ERK1/2通路在低氧上調(diào)大鼠PASMCs鈣激活性氯離子通道表達的作用*

趙美平, 馬迎春, 張聰聰, 黃林靜, 鄭夢曉, 黎關(guān)龍, 應(yīng) 磊,2, 王萬鐵,2△

(1. 溫州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室， 2. 溫州醫(yī)科大學(xué)缺血-再灌注損傷研究所， 浙江 溫州 325035； 3. 蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院病理科， 甘肅 蘭州 7300504； 4. 浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)研究所毒理學(xué)研究室， 杭州 310013)

ERK1/2通路在低氧上調(diào)大鼠PASMCs鈣激活性氯離子通道表達的作用*

趙美平1, 馬迎春3+, 張聰聰1, 黃林靜1, 鄭夢曉1, 黎關(guān)龍4, 應(yīng) 磊1,2, 王萬鐵1,2△

(1. 溫州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室， 2. 溫州醫(yī)科大學(xué)缺血-再灌注損傷研究所， 浙江 溫州 325035； 3. 蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院病理科， 甘肅 蘭州 7300504； 4. 浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)研究所毒理學(xué)研究室， 杭州 310013)

目的：探討鈣激活性氯離子通道(CLCA2)在大鼠低氧性肺動脈平滑肌細胞(PASMCs)中mRNA和蛋白表達的變化及其與ERK1/2信號通路的關(guān)系。方法：PASMCs隨機分為：常氧組(N組)，低氧組(H組)，DMSO對照組(D組)， U0126干預(yù)組(U組)，Staurosporine aglycone干預(yù)組(SA組)，采用免疫印跡法檢測CLCA2蛋白的表達；選用半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)測定CLCA2 mRNA水平的表達。結(jié)果：PASMCs中CLCA2 mRNA和蛋白的表達量,H組較N組明顯上調(diào)(P<0.01)；U組較D組明顯上調(diào)(P<0.01)；SA組較D組mRNA的表達顯著下調(diào)(P<0.01)，蛋白的表達輕微下調(diào)。結(jié)論：低氧可上調(diào)CLCA2中 mRNA和蛋白在PASMCs的表達；ERK1/2通路激活劑-Staurosporine aglycone能下調(diào)CLCA2在PASMCs中 mRNA和蛋白的表達量；ERK1/2通路抑制劑-U0126可上調(diào)CLCA2在PASMCs中 mRNA和蛋白的表達量。

鈣激活性氯離子通道；低氧； PASMCs；ERK1/2；大鼠

【DOI】 10.12047/j.cjap.5436.2017.011

研究表明[1]，存在于肺動脈內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞上的氯離子通道，大多是鈣激活性氯離子通道(calcium activated chloride channel, CLCA2)和容量激活性氯離子通道(volume activated chloride channel，C1swell)。慢性低氧會誘導(dǎo)大鼠肺動脈平滑肌細胞上的鈣激活性氯離子通道，增強血管持續(xù)收縮，產(chǎn)生細胞增殖、血管重建進而導(dǎo)致肺動脈高壓的形成。而細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase1/2, ERK1/2)表達的變化主要見于肺小動脈平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞[2]。以往研究發(fā)現(xiàn)[3]，低氧能激活肺動脈平滑肌上的氯離子通道和ERK。那么鈣激活性氯離子通道與ERK1/2之間是否存在一定聯(lián)系呢? ERK1/2是否為鈣激活性氯離子通道的上下游信號通路呢?為了闡明這一問題，本實驗利用培養(yǎng)細胞法觀察了CLCA2在大鼠低氧性肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)中mRNA和蛋白表達的變化，初步探討了CLCA2與 ERK1/2信號通路之間的關(guān)系,為臨床低氧性肺動脈高壓發(fā)病機制的研究及其防治提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級標準健康雄性SD大鼠14只, 體重(body weight, BW) 200±50 g, 由溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供[SCXK(浙)2010-0101號]

1.2 試劑及儀器

U0126(美國, Sigma公司); Staurosporine aglycone(美國,Sigma公司); 二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO，上海申工生物技術(shù)有限公司); α-SM actin鼠單克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗(英國,abcam公司);胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、胰酶/EDTA(美國,Gibco公司);CLCA2兔抗人多克隆抗體(美國,Sigma公司);HRP標記β-actin(上海,康城公司);50 bp DNA Marker、RT-PCR試劑盒(Fermentas life sciences公司);RT-PCR引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司);PVDF膜(美國,Milipore公司);彩色預(yù)染蛋白maker(MBI，F(xiàn)ermentas公司);BCA蛋白定量試劑盒、增強化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國,Pierce公司)。

生物倒置相差顯微鏡XDS-1B(重慶光學(xué)儀器設(shè)備廠);低氧培養(yǎng)箱(Herareus, 美國);顯微外科用顯微鏡(Olympus, 日本); 恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Forma,美國); 722N分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司); EXL-808酶標儀(USA); 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(DYY-3型，北京六一儀器廠); 蛋白電泳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(Bio-Rad公司);凝膠定量軟件Quantity One(Bio-Rad公司);PCR儀(Thermo Hybaid, 美國)。

1.3 方法

1.3.1 PASMCs的培養(yǎng) 具體操作步驟詳見參考文獻[4]。

1.3.2 PASMCs的鑒定 普通光學(xué)顯微鏡下細胞形態(tài)鑒定：倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并攝片；免疫熒光染色法鑒定：先將細胞以合適密度接種于蓋玻片上，放入常氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 1～2 d，用PBS清洗細胞爬片，4%的多聚甲醛固定細胞10～15 min，PBS漂洗3次，用3% H2O2去離子水封閉后結(jié)合血管平滑肌α-SM actin單抗(用PBS稀釋1∶100)，4℃過夜后避光加入FITC標記的濃度為1∶100的山羊抗小鼠IgG二抗，室溫避光孵育20～30 min。PBS漂洗后滴加細胞核染色液DAPI(1∶1 000稀釋)，室溫避光孵育3～5 min，PBS洗3次，免疫熒光顯微鏡下對同一視野以不同激發(fā)波長(FITC：激發(fā)光波長488 nm，發(fā)射光峰值525 nm；DAPI：358 nm的激發(fā)光波長，461 nm的發(fā)射光峰值)觀察并拍照。

1.3.3 實驗分組 實驗前將SD大鼠4～6代肺動脈平滑肌細胞置于無血清的DMEM培養(yǎng)液中24 h，分為5組，每組6皿細胞；分別為：(1)常氧組(N): 21% O2, 5% CO2，37℃,DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h; (2)低氧組(H): 2% O2, 5% CO2, 37℃, DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h; (3) DMSO對照組(D): 2% O2, 5% CO2, 37℃,0.05% DMSO培養(yǎng) 48 h; (4) U0126干預(yù)組(U): 2% O2, 5% CO2, 37℃, 10 μmol/L U0126,DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng), 48 h; (5)Staurosporine aglycone干預(yù)組(SA):2% O2, 5% CO2, 37 ℃, 30 μmol/L Staurosporine aglycone,DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。

1.3.4 蛋白免疫印跡法及RT-PCR法檢測PASMCs CLCA2的蛋白及mRNA含量 具體操作步驟詳見參考文獻[4]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 原代培養(yǎng)大鼠PASMCs的培養(yǎng)和鑒定

2.1.1 細胞形態(tài)學(xué)生長特點 選取預(yù)先準備好的SPF級SD雄性大鼠，從其身上分離出原代肺動脈平滑肌細胞[5]，離體培養(yǎng)后的2～3 d開始增殖，6～7 d開始融合呈典型的“峰谷”狀生長，肺動脈平滑肌細胞為貼壁細胞，呈長梭形，鏡下觀察可見其折光性較好，細胞核可為多個(圖1)。

2.1.2 免疫細胞熒光法鑒定PASMCs 染色后在免疫熒光顯微鏡下觀察，約99%呈陽性反應(yīng)，胞漿內(nèi)細絲狀發(fā)綠色熒光且與PASMCs長軸平行的為FITC標記的平滑肌α-actin，實為平滑肌α-肌動蛋白，僅平滑肌細胞呈陽性反應(yīng)；經(jīng)DAPI染色細胞核呈藍色熒光(圖2)。

Fig. 1 Rat PASMCs by primary culturing(×100)

Fig. 2 Immunobiochemical identification of rat PASMCs(×400)

2.2 各組PASMCs上CLCA2 mRNA表達的變化

2.2.1 低氧對PASMCs上CLCA2 mRNA表達的影響 與N組(0.841±0.039)相比 ，H組(1.116±0.013)CLCA2 mRNA表達量顯著增加，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖3、圖4)。

Fig. 3 Expression of CLCA2 mRNA in all groups

2.2.2 低氧條件下U0126對PASMCs上CLCA2 mRNA表達的影響 與N組(0.841±0.039)比較, D組(1.121±0.038)、U組(1.812±0.013)、SA組(1.051±0.041)CLCA2 mRNA表達均明顯上調(diào)(P<0.01)；與H組(1.116±0.013)比較，D組(1.121±0.038)CLCA2 mRNA表達無明顯差異)；與D組(1.121±0.038)比較，U組(1.812±0.013)CLCA2 mRNA表達顯著上調(diào)(P<0.01)，SA組(1.051±0.041)CLCA2 mRNA表達顯著下調(diào)(P<0.01，圖3、圖4)。

2.3 各組PASMCs上CLCA2蛋白表達的變化

2.3.1 低氧對CLCA2蛋白表達的影響 與N組(0.424±0.010)相比，H組(0.530±0.017)CLCA2蛋白的表達明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖5、圖6)。

2.3.2 低氧條件下U0126對PASMCs上CLCA2蛋白表達的影響 與N組(0.424±0.010)比較，D組(0.533±0.007)、U組(0.568±0.007)、SA組(0.505±0.026)CLCA2蛋白的表達均明顯上調(diào)(P<0.01)；與H組(0.530±0.017)比較，D組(0.533±0.007)CLCA2蛋白的表達無顯著差異；與D組(0.533±0.007)比較，U組(0.568±0.007)CLCA2蛋白的表達顯著上調(diào)(P<0.01),SA組(0.505±0.026)CLCA2蛋白的表達下調(diào)，但無統(tǒng)計學(xué)差異 (圖5、圖6)。

Fig. 5 Expression of CLCA2 protein in all groups

3 討論

研究表明[6,7]，鈣激活性氯離子通道在肺動脈平滑肌細胞的興奮機制中起到重要作用，慢性低氧會誘導(dǎo)肺動脈平滑肌細胞上的鈣激活性氯離子通道上調(diào)，導(dǎo)致血管反應(yīng)增強，收縮增加，在調(diào)控血管張力和收縮性方面起重要作用。細胞膜氯離子的靜息通透性相對較大，血管平滑肌細胞靜息膜電位約-55 mv，氯離子平衡電位約-34 mv，故激活CLCA2可引起肺動脈血管強烈收縮等去極化效應(yīng)[8]。有研究發(fā)現(xiàn)[9]，在生理狀態(tài)下，CLCA2參與了苯腎上腺素引起的肺主動脈收縮，PASMCs上CLCA2的重要性是由于有相對高的細胞內(nèi)氯離子濃度，[Ca2+]i升高是激活此通道的必要條件。本研究發(fā)現(xiàn)：CLCA2在 PASMCs中mRNA和蛋白的表達量，低氧較常氧環(huán)境明顯升高。表明低氧可上調(diào)CLCA2在PASMCs中 mRNA和蛋白的表達量，其機制尚不完全明確，可能與低氧環(huán)境下PASMCs 膜通透性增加，[Ca2+]i升高進而激活CLCA2，引起細胞內(nèi)氯離子外流，被激活的CLCA2使細胞膜去極化，電壓依賴性鈣通道開放，更多Ca2+內(nèi)流進而引起肺動脈平滑肌細胞收縮、增殖等一系列反應(yīng)[10]。

有文獻指出[11]，間歇低氧可引起ERK蛋白表達，進而激活ERK信號通路。本室先前的研究[12]也表明，在低氧高二氧化碳條件下，ERK1/2通路抑制劑-U0126可抑制二級肺動脈的Ⅱ期持續(xù)收縮反應(yīng)。本實驗發(fā)現(xiàn)：應(yīng)用ERK1/2通路抑制劑-U0126后，CLCA2在大鼠PASMCs中 mRNA和蛋白的表達量高于對照組DMSO組，應(yīng)用Staurosporine aglycone后，CLCA2在大鼠PASMCs中 mRNA和蛋白的表達水平不同程度下調(diào)，均低于對照組DMSO組。除SA組CLCA2蛋白表達結(jié)果較D組而言未達統(tǒng)計學(xué)意義外，U0126組CLCA2mRNA及蛋白、SA組CLCA2mRNA較對照組D組有統(tǒng)計學(xué)意義。以上結(jié)果提示，ERK1/2通路可參與調(diào)控SD大鼠低氧性PASMCs中CLCA2 mRNA和蛋白表達， ERK1/2可能是CLCA2的上游調(diào)控分子，但具體情況有待進一步深入研究。

綜上所述，低氧可上調(diào)CLCA2在PASMCs中 mRNA和蛋白的表達量；ERK1/2通路激活劑-Staurosporine aglycone能下調(diào)CLCA2在PASMCs中 mRNA和蛋白的表達量；ERK1/2通路抑制劑-U0126可上調(diào)CLCA2在PASMCs中 mRNA和蛋白的表達量。

[1] 馬建法. 肺動脈平滑肌細胞離子通道在肺動脈高壓中的作用[J]. 重慶醫(yī)學(xué), 2014, 43(12): 1518-1520.

[2] We C, Li HZ, Wang YH,etal. Exogenous spermine inhibits the proliferation of human pulmonary artery smooth muscle cells caused by chemically-induced hypoxia via the suppression of the ERK1/2- and PI3K/AKT-associated pathways[J].IntJMolMed, 2016, 37(1): 39-46.

[3] Young KC, Torres E, Hehre D,etal. Antagonism of Stem Cell Factor/c-kit Signaling Attenuates Neonatal Chronic Hypoxia-Induced Pulmonary Vascular Remodeling[J].PediatrRes, 2016, 79(4): 637-646.

[4] 黃林靜, 黎關(guān)龍, 何金波, 等. 鈣激活性氯離子通道在大鼠低氧高二氧化碳性PASMCs中的表達及與MAPK通路的關(guān)系[J]. 中國細胞生物學(xué)學(xué)報, 2013, 35(9): 1321-1327.

[5] 王 靜, 戴愛國. 原代大鼠肺動脈平滑肌細胞的提取和鑒定以及缺氧對其增殖的影響[J]. 中國呼吸與危重監(jiān)護雜志, 2012, 11(02):147-152.

[6] Sun H, Xia Y, Paudel O,etal. Chronic hypoxia-induced upregulation of Ca2+-activated Cl-channel in pulmonary arterial myocytes: a mechanism contributing to enhanced vasoreactivity[J].JPhysiol, 2012, 590(15): 3507-3521.

[7] 劉建華, 張曉蕓, 李 鑫, 等. CaCCs通道鈣離子依賴性機制的研究進展[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展, 2015, 15(29): 5782-5785.

[8] 王 蕊, 李 麗, 馬克濤, 等. 鈣激活氯通道對大鼠腦基底動脈舒縮活動的影響[J]. 生理學(xué)報, 2014, 66(03): 295-301.

[9] 楊 朝. 急性低氧大鼠肺動脈平滑肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣信號的變化及意義[J]. 中國病理生理雜志, 2008, 24(10): 2016-2019.

[10]潘宣任, 王 凱, 龐玉生. 鈣激活性氯離子通道抑制劑對肺動脈平滑肌作用的研究進展[J]. 重慶醫(yī)學(xué), 2015, 44(26): 3699-3701.

[11]張盼盼, 韓曉慶, 李 琳, 等. 間歇低氧大鼠細胞外信號調(diào)節(jié)激酶與認知功能變化[J]. 中國神經(jīng)精神疾病雜志, 2014, 40(9): 517-521.

[12]朱阿楠, 王萬鐵, 林麗娜, 等. MAPK通路抑制劑對低氧高二氧化碳性肺動脈收縮的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2008, 24(8): 1538-1542.

The effects of ERK1/2 pathway on the expression of calcium activated chloride channel in hypoxia in PASMCs rat model

ZHAO Mei-ping1, MA Ying-chun3+, ZHANG Cong-cong1, HUANG Lin-jing1, ZHENG Meng-xiao1, LI Guan-long4, YING Lei1,2, WANG Wan-tie1,2△

(1. Department of Pathophysiology, Wenzhou Medical University, 2. Research Institute of Wenzhou Medical University in ischemia-reperfusion injury, Wenzhou 325035; 3. Department of Pathology, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Region, Lanzhou 730050; 4. Zhejiang Provincial Academy of Medical Sciences and Health Research Institute of Toxicology Laboratory, Hangzhou 310013, China)

Objective: To investigate the expression of mRNA and protein of Calcium activated chloride channel (CLCA2) in hypoxic pulmonary artery smooth muscle cell (PASMCs) of rat and it’s relationship with ERK1/2 signal pathway. Methods: PASMCs were randomly divided into 5 groups including normal group(N group), hypoxia group(H group), DMSO group(D group), U0126 group (U group) and Staurosporine aglycone group(SA group). The protein expression of CLCA2 in PASMCs was detected by Western blot．The mRNA expression of CLCA2 was detected by half quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Results: The mRNA and protein expressions of CLCA2 in H group were significantly higher than N group (P<0.01). Comparing with D group,the mRNA and protein expressions of CLCA2 were significantly increased in U group (P<0.01),the mRNA expression of CLCA2 in SA group was obviously decreased (P<0.01) with slightly decreasing of its protein expression. Conclusion: Hypoxia promotes the expressions of mRNA and protein of CLCA2 in rat PASMCs. The ERK1/2 pathway activator Staurosporine aglycone reduces the mRNA and protein expression of CLCA2 in rats PASMCs and the ERK1/2 pathway inhibitor U0126 induces the upregulation of the mRNA and protein expressiosn of CLCA2 in rats PASMCs.

calcium activated chloride channel; hypoxia; ERK1/2; rat

浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究計劃項目(2015C37121)

2016-03-11 【修回日期】2016-10-22

R363

A

1000-6834(2017)01-047-04

△【通訊作者】Tel: 0577-86689817； E-mail: wwt@wmu.edu.cn；+： 并列第一作者