藥效具有重要意義。

不同產(chǎn)地的板藍根中(R,S)-告依春含量差異較大，其中河北和山東產(chǎn)地含量較高，是板藍根較為適宜的種植地區(qū)。比較各生態(tài)因子，其中氣溫和降水是影響其含量的主要生態(tài)因子。