新型NaGdF4納米造影劑的制備及性能

孫天賜，劉建華，錢海生，何 濤

(1.合肥工業(yè)大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，安徽合肥230009；2.合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽合肥230009)

磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging，簡稱MRI)無輻射、安全性高、軟組織分辨能力較強(qiáng)，已成為臨床影像醫(yī)學(xué)的重要手段[1]。MRI通常需要使用造影劑(Contrast-agent)進(jìn)行高分辨的影像學(xué)診斷[2-3]。目前的T1類商用造影劑包括Gd-BOPTA(釓噴酸葡胺)[4]、Gd-DTPA-BMA(Omniscan)[5]和Gd-BOPTA(Multi Hance)[6]等。傳統(tǒng)的Gd3+類鰲合物造影劑存在體內(nèi)滯留時間短、弛豫率低、Gd3+易泄漏、毒性較高等缺陷[7-10]。為克服這些缺點(diǎn)，T1類釓基納米磁共振造影劑近期引起了廣泛的關(guān)注[11-13]，其優(yōu)勢包括化學(xué)穩(wěn)定性好，Gd3+泄漏小，毒副作用低[14]，成像對比度高等[15]。此外，相關(guān)研究表明，尺寸小于20nm的納米造影劑通常具有較低的細(xì)胞攝取水平，作為成像探針具有更長的體內(nèi)滯留時間[16]。

我們前期報(bào)道了一種基于制備NaGdF4納米T1造影劑的方法[17]。NaGdF4納米顆粒經(jīng)過親水聚合物的表面修飾，可均勻分散于水中，穩(wěn)定性較好，毒性較低，可作為高效MRI的T1造影劑。前期工作中，我們采用了固定分子量的線形PEG/PAA 共聚物進(jìn)行納米顆粒的表面修飾，主要考查其生物應(yīng)用部分，尚未關(guān)注不同分子量的聚合物對納米顆粒的修飾及相關(guān)水分散效果、形貌等的影響。

本工作中，我們著重于采用不同聚合比例的聚合物對NaGdF4納米顆粒進(jìn)行親水性修飾，并考查其形貌和性能隨聚合物的變化，從而掌握制備穩(wěn)定NaGdF4納米水分散液的相關(guān)信息。這些內(nèi)容對未來制備穩(wěn)定高效并進(jìn)一步推廣NaGdF4類納米造影劑至關(guān)重要。我們通過可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合(RAFT)，首先合成了線型嵌段共聚物聚丙烯酸-聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(P(AA-b-OEGMA))；接著采用配體交換法對NaGdF4納米顆粒進(jìn)行親水性修飾。我們發(fā)現(xiàn)，采用不同分子量的P(AA-b-OEGMA)進(jìn)行修飾，會得到不同形貌的P(AA-b-OEGMA)-NaGdF4納米顆粒水分散液(PAO-NaGdF4-NPs，PAO-NaGdF4-Cluster)：即單分散和納米聚集體形貌。我們對所得PAO-NaGdF4的尺寸、形貌及性能進(jìn)行了表征。結(jié)果表明，兩種PAO-NaGdF4納米均具有良好的水分散性和穩(wěn)定性，Gd3+的泄漏率均很低。體外M R實(shí)驗(yàn)顯示二者弛豫率是商用Gd-BOPTA 復(fù)合物的1.5～2倍，具有良好的臨床轉(zhuǎn)化前景。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料和試劑

4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸(CT A)、聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(OEGMA)，分析純，Sigma-Aldrich公司；丙烯酸(AA)、偶氮二異丁腈(A IB N)，分析純，阿拉?。?,4-二氧六環(huán)、環(huán)己烷、丙酮、四氫呋喃(T H F)，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；NaGdF4納米顆粒按前期報(bào)道自制[17]。

1.2 P(AA-b-OEGMA)的合成

采用可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合(RAFT)方法進(jìn)行，分兩步聚合：

在反應(yīng)管中，加入鏈轉(zhuǎn)移劑CT A(27.9mg，0.1 mmol)，引發(fā)劑A IB N(3.28mg，0.02 mmol)，一定量的單體OEGMA，用5 mL 1,4-二氧六環(huán)溶解。密封條件下，通過冷凍解凍泵循環(huán)法除去反應(yīng)體系中的氧氣。將反應(yīng)管置于70℃油浴下，通入氮?dú)?，磁力攪拌反?yīng)16h。反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物在環(huán)己烷中沉淀，真空干燥，得到聚合產(chǎn)物POEGMA，通過控制OEGMA 的投入量控制POEGMA 的分子量。反應(yīng)式如圖1所示。

圖1 POEGMA 的合成示意圖

圖2 P(AA-b-OEGMA)的合成示意圖

在反應(yīng)管中，上述產(chǎn)物POEGMA、引發(fā)劑A IB N(3.28mg，0.02mmol)、不同量的單體AA，溶解于8mL 1,4-二氧六環(huán)。密閉條件下，氧氣通過冷凍解凍泵循環(huán)法除去，隨后將反應(yīng)管通入氮?dú)猓?0℃油浴加熱，磁力攪拌反應(yīng)16h。反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物用環(huán)己烷沉淀，真空干燥，得到聚合產(chǎn)物P(AA-b-OEGMA)，通過控制AA 的投入量控制P(AA-b-OEGMA)的分子量。反應(yīng)式如圖2所示。

1.3 水分散P(AA-b-OEGMA)-NaGdF4(PAO-NaGdF4)的合成

采用配體交換法對NaGdF4納米顆粒進(jìn)行親水性修飾：在單口玻璃瓶中用10mL 1,4-二氧六環(huán)溶解60mg不同分子量的P(AA-b-OEGMA)，隨后置于60℃油浴中，預(yù)熱20min。取30mgNaGdF4納米顆粒溶解在10mL 環(huán)己烷中，通過滴液漏斗逐滴加入到上述單口瓶中，磁力攪拌、60℃條件下反應(yīng)12h。反應(yīng)結(jié)束后，在混合溶液中加丙酮離心，倒掉上清液，得到的白色沉淀物在真空干燥后用T H F 溶解，去離子水中透析48h，得到不同形貌的P(AA-b-OEGMA)-NaGdF4水分散液(PAO-NaGdF4)。

1.4 表征

核磁測試1HNMR 采用安捷倫VNMRS 600型核磁共振儀，溶劑采用氘代氯仿(CD3Cl)與氘代二甲亞砜(DMSO)，并以四甲基硅烷(TMS)為內(nèi)標(biāo)物；粒徑測量采用英國馬爾文儀器有限公司的粒度分析儀(DLS)，儀器型號M S-2000；形貌觀察采用場發(fā)射透射電子顯微鏡(TEM)，儀器型號JEM-2100F，日本電子制造。

1.5 PAO-NaGdF4安全性的測定

合成的PAO-NaGdF4水溶液在PB S 緩沖液中透析，取第1、3、7天的透析液，采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀(ICP-A ES)(O ptima-7300D V，U S A)測定透析液中Gd3+的濃度。PAO-NaGdF4的安全性通過Gd3+的泄漏率來評估，Gd3+的泄漏率用下式計(jì)算：

Leakagerate of Gd3+(%)=(Ct/C0)×100%

式中：Ct為不同時刻透析液中Gd3+的濃度；C0為PAO-NaGdF4水溶液中Gd3+的濃度。

1.6 PAO-NaGdF4體外弛豫率的測定

將不同形貌的PAO-NaGdF4水溶液稀釋至含Gd3+濃度為0.05 mmol/L，0.1 mmol/L，0.2mmol/L，0.4 mmol/L，0.8mmol/L 的水溶液后，移至離心管中，并置于臨床S iemensM agnetomT rio3.0T M R 成像儀中掃描，測得不同濃度的縱向弛豫時間(T1)，弛豫率(r1)由縱向弛豫時間T1的倒數(shù)對Gd3+濃度進(jìn)行線性擬合得到。

2 結(jié)果與討論

2.1 P(AA-b-OEGMA)的合成

圖3 POEGMA 32(A)和P(AA 112-b-POEGMA 32)(B)的核磁共振氫譜圖

我們合成了不同分子量P(AA-b-OEGMA)嵌段共聚物。對比實(shí)驗(yàn)證明，經(jīng)P(AA112-b-OEGMA32)和P(AA32-b-OEGMA9)兩種共聚物修飾的納米水分散液最穩(wěn)定。因此后續(xù)工作主要集中在這兩種共聚物上。其中代表性的POEGMA32和P(AA112-b-POEGMA32)的核磁譜圖示于圖3。

從圖3(A)中可以歸屬出，聚合物中屬于OEGMA 中氫質(zhì)子的峰位：δ=3.65處表示OEGMA 鏈上亞甲基(OCH2-CH2-O)的質(zhì)子峰；δ=3.5處為OEGMA 末端中(OCH3)氫的質(zhì)子峰；δ=0.8處為OEGMA 中在聚合物主鏈上(C-CH3)氫的質(zhì)子峰。從圖3(B)中可以看出δ=12.23處為PAA 鏈段中羧基(-COOH)氫的質(zhì)子峰。核磁共振氫譜驗(yàn)證了線型嵌段聚合物P(AA112-b-POEGMA32)的成功合成。

2.2 經(jīng)P(AA-b-OEGMA)嵌段共聚物表面修飾的NaGdF4納米

圖4 PAO-NaGdF4-NPs的透射電子顯微鏡圖片(A,B)與動態(tài)光散射譜圖(C)

我們發(fā)現(xiàn)，采用不同的P(AA-b-OEGMA)嵌段共聚物對預(yù)先制得的疏水性NaGdF4納米顆粒進(jìn)行親水性修飾，即用羧基交換其表面的油酸，可得到穩(wěn)定的不同形貌的親水性NaGdF4納米材料(PAO-NaGdF4)。例如，用P(AA32-b-OEGMA9)親水性修飾時，可以得到穩(wěn)定的單分散的PAO-NaGdF4納米顆粒(PAO-NaGdF4-NPs)。圖4(A,B)為不同分辨率下PAO-NaGdF4-NPs的T EM 照片，可以看出PAO-NaGdF4-NPs基本為均勻分散；圖4(C)為PAO-NaGdF4-NPs在水溶液中的粒徑分布圖，可以看出PAO-NaGdF4-NPs的粒徑在14 nm左右，并且分散較為均勻。

圖5 PAO-NaGdF4-C luster的透射電子顯微鏡圖片(A,B)與動態(tài)光散射譜圖(C)

而當(dāng)采用P(AA112-b-OEGMA32)對NaGdF4納米顆粒進(jìn)行親水性修飾時，得到的是穩(wěn)定的聚集態(tài)的PAONaGdF4納米顆粒(PAO-NaGdF4-Cluster)。如圖5(A,B)所示，不同分辨率下的T EM 照片顯示PAO-NaGdF4-Cluster在水溶液中呈聚集態(tài)，每個聚集體由多個納米顆粒團(tuán)聚形成，且聚集體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，尺寸分布比較均勻；圖5(C)可以看出PAO-NaGdF4-Cluster在水溶液中的粒徑在180nm左右，粒徑尺寸分布均勻。

以上結(jié)果表明，最終的NaGdF4納米是單分散還是聚集體形貌，取決于所用的P(AA-b-OEGMA)的結(jié)構(gòu)和分子量。當(dāng)共聚物中的羧基(-COOH)鏈段較長時，同一聚合物鏈的聚羧基片段會修飾到不同NaGdF4的納米表面，導(dǎo)致多個納米顆粒被聯(lián)接起來，從而最終得到聚集態(tài)的形貌。而聚合物中羧基含量較少時，同一聚合物鏈主要集中在同一個納米顆粒表面，不會聯(lián)接到其他納米，因此可以得到單分散的NaGdF4的納米。

2.3 PAO-NaGdF4納米顆粒的安全性

圖6 PAO-NaGdF4-NPs和PAO-NaGdF4-C luster的Gd3+泄漏率曲線

為滿足臨床應(yīng)用，我們進(jìn)行了Gd3+泄漏對比實(shí)驗(yàn)。圖6中黑線為PAO-NaGdF4-NPs的Gd3+泄漏率曲線，紅線為PAO-NaGdF4-Cluster的Gd3+泄漏率曲線，結(jié)果表明，兩種納米顆粒在七天內(nèi)Gd3+幾乎無泄漏，具有較高的安全性。

2.4 PAO-NaGdF4納米顆粒的弛豫性能

圖7 PAO-NaGdF4-NPs(A)和PAO-NaGdF4-C luster(B)的弛豫率

圖7為兩種納米顆粒的弛豫率(r1)擬合圖，從1/T 隨Gd3+的濃度變化圖斜率計(jì)算出的單分散PAO-NaGdF4納米顆粒的相對r1值為5.59mM-1S-1；聚集態(tài)PAO-NaGdF4納米顆粒的相對r1值為7.01 mM-1S-1。體外M R 成像研究證實(shí)，兩種PAO-NaGdF4納米顆粒均比商用Gd-BOPTA 造影劑(3.8mM-1S-1)有更高的弛豫率，具有臨床轉(zhuǎn)化前景。

3 結(jié)論

本研究合成了兩種能用于磁共振T1造影的新型納米造影劑PAO-NaGdF4-NPs和PAO-NaGdF4-Cluster，對其進(jìn)行表征，并探討二者縱向馳豫性能。兩種納米顆粒在水溶液中結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，均無Gd3+泄漏。體外M R 成像研究表明，二者相較于大多數(shù)商用造影劑有更高的弛豫率，具有向臨床應(yīng)用造影劑轉(zhuǎn)化的潛力。