萊菔硫烷促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制探討

徐其嶺 閆 莉 張 喆

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是常見的顱內(nèi)腫瘤，約占全部顱內(nèi)腫瘤44.69%[1]，目前臨床尚無根治方法。由于神經(jīng)膠質(zhì)瘤呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，手術(shù)難以全部切除，需采取放療、化療等綜合手段進(jìn)行治療，但療效仍不令人滿意[2]。因此神經(jīng)膠質(zhì)瘤的有效治療仍是臨床面臨的重大難題。但近年來有文獻(xiàn)報(bào)道，萊菔硫烷(Sulforaphane，SFN)具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用，有利于抑制化學(xué)致癌物，改變細(xì)胞異常克隆增殖，誘導(dǎo)變異細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤血管轉(zhuǎn)移灶[3]。還有大量研究顯示[4-6]，SFN在膀胱癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、前列腺癌等多個(gè)腫瘤細(xì)胞系中有較好的抗腫瘤作用，但臨床較少探討SFN在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的作用。故本次研究對(duì)SFN是否參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡進(jìn)行分析，為臨床相關(guān)診治提供參考依據(jù)，結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

Cyt-c單克隆抗體購(gòu)自ALEXIS公司，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251購(gòu)自上海晶都生物技術(shù)有限公司，二甲亞砜購(gòu)自Hyclone公司，碘化丙啶購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司。流式細(xì)胞儀購(gòu)自Life technology公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)biotek公司，離心機(jī)購(gòu)自上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 噻唑藍(lán)(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率 采用酶聯(lián)儀測(cè)定琥珀酸脫氫酶活性法(MTT比色法)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U251細(xì)胞按1×105/ml，200 μl隨機(jī)平行接種于96孔板，100 μl/孔，4 h細(xì)胞貼壁，換算SFN濃度的DMEM高糖培養(yǎng)液(SFN濃度依次為12.5 μmol/l、25 μmol/l、50 μmol/l、100 μmol/l、200 μmol/l)，每孔200 μl，之后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，從各培養(yǎng)孔中吸出培養(yǎng)液150 μl，加入等量二甲基亞砜，30 min后應(yīng)用酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)定吸光度(A)值，計(jì)算抑制率。抑制率=(SFN組OD值-對(duì)照組OD值)/對(duì)照組OD值×100%。空白對(duì)照組設(shè)為對(duì)照組。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞8×105/ml，接種于6孔板，每空1 ml，細(xì)胞貼壁后棄去原培養(yǎng)液，PBS洗2次，加入不同濃度SFN培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，胰酶消化、收集細(xì)胞，PBS洗滌2遍，在4 ℃條件下以2 000 r/min離心5 min，棄上清液，重新懸浮4 ℃預(yù)冷PBS中，-20 ℃預(yù)冷的70%乙醇2 ml，-20 ℃固定2 h以上。離心棄上清，PBS洗滌2次，懸浮細(xì)胞，加入50 μl碘化丙啶，避光孵育30 min，500目尼龍網(wǎng)過濾后應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。將樣品加入流式細(xì)胞儀樣品室，在488 nm條件下測(cè)定。

1.2.3 Western Blot法檢測(cè)SFN對(duì)U251細(xì)胞內(nèi)Cyt-c表達(dá)的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞6×105/ml接種于200 ml培養(yǎng)瓶中貼壁生長(zhǎng)后采用12.5 μmol/l、25 μmol/l、50 μmol/l、100 μmol/l、200 μmol/l濃度的SFN處理48 h，采用EDTA消化收集細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min，PBS洗滌3次，備用，加入1 ml裂解液，4 ℃條件下裂解2 h，并在此溫度下10 000 r/min離心15 min。提取總蛋白與胞質(zhì)蛋白，計(jì)算蛋白含量。各組取等量蛋白進(jìn)行電泳，然后轉(zhuǎn)移至NC膜，將膜與稀釋的一抗4 ℃冰箱孵育過夜。TTBS液洗膜3次，振搖10 min，室溫孵育2 h，沖洗后結(jié)合二抗，TTBS液洗膜3次，振搖10 min，取出NC膜DAB顯色，之后在SIM凝膠成像系統(tǒng)照相，并進(jìn)行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 U251細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率

不同濃度SFN組A值均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同濃度SFN均對(duì)U251細(xì)胞生長(zhǎng)有一定抑制作用，12.5 μmol/l、25 μmol/l、50 μmol/l、100 μmol/l濃度的SFN對(duì)U251細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率逐漸增強(qiáng)，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但100 μmol/l與200 μmol/l濃度的SFN對(duì)U251細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 U251細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率

2.2 SFN對(duì)U251細(xì)胞內(nèi)Cyt-c蛋白表達(dá)的影響

不同濃度SFN誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率及Cyt-c蛋白表達(dá)均顯著高于對(duì)照組，且隨著SFN濃度遞增，U251細(xì)胞凋亡率、Cyt-c蛋白表達(dá)逐漸增加，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 SFN對(duì)U251細(xì)胞內(nèi)Cyt-c蛋白表達(dá)的影響

3 討論

近年來，越來越多研究顯示，SFN可抑制多種致癌物質(zhì)誘發(fā)的腫瘤，現(xiàn)已成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)[7-9]。SFN一方面對(duì)Ⅰ相酶有較好的抑制作用，可明顯抑制致癌物的活化；另一方面，其也對(duì)Ⅱ相酶具有誘導(dǎo)作用，可預(yù)防致癌物誘導(dǎo)的DNA損傷，抑制多種腫瘤發(fā)生[10]。

細(xì)胞凋亡是生物體內(nèi)特定內(nèi)源與外源信號(hào)誘導(dǎo)下發(fā)生的細(xì)胞程序性死亡過程。內(nèi)源性凋亡途徑也稱為線粒體/Cyt-c介導(dǎo)的通路，線粒體是細(xì)胞生命活動(dòng)的控制的中心，其是細(xì)胞氧化磷酸化、細(xì)胞呼吸鏈及細(xì)胞凋亡調(diào)控中心[11]。目前已有研究證實(shí)，細(xì)胞凋亡步驟與細(xì)胞色素C釋放線粒體的過程有密切關(guān)系，釋放至細(xì)胞漿的Cyt-c可與凋亡相關(guān)因子結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。本次研究結(jié)果顯示，不同濃度SFN均對(duì)U251細(xì)胞生長(zhǎng)有一定抑制作用，分析原因?yàn)镾FN可通過線粒體通路抑制細(xì)胞凋亡。本次研究還顯示，隨著SFN濃度增加，SFN對(duì)U251細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率增強(qiáng)，但達(dá)到100 μmol/l后，SFN對(duì)U251細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率便無顯著變化，提示SFN對(duì)U251細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用有明顯劑量依賴關(guān)系，但達(dá)到一定濃度后，即使SFN濃度再增加，這種抑制作用也不在顯著增加。

本次研究還發(fā)現(xiàn)，不同濃度SFN誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率及Cyt-c蛋白表達(dá)均顯著高于對(duì)照組，且隨著SFN濃度遞增，U251細(xì)胞凋亡率、Cyt-c蛋白表達(dá)逐漸增加。王凡平等[13]研究也顯示，SFN具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，而且早期凋亡率呈濃度依賴性增加，本次研究結(jié)果與之相符。分析作用機(jī)制與SFN可通過線粒體通路抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。線粒體將Cyt-c釋放至細(xì)胞質(zhì)中，Cyt-c又可與凋亡蛋白酶活化因子Apaf21結(jié)合，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。趙和千等[14]研究也認(rèn)為，SFN直接作用于U251細(xì)胞，減緩U251細(xì)胞的生長(zhǎng)速度，并且誘導(dǎo)其凋亡，考慮與激發(fā)細(xì)胞內(nèi)Cyt-c表達(dá)增高有關(guān)，通過線粒體/Cyt-c介導(dǎo)的通路引發(fā)內(nèi)源性死亡來實(shí)現(xiàn)。總之，Cyt-c釋放是線粒體凋亡路徑的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，SFN對(duì)U251細(xì)胞增生抑制劑誘導(dǎo)凋亡作用可能與其有關(guān)[15-16]。因此，SFN可能通過誘發(fā)Cyt-c釋放，引發(fā)線粒體途徑的內(nèi)源性凋亡，這種作用機(jī)制可能為抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤藥物的研制提供一種新方法，值得后續(xù)研究進(jìn)一步探討。

綜上，SFN促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制與誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)Cyt-c釋放有關(guān)。