畜禽養(yǎng)殖場污水處理系統(tǒng)中諾氟沙星抗性菌的篩選及其抗性基因分析

趙翰斌,陳 鑫,武廣哲,周純淳,劉莉莉

(華東理工大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院/ 國家環(huán)境保護(hù)化工過程環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200237)

抗生素在預(yù)防和治療疾病中起著重要作用,同時(shí)也是農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)的保障[1]。我國每年生產(chǎn)大約21萬 t抗生素,其中46%的抗生素被用于畜牧業(yè)[2]。然而大多數(shù)抗生素并不能被動(dòng)物腸道完全吸收,多達(dá)30%～90%的抗生素以母體化合物的形式通過糞便或尿液排出體外[3],進(jìn)入污水處理系統(tǒng)中,誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的抗性菌及抗性基因。EVERAGE等[4]從路易斯安那州蒂博多市污水處理廠中發(fā)現(xiàn)Escherichiacoli、Staphylococcusaureus、Enterococcusfaecalis、Enterobactercloacae這4種菌對其研究的大多數(shù)抗生素如四環(huán)素、氯霉素等均有抗性。YUAN等[5]從武漢一家典型的畜禽廢水處理廠進(jìn)出水中檢測到了sulI、tetA、qnrD、mphB、mcr-1基因。CHEN等[6]從江蘇12家不同畜禽養(yǎng)殖場的廢水中檢測到了tetA、tetC、sul1、sul2、oqxB、qnrS等基因。污水處理系統(tǒng)已經(jīng)成為抗生素抗性菌和抗性基因的重要儲存庫[7]。

諾氟沙星是動(dòng)物疾病治療中應(yīng)用最為廣泛的氟喹諾酮類抗生素之一[8-10]。2013年我國諾氟沙星用量達(dá)5 400 t,其中獸用量占比為81.38%[11]。趙晶等[12]對上海市崇明島養(yǎng)殖場糞肥中氟喹諾酮類抗生素進(jìn)行調(diào)查,發(fā)現(xiàn)其總含量范圍為9.00～950 μg·kg-1,平均值為144 μg·kg-1。ZHAO等[13]對我國8省畜禽養(yǎng)殖場的抗生素污染情況調(diào)查發(fā)現(xiàn)w(諾氟沙星)在養(yǎng)雞場糞便中最高,達(dá)225.45 mg·kg-1,遠(yuǎn)高于w(土霉素)(10.56 mg·kg-1)和w(磺胺甲惡唑)(2.80 mg·kg-1)。同時(shí),氟喹諾酮類抗性菌在污水處理系統(tǒng)中被頻繁檢出,例如JUNG等[14]從美國阿肯色州小石城污水處理廠的好氧池中分離得到Escherichiacoli菌株LR09,發(fā)現(xiàn)其含有環(huán)丙沙星-乙酰化變異基因aac(6′)-Ib-cr,并可通過乙?；瘉斫到猸h(huán)丙沙星和諾氟沙星。ZHANG等[15]從我國中部地區(qū)8家養(yǎng)雞場和11家活禽市場的畜禽廢水中分離得到206株彎曲桿菌菌株,發(fā)現(xiàn)所有菌株對諾氟沙星、環(huán)丙沙星和頭孢唑啉具有抗性,并且還觀察到對氟喹諾酮類,β-內(nèi)酰胺類和四環(huán)素類抗生素的普遍抗性。此前的研究表明,微生物對氟喹諾酮類抗生素的耐藥機(jī)制主要分為外排泵、酶的作用以及改變氟喹諾酮類抗生素結(jié)合位點(diǎn)[16-17]。JIA等[18]在研究降解菌對環(huán)丙沙星的降解作用過程中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素P450酶〔京都基因與基因組百科全書(KEGG)蛋白編號:K00980〕能夠?qū)⒓?xì)胞體內(nèi)環(huán)丙沙星的哌嗪基分解或羥基化成其他中間體。ZHANEL等[19]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過氟喹諾酮類抗生素治療后分離得到的抗性銅綠假單胞菌中至少含有一種外排泵機(jī)制。目前,關(guān)于污水處理系統(tǒng)中諾氟沙星抗性菌的研究多集中在抗生素抗性及抗性基因的表達(dá)上。因此,開展畜禽養(yǎng)殖廢水生物處理系統(tǒng)中諾氟沙星抗性基因的種類和遺傳特性的研究對抗生素抗性菌的環(huán)境行為和風(fēng)險(xiǎn)評估具有重要意義。

該研究從畜禽養(yǎng)殖場污水處理系統(tǒng)中篩選分離得到諾氟沙星抗性菌,考查了該抗性菌中典型的抗性功能基因種類及遺傳特性,可為評估畜禽養(yǎng)殖廢水生物處理系統(tǒng)中抗生素抗性菌的環(huán)境行為和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)等提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集及預(yù)處理

研究樣品采集自江蘇某肉鵝養(yǎng)殖場污水處理系統(tǒng)中的二沉池污泥,該處理工藝為上流式厭氧污泥床反應(yīng)器(UASB)厭氧發(fā)酵串聯(lián)厭氧-缺氧-好氧生物脫氮除磷工藝(A2/O)。取樣設(shè)備經(jīng)消毒處理,樣品采集后于4 ℃條件下避光保存,用于后續(xù)抗性菌株的篩選和培養(yǎng)。

1.2 諾氟沙星儲備液和培養(yǎng)基的配制

諾氟沙星儲備液:稱取100.0 mg諾氟沙星,加入超純水溶解,轉(zhuǎn)移到100 mL棕色容量瓶中定容。配制成ρ為1 000 mg·L-1的儲備液,4 ℃條件下避光保存。

LB液體培養(yǎng)基:蛋白胨10.0 g,酵母粉5.0 g,氯化鈉10.0 g,加去離子水定容到1 000 mL,用w為1%的HCl和1%的NaOH調(diào)節(jié)pH值為7。在高壓滅菌鍋中120 ℃滅菌20 min后4 ℃條件下保存[20]。

固體選擇培養(yǎng)基:在1 000 mL液體培養(yǎng)基中加入3.0～4.0 g瓊脂,在高壓滅菌鍋中120 ℃滅菌20 min,待溫度降低至40～50 ℃時(shí)加入諾氟沙星儲備液,倒入培養(yǎng)皿中,4 ℃條件下保存。

1.3 抗性菌的篩選和鑒定

取污泥樣品5.0 g和液體培養(yǎng)基100 mL加入到250 mL錐形瓶中,加諾氟沙星儲備液使其ρ分別為1、50、100、500 μg·L-1。將錐形瓶置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中(30 ℃,150 r·min-1)培養(yǎng)15 d。重復(fù)轉(zhuǎn)接3次后用滅菌后的生理鹽水梯度稀釋培養(yǎng)液,均勻涂布于固體選擇培養(yǎng)基上,在恒溫生化培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)48 h后取單菌落分離純化,得到諾氟沙星抗性菌。對所得菌株進(jìn)行16S rRNA基因序列測定,在美國國家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(NCBI)中進(jìn)行核苷酸序列比對(Blastn),利用MEGA 5.1軟件構(gòu)建諾氟沙星抗性菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹[21]。

1.4 菌株抗性蛋白特性分析

根據(jù)抗性菌株的16S rRNA基因鑒定結(jié)果,選擇與之同種的全基因組序列在京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(KEGG)中進(jìn)行蛋白功能注釋,根據(jù)注釋結(jié)果將抗性菌株的抗性蛋白與美國國家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(NCBI)中已知的蛋白序列進(jìn)行蛋白質(zhì)序列比對(Blastp),選取相似度較高的蛋白序列,利用MEGA 5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,對抗性菌株的抗性蛋白進(jìn)行同源性分析。

1.5 菌株抗性基因基因簇分析

根據(jù)抗性菌株抗性蛋白同源性分析結(jié)果,對其編碼基因進(jìn)行基因簇同線性分析,在抗性菌株的蛋白注釋結(jié)果中選取該蛋白在內(nèi)的前后各5條蛋白序列,將其與同線性分類數(shù)據(jù)庫(SyntTax)中已知蛋白序列的同種屬菌株進(jìn)行比對,選擇與菌株抗性蛋白編碼順序一致性較高的基因簇圖,進(jìn)行抗性基因的基因簇同線性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 諾氟沙星抗性菌株鑒定

2.1.1菌株的生理生化特性

采用選擇性培養(yǎng)基富集、篩選得到多株耐受諾氟沙星的抗性菌,取其中一株進(jìn)行研究,將其取名為TY-1。該菌落呈乳黃色、圓形、濕潤、有光澤、邊緣光滑齊整〔圖1(a)〕;革蘭氏染色后菌體呈陰性、短桿狀〔圖1(b)〕。其生理生化特性鑒定結(jié)果見表1。

2.1.2抗性菌的16S rRNA基因鑒定

將菌株TY-1的16S rRNA基因序列提交到美國國家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(NCBI)中,與所有已知菌的16S rRNA基因序列進(jìn)行核苷酸序列比對(Blastn),發(fā)現(xiàn)菌株TY-1與鞘氨醇單胞菌屬有較高同源性,選取與菌株TY-1相似度較高的菌株序列構(gòu)建16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。結(jié)果表明,菌株TY-1與Sphingomonassp. (KX641517)和Sphingomonassp. (KY357347)的同源性最高,相似度達(dá)98%,據(jù)此基本可認(rèn)定菌株TY-1屬鞘氨醇單胞菌屬,且該菌屬部分種屬于條件致病菌[22],因此,有必要進(jìn)一步對其抗性基因種類及其遺傳特性等進(jìn)行分析。

圖1 菌株TY-1菌落形態(tài)和菌體形狀觀察

表1 菌株TY-1生理生化特性

圖2 菌株TY-1的16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 菌株TY-1對諾氟沙星的抗性分析

2.2.1菌株TY-1抗性蛋白特性分析

一般認(rèn)為,同源性較高的蛋白質(zhì)其功能相似甚至相同。因此,一條已知序列但功能未知的蛋白序列可以參考其同源蛋白的功能來推測[23]。在美國國家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(NCBI)中進(jìn)行核苷酸序列比對(Blastn)發(fā)現(xiàn),菌株TY-1的16S rRNA基因序列與已知全基因序列的菌株Sphingomonassp. (JX219397)具有最高的同源性,相似度為99%,因此推測其在功能上也具有相似性。通過對Sphingomonassp.全基因序列的蛋白功能注釋,可以近似分析菌株TY-1的蛋白序列信息(圖3)。

圖3 菌株TY-1 抗性蛋白序列系統(tǒng)發(fā)育樹

注釋結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株TY-1可能具有多種氟喹諾酮類抗生素抗性蛋白,如腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白〔the adenosine triphosphate (ATP)-binding cassette transporter,ABC transporter〕(YP007614746)、主要易化子超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(the major facilitator superfamily transporter,MFS transporter)(YP007617242)和細(xì)胞色素P450脫氫酶(YP007616462)等。有研究報(bào)道氟喹諾酮類抗性菌通過基因編碼的腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和主要易化子超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有氟喹諾酮類抗生素抗性[24-25]?？剐跃幋a的細(xì)胞色素P450脫氫酶可通過改變諾氟沙星的結(jié)構(gòu)影響諾氟沙星的活性,是抗性菌重要的抗性機(jī)制[19]。

將注釋結(jié)果中發(fā)現(xiàn)的3種抗性蛋白序列與美國國家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(NCBI)中已知微生物蛋白序列進(jìn)行蛋白質(zhì)序列比對(Blastp),發(fā)現(xiàn)菌株TY-1與鞘氨醇單胞菌屬菌株的同源性較高,相似度均在99%以上,選取較高的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。3種抗性蛋白序列的比對結(jié)果均與Sphingomonasfennica所含蛋白序列的同源性高,且同時(shí)與其他多個(gè)鞘氨醇單胞菌屬菌株如Sphingomonaslaterariae、Sphingomonaswittichii等具有較高的同源性,表明這些抗性蛋白的編碼基因序列在Sphingomonas菌屬中普遍存在。據(jù)此推測腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、主要易化子超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和細(xì)胞色素P450脫氫酶的編碼基因在鞘氨醇單胞菌屬中具有一定的遺傳保守性。

2.2.2抗性蛋白編碼基因基因簇分析

已有研究表明,多個(gè)連續(xù)蛋白編碼基因在同一菌屬內(nèi)廣泛存在,說明其更多來源于直系遺傳,而該編碼基因在相應(yīng)的菌屬中具有一定的保守性[22,26]。將菌株TY-1的抗性蛋白序列與同線性分類數(shù)據(jù)庫(SyntTax)中同種屬菌株的蛋白序列進(jìn)行比對,以分析抗性蛋白編碼基因的基因簇同線性及抗性基因的保守性。結(jié)果表明,菌株TY-1的腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼基因與鞘氨醇單胞菌屬菌株Sphingomonassp. MM 1、Sphingomonassp. KC8、SphingomonaskoreensisABOJV和SphingomonashengshuiensisWHSC8的基因簇同線性較好,同時(shí)在這些菌株的基因序列中均包含腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABC transporter)的編碼基因〔圖4(a)〕。

圖4 菌株TY-1抗性蛋白編碼基因在不同鞘氨醇單胞菌屬間的對比分析

菌株TY-1的主要易化子超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MFS transporter)的編碼基因與鞘氨醇單胞菌屬菌株SphingomonasmelonisTY、SphingomonasmelonisZJ26、Sphingomonassp. NICI和SphingomonastaxiATCC55669的基因簇同線性較好,同時(shí)在這些菌株的基因序列中均包含主要易化子超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼基因〔圖4(b)〕。這些與腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和主要易化子超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的藥物外排作用相吻合,據(jù)此推測菌株TY-1與其他鞘氨醇單胞菌一樣,可通過外排泵作用將諾氟沙星泵出體外,使菌株獲得諾氟沙星抗性。同時(shí),菌株TY-1的細(xì)胞色素P450脫氫酶的編碼基因與鞘氨醇單胞菌屬菌株Sphingomonassp. MM 1和Sphingomonassp. KC8的基因簇具有較好的同線性〔圖4(c)〕,且在這些菌株的基因序列中均包含細(xì)胞色素P450脫氫酶的編碼基因,這與細(xì)胞色素P450脫氫酶的抗生素抗性相吻合,由此可推測該細(xì)胞色素P450脫氫酶的編碼基因在鞘氨醇單胞菌屬中具有普遍存在性,其對諾氟沙星抗性起積極作用。

3 結(jié)論

(1)從江蘇省某肉鵝養(yǎng)殖場污水處理系統(tǒng)的二沉池污泥中篩選分離得到一株諾氟沙星抗性菌TY-1,經(jīng)形態(tài)觀察及16S rRNA基因序列分析,鑒定該菌株屬于鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonassp.)。

(2)根據(jù)鞘氨醇單胞菌屬菌株的全基因組蛋白功能注釋結(jié)果可知,菌株TY-1對諾氟沙星的主要抗性機(jī)制為通過腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和主要易化子超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將諾氟沙星泵出體外,或利用細(xì)胞色素P450脫氫酶將諾氟沙星的哌嗪基分解或羥基化成其他中間體，導(dǎo)致諾氟沙星失活,且該菌株的諾氟沙星抗性蛋白與鞘氨醇單胞菌屬的對應(yīng)功能酶具有很高的同源性,功能上具有高度相似性。

(3)通過同線性分類數(shù)據(jù)庫(SyntTax)對菌株TY-1中的抗性蛋白編碼基因進(jìn)行基因簇同線性分析,發(fā)現(xiàn)其抗性基因與鞘氨醇單胞菌屬的其他已知菌株的基因簇同線性較好,表明腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、主要易化子超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和細(xì)胞色素P450脫氫酶這些功能酶在鞘氨醇單胞菌屬菌株中具有普遍存在性,即具有一定的保守性。