2種有毒鵝膏菌形態(tài)學(xué)及rDNA-ITS測序鑒定*

田慧敏，王秀艷，田博宇，何 靜，郭 蕊

（赤峰學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

鵝膏菌屬（Amanita）是一類分布在全世界的大型真菌，屬擔(dān)子菌門 （Basidiomycotina） 傘菌目（Agaricales） 鵝膏菌科（Amanitaceae），種類多、分布廣，全球范圍內(nèi)已描述且被承認(rèn)的有500多種，我國有記錄的約100種（含亞種、變種及變型）[1]。在鵝膏菌屬中，有些種是美味的食用菌，但更多的是毒菌。如豹斑鵝膏（A.pantherina） 和毒蠅鵝膏（A.muscaria） 就是常見的毒菌，研究表明二者均含有鵝膏毒肽和毒蠅堿等有毒物質(zhì)，誤食后會(huì)產(chǎn)生嗜睡、激動(dòng)交替出現(xiàn)幻覺、視聽障礙等，有時(shí)還會(huì)出現(xiàn)肌肉痙攣[2-5]。豹斑鵝膏和毒蠅鵝膏菌蓋顏色變化較大，誤食后經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)中毒甚至死亡的情況，因此需要對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。然而傳統(tǒng)鑒定方法往往受環(huán)境影響較大，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤鑒定。許多菌物學(xué)家利用rDNA區(qū)域測序方法對(duì)該屬真菌進(jìn)行物種鑒別[6-9]，但單一的分子鑒定有時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陽性、數(shù)據(jù)庫限制等現(xiàn)象，從而造成誤判。越來越多的菌物學(xué)家利用ITS測序和形態(tài)相結(jié)合的方法進(jìn)行分類鑒定[10-12]。通過利用形態(tài)學(xué)和ITS片段測序相結(jié)合的方法，對(duì)2個(gè)內(nèi)蒙古地區(qū)對(duì)鵝膏菌標(biāo)本進(jìn)行分類鑒定，為常見有毒鵝膏菌的準(zhǔn)確識(shí)別提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試標(biāo)本來源

供試標(biāo)本CFSZ 10250、CFSZ 13024采集于賽罕烏拉自然保護(hù)區(qū)盔甲山，新鮮時(shí)拍攝生境照片，制作干標(biāo)本、編號(hào)，超低溫冷凍處理后存放于赤峰學(xué)院菌物標(biāo)本室（Mycological Herbarium of the Chifeng College,Inner Mongolia,CFSZ）。

1.2 形態(tài)鑒定

觀察新鮮子實(shí)體大小、形狀、顏色、附屬物、菌褶著生方式、菌柄等特征，其中顏色主要依據(jù)采集時(shí)拍攝的彩色照片判斷。2個(gè)以上子實(shí)體作為重復(fù)，微觀特征使用顯微鏡（江南JSZ6）來觀察測量，包括擔(dān)孢子、擔(dān)子、褶側(cè)囊體、褶緣囊體、菌蓋菌絲和菌柄表皮菌絲等結(jié)構(gòu)。孢子大小以30個(gè)以上不同孢子的長寬范圍為重復(fù)，Q值為孢子長寬比范圍及孢子長寬比的均值，將標(biāo)本的菌褶、表皮等組織做成徒手切片，通常以4%～5%的KOH溶液作為浮載劑。然后根據(jù)文獻(xiàn) [1，2，6，13-14]進(jìn)行鑒定和分類，用顯微照相系統(tǒng)（Olympus BX53）拍攝顯微結(jié)構(gòu)照片。

1.3 ITS測序鑒定

1.3.1 基因組DNA的提取和PCR擴(kuò)增及測序

取子實(shí)體干品的菌蓋部分，研磨成粉末，稱量30 g使用試劑盒提取基因組DNA，以引物ITS1/ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增[15]，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后，委托上海生工生物科技有限公司完成測序。

1.3.2 ITS序列比較和系統(tǒng)發(fā)育分析

將已測序列在GenBank和UNITE數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對(duì)，從結(jié)果中挑選出同源性較高的ITS序列，然后使用軟件MEGA5.1構(gòu)建發(fā)育樹，比較親緣關(guān)系，鑒定到種。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果CFSZ 13024為豹斑鵝膏 [A.pantherina(DC.)Krombh]，CFSZ 10250為毒蠅鵝膏[A.muscaria(L.)Lam.]

2.1.1 毒蠅鵝膏 [Amanita muscaria(L.)Lam.]

研究標(biāo)本：2013年8月14日，內(nèi)蒙古赤峰市巴林右旗，賽罕烏拉自然保護(hù)區(qū)，榮升景區(qū)，樺林地上散生子實(shí)體，編號(hào)CFSZ 10250，劉鐵志、田慧敏等采集。標(biāo)本CFSZ 10250宏觀形態(tài)及微觀結(jié)構(gòu)見圖1。

由圖1可知，標(biāo)本子實(shí)體中等大，菌蓋直徑7.5 cm，平展，邊緣有短條紋，濕時(shí)稍粘，有少量塊狀鱗片，淺褐黃色，中央色深呈褐色，菌肉近柄處厚2 mm～4 mm，白色，無特殊氣味。菌褶白色，后變淡黃色，密，不等長，褶緣平滑。菌柄長9 cm～13 cm，粗1.0 cm～1.3 cm，棒形，基部膨大，中生，白色，中空。菌環(huán)生于菌柄上部，雙層，膜質(zhì)，白色，寬1.1 cm左右，菌托白色，環(huán)帶狀。地下生。菌幕由囊狀細(xì)胞和菌絲組成，囊狀細(xì)胞大小為（24.0～50.0） μm× （14.4～19.2） μm。孢子大小 （8.4～12.0）μm×（6.0～8.4） μm （Q=1.26～1.40，Q=1.37±0.07），寬橢圓形至橢圓形，表面光滑，有小尖，無色，內(nèi)含大油滴，無淀粉質(zhì)反應(yīng)。擔(dān)子大?。?6.0～57.6）μm×（8.6～10.1） μm，短棒狀，中部膨大，子實(shí)層有鎖狀聯(lián)合。菌蓋表皮由菌絲組成，有的菌絲具黃色顆粒，直徑7.2 μm～9.6 μm，有的菌絲無色透明，具鎖狀聯(lián)合，直徑8.4 μm～14.4 μm，有的頂端膨大，膨大細(xì)胞大小為 （40～70） μm×（15～20） μm。

毒蠅鵝膏（A.muscaria） 主要特點(diǎn)為表面顏色多樣，鮮紅色或桔紅色、淺黃色等，以鮮紅色或桔紅色最典型，菌蓋表面密被白色或稍帶黃色的顆粒狀鱗片，菌環(huán)寬，菌托環(huán)帶狀[1,13-14]。而標(biāo)本CFSZ 10250菌蓋橘黃色，中央色深呈褐色，鱗片極少，且易脫落，初步鑒定為毒蠅鵝膏少鱗變種（A.muscaria var.formosa），但根據(jù)最新文獻(xiàn)[1]該種已并入[Amanita muscaria(L.)Lam.]。該標(biāo)本雖然外形特征與典型的毒蠅鵝膏（A.muscaria） 有一些差異，但是顯微特征及分子數(shù)據(jù)結(jié)果一致，因此將該標(biāo)本鑒定為毒蠅鵝膏 [A.muscaria(L.)Lam.]。

2.1.2 豹斑鵝膏 [A.pantherina(DC.)Krombh]

研究標(biāo)本：2016年9月6日，內(nèi)蒙古赤峰市松山區(qū)，盔甲山自然保護(hù)區(qū)油松林地上，編號(hào)CFSZ 13024，田慧敏、牛夢(mèng)枝采集。標(biāo)本CFSZ 13024宏觀形態(tài)及微觀結(jié)構(gòu)見圖2。

由圖2可知，標(biāo)本子實(shí)體中等大，菌蓋8.0 cm～13.0 cm，扁半球形至平展，黃棕色，青黃色，中央色深，具白色顆粒狀鱗片，邊緣有條棱，濕時(shí)表面粘。菌肉白色，無特殊氣味，菌褶白色，離生，不等長，干后變?yōu)橥咙S色。菌柄長（8.0～17.0） cm×（0.8～2.5） cm，圓柱形，基部膨大呈臼狀，有環(huán)帶狀菌托，菌環(huán)生菌柄中部。

孢子 （8.4～12.0） μm× （7.2～9.6） μm （Q=1.00～1.66），Q=1.27±0.19），橢圓形或近球形，有小尖，表面光滑，無色，含一大油滴。擔(dān)子大?。?3.6～48.0） μm×（8.4～12.0） μm，棒狀，中部膨大，基部無鎖狀聯(lián)合。菌蓋表皮由輻射狀排列的菌絲組成，菌絲無色，直徑4.6 μm～9.6 μm，有的頂端膨大呈囊狀，（60.0～84.0） μm×（13.2～16.8） μm。菌幕由囊狀細(xì)胞和菌絲組成，囊狀細(xì)胞無色，（27.6～40.8）μm×（9.6～24） μm，菌絲無色，隔膜少，直徑2.4 μm～7.2 μm。菌柄菌絲無色，有鎖狀聯(lián)合，菌絲直徑 5.0 μm～7.2 μm。

該標(biāo)本與球基鵝膏A.subglobosa和假球基鵝膏A.ibotengutake很相似，與A.subglobosa相比區(qū)別在于該標(biāo)本擔(dān)子基部有隔膜，無鎖狀聯(lián)合，菌蓋表皮往往無鎖狀聯(lián)合，菌柄基部上的菌幕殘余具更多菌絲，而后者擔(dān)子大小為（44～65） μm×（10～13）μm，鎖狀聯(lián)合很常見[12]，且分子數(shù)據(jù)顯示，該標(biāo)本與A.ibotengutake相似度不高，因此將該標(biāo)本鑒定為豹斑鵝膏 [A.pantherina(DC.)Krombh]。

2.2 rDNA-ITS測序鑒定結(jié)果

2.2.1 PCR產(chǎn)物測序結(jié)果

供試樣品子實(shí)體DNA序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果為CFSZ 13024序列長度為704 bp，NCBI登錄號(hào)為MG 367248；CFSZ 10250序列長度為637 bp，NCBI登錄號(hào)為MG367251。

2.2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

以Volvariella volvacea作為外類群，對(duì)標(biāo)本CFSZ 10250和標(biāo)本CFSZ 13024的ITS序列及相似序列等26個(gè)ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。

如圖3所示，結(jié)果聚為3類，分別為鵝膏亞屬（Subg.Amanita） 的鵝膏組（Sect.Amanita）、鞘托鵝膏組 （Sect.Vaginatae） 和鱗鵝膏組 （Sect.Lepidella）。其中，標(biāo)本CFSZ 10250和 [A.muscariaμ(L.)Lam]聚在一起，支持率97%；標(biāo)本CFSZ 13024與A.pantherina和A.subglobosa聚在一起，其他都屬于鵝膏組（Sect.Amanita）。由于A.pantherina和A.subglobosa親緣關(guān)系很近，僅憑借ITS序列較難區(qū)分，因此結(jié)合形態(tài)學(xué)特征將CFSZ 13024鑒定為豹斑鵝膏A.pantherina。

綜合上述，形態(tài)學(xué)鑒定方法和ITS測序法相結(jié)合，CFSZ 10250為毒蠅鵝膏 [A.muscaria(L.)Lam.]，CFSZ 13024為豹斑鵝膏 [A.pantherina(DC.)Krombh]。二者均屬于鵝膏亞屬（sub.Amanita） 鵝膏組 （Sect.Amanita）。

3 討論

我國是食用菌分布和消費(fèi)的大國，民間有采食野生食用菌類的習(xí)慣。豹斑鵝膏 [A.pantherina(DC.)Krombh]和毒蠅鵝膏 [A.muscaria(L.)Lam.]為2種十分常見的毒菌，大部分省市自治區(qū)均有分布，經(jīng)常分布在闊葉林、針葉林及針闊混交林。毒蠅鵝膏A.muscaria存在嚴(yán)重地理分化現(xiàn)象，不同國家和地區(qū)毒蠅鵝膏的外形特征有較大差異[8]，菌蓋顏色多樣，有紅色、橘紅色、黃色、白色等，在我國主要為紅色和橘紅色。標(biāo)本CFSZ 10250的菌蓋為淺橘黃色，中間栗褐色，鱗片較少，與食用菌赤褐鵝膏（Amanita fulva） 的菌蓋顏色相似，但赤褐鵝膏沒有菌環(huán)，菌蓋上沒有菌幕，且具袋狀菌托。

豹斑鵝膏（A.pantherina）蓋面一般為褐色或棕褐色，有時(shí)污白色，散布白色至污白色的小斑塊或顆粒狀鱗片。標(biāo)本CFSZ 13024的菌蓋為青黃色或棕黃色，較難識(shí)別，豹斑鵝膏有劇毒，其與（A.muscaria）含有相似的有毒物質(zhì)，卵磷脂（ibotenic acid）和毒蠅堿（muscimol），但所含濃度比其他毒蠅鵝膏多得多[2-4,16]，因此誤食后死亡率很高。因此，在野生食用菌采食時(shí)應(yīng)注意細(xì)致觀察。

通過利用形態(tài)學(xué)和ITS測序相結(jié)合的方法，對(duì)2個(gè)常見毒鵝膏菌樣本進(jìn)行了鑒定，結(jié)果相互補(bǔ)充，準(zhǔn)確、科學(xué)，為赤峰市有毒鵝膏菌種鑒定和種類劃分提供參考。