外泌體在HBV感染相關(guān)性肝臟疾病中的研究進(jìn)展*

王 路,葉 莎,史清海綜述,伏建峰△審校

(1.新疆維吾爾自治區(qū)巴州人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科,新疆庫爾勒 841000；2.新疆軍區(qū)總醫(yī)院臨床檢驗診斷中心,新疆烏魯木齊 830000)

慢性乙型肝炎(CHB)是全球流行疾病，約有20億人曾感染過乙型肝炎病毒(HBV)，其中慢性感染者有2.4億人[1]，每年有約65萬人死于HBV感染導(dǎo)致的肝臟疾病[2]。在我國，已確診的CHB患者人數(shù)眾多，并且發(fā)病率呈逐年上升趨勢[3]。目前已證實，HBV感染的慢性化是導(dǎo)致肝纖維化、肝細(xì)胞癌(HCC)發(fā)生的主要原因[4]。近年來的多項研究顯示，外泌體源性的微小RNA(miRNA)、長鏈非編碼RNA(lncRNA)、蛋白質(zhì)等可能參與了HBV感染所致肝炎、肝纖維化、HCC的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸，可能是HBV傳播、感染、致病的一種重要媒介[5-6]。為理清外泌體參與HBV感染相關(guān)性肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展的機制，本文就該問題綜述如下。

1 外泌體

外泌體是一種直徑為30～100 nm的磷脂雙分子膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞囊泡，廣泛存在于血液、羊水、尿液、腹水、腦脊液、母乳、精液及膽汁等體液中[7-8]。外泌體可攜帶脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、信使RNA(mRNA)、miRNA、lncRNA，甚至DNA等，將生物信息傳遞給受體細(xì)胞，在正常或疾病狀態(tài)下發(fā)揮其生理及生物學(xué)作用[9]。長期以來，外泌體的功能被認(rèn)為是去除細(xì)胞內(nèi)不需要的“垃圾”蛋白質(zhì)和核酸分子，而近期的研究表明，外泌體可作為細(xì)胞通信介質(zhì)調(diào)控機體正常的生理過程，以及參與疾病的發(fā)生和發(fā)展[10]。

外泌體具有多種功能，既可以傳遞給受體細(xì)胞保護性的信號，又能導(dǎo)致受體細(xì)胞病理性損傷，這主要取決于外泌體來源的組織和攜帶的分子[10]。根據(jù)第4版外泌體數(shù)據(jù)庫，來自各種生物和細(xì)胞的外泌體含有4 563種蛋白質(zhì)、194種脂質(zhì)、1 639種mRNA和764種miRNA[11]。其中外泌體RNAs，特別是miRNA和lncRNA[12]，在細(xì)胞信號傳導(dǎo)和交換的過程中發(fā)揮著調(diào)控靶細(xì)胞生理和病理活動的關(guān)鍵作用。病毒感染相關(guān)研究表明：外泌體一方面可通過激活抗病毒通路或傳遞抗病毒分子引起機體免疫應(yīng)答；另一方面可傳遞病毒核酸和蛋白質(zhì)，改變微環(huán)境，參與致病過程[13]。

2 外泌體與HBV感染

HBV感染引起的CHB在我國發(fā)病率較高，而HBV持續(xù)復(fù)制和機體免疫功能低下誘發(fā)的肝臟組織免疫損傷是導(dǎo)致乙型肝炎慢性化的主要原因。

2.1外泌體源性的HBV感染標(biāo)志物 研究發(fā)現(xiàn)，外泌體參與病毒性肝炎的發(fā)生、發(fā)展過程，并且外泌體可作為病毒性肝炎等相關(guān)疾病的潛在分子標(biāo)志物。在病毒性肝炎中，外泌體可以作為病毒、蛋白質(zhì)、宿主RNA的攜帶者。JIA等[14]研究了來源于被HBV感染的Hepad38細(xì)胞分泌的外泌體，通過非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定出1 412個外泌體蛋白質(zhì)，其中包括外泌體標(biāo)志蛋白、肝功能相關(guān)蛋白、免疫相關(guān)蛋白以及蛋白酶復(fù)合物蛋白等。這些外泌體，尤其是被HBV感染且復(fù)制的Hepad38細(xì)胞分泌的外泌體和亞病毒顆粒能使PD-L1表達(dá)上調(diào)和CD69表達(dá)下調(diào)。這一改變說明：與未被HBV感染的Hepad38細(xì)胞分泌的外泌體相比，被HBV感染的Hepad38細(xì)胞分泌的外泌體和亞病毒顆粒具有很強的免疫抑制作用[15]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，HBV感染者外周血血清分離出的外泌體中含有大量的病毒成分，包括HBV-DNA、HBV-RNA、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)、蛋白質(zhì)[16-17]。馬越云[6]對8份血清標(biāo)本(HBV-DNA水平在107IU/mL以上)進(jìn)行檢測，提取后的外泌體中HBV-DNA水平明顯高于血清中HBV-DNA水平，最高可達(dá)9.8倍，提示外泌體是血清HBV-DNA的重要來源。此外，攜帶有HBV-DNA的外泌體，經(jīng)熒光色素DiD標(biāo)記并感染自然殺傷(NK)細(xì)胞后，可在NK細(xì)胞中檢出外泌體和HBV-DNA，包括松弛環(huán)狀DNA(rcDNA)和共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)[17]。以上研究顯示，外泌體可通過抑制機體免疫功能促進(jìn)HBV復(fù)制而使病毒轉(zhuǎn)移、感染下一個細(xì)胞，外泌體源性的HBsAg、HBeAg、HBV-DNA等可能是細(xì)胞外HBV感染標(biāo)志物的來源，故檢測外泌體源性的HBV感染標(biāo)志物有助于隱匿性感染的發(fā)現(xiàn)。

2.2外泌體源性的miRNA在HBV感染中的作用 肝臟細(xì)胞除了分泌包裹病毒成分的外泌體外，還可以分泌富含內(nèi)源性mRNA、miRNA、lncRNA和蛋白質(zhì)等效應(yīng)分子的外泌體，并發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)[18]。HBV可以調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)，并且HBV相關(guān)的miRNA可被分泌到細(xì)胞外囊泡中。有研究發(fā)現(xiàn)，HBV感染肝細(xì)胞分泌的外泌體miR-194-5p水平明顯高于無HBV感染肝細(xì)胞分泌的外泌體miR-194-5p水平，這與CHB患者血清miR-194-5p水平高于健康對照者的結(jié)果一致[19]。為探討巨噬細(xì)胞外泌體與CHB肝損傷的相關(guān)性，有研究者發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞外泌體miR-638水平在CHB中高表達(dá)，巨噬細(xì)胞外泌體可以明顯地抑制HBV-DNA的復(fù)制，同時還發(fā)現(xiàn)HBV復(fù)制活躍期血清外泌體中miR-638的表達(dá)低于HBV非復(fù)制期，并且在HBV復(fù)制活躍期血清外泌體miR-638的表達(dá)與其自身的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、HBV-DNA載量呈負(fù)相關(guān)[20]。HBV感染的肝細(xì)胞來源的外泌體miR-3也可抑制HBV-DNA的復(fù)制，外泌體miR-3直接與HBV3.5-kb轉(zhuǎn)錄物結(jié)合(HBV基因組2 125～2 145位)，抑制HBsAg、HBeAg和乙型肝炎核心蛋白(HBc)的表達(dá)，減弱HBV的復(fù)制，可避免對肝細(xì)胞的損害[21]。外泌體源性的miRNA在HBV感染時傳遞細(xì)胞信號，并且可調(diào)控HBV-DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄，在HBV感染中發(fā)揮了重要的作用。

3 外泌體與肝纖維化

肝纖維化是一個動態(tài)過程，由病毒性肝炎及其他肝損傷引起，其發(fā)生機制復(fù)雜，最終導(dǎo)致失代償期肝臟疾病和終末期肝臟疾病。肝星狀細(xì)胞(HSC)是肝臟合成細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞群，當(dāng)肝臟發(fā)生炎癥或受到損傷時，HSC被激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，引起肝纖維化；HSC通過分泌作用對肝損傷作出反應(yīng)，形成纖維瘢痕組織的膠原，而阻斷HSC活化，可抑制肝纖維化的發(fā)生。外泌體在肝纖維化過程中的作用，取決于它們?nèi)绾握{(diào)控信號通路，是激活還是阻斷HSC的活化。

3.1外泌體源性的miRNA在肝纖維化中的作用 miR-122被認(rèn)為是肝臟特異性的miRNA，由肝臟分泌的miR-122被外泌體包裹轉(zhuǎn)移至單核細(xì)胞，通過影響其靶標(biāo)抗氧化蛋白血紅素氧合酶-1(HO-1)和脂多糖(LPS)，增強單核細(xì)胞炎性反應(yīng)，造成肝損傷[22]。CHB患者血清miR-122水平顯著高于健康人群，而肝纖維化晚期患者的miR-122水平降低，肝組織炎癥活性較低[23]，說明miR-122可反映肝臟受炎癥損傷的程度。近期研究發(fā)現(xiàn)，外泌體參與HSC的活化過程，人或小鼠HSC分泌的外泌體miR-214是HSC中結(jié)締組織生長因子2(CCN2)依賴性肝纖維化發(fā)生的調(diào)節(jié)因子[24]，外泌體miR-214的減少主要在肝纖維化的初始階段，并使CCN2在纖維化的肝臟中表達(dá)上調(diào)，通過HSC轉(zhuǎn)移至相鄰細(xì)胞而促進(jìn)肝纖維化的形成[25]。而間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體miR-181-5p通過直接靶向Bcl-2和Stat3，減弱該基因表達(dá)，抑制HSC的活化，減少肝纖維化的發(fā)生[26]。同樣，間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體miR-125b通過抑制Hh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，減少肝纖維化，有助于肝細(xì)胞再生[27]。此外，與肝纖維化形成有關(guān)的miRNA還包括：miR-181b、miR-125a-5p、miR-21、miR-27、miR-221、miR-222(以上miRNA促進(jìn)肝纖維化的形成)，miR-15b、miR-16、miR-29、miR-133a、miR-148a、miR-195、miR-378a(以上miRNA抑制肝纖維化的形成)[28]。文獻(xiàn)[29]報道血清miR-181b和miR-106b聯(lián)合檢測診斷肝纖維化，尤其是早期肝纖維化，具有重大的臨床價值。肝纖維化患者血清miR-125a-5p水平增高，其表達(dá)量與HBV-DNA和透明質(zhì)酸、層粘連蛋白、Ⅲ型前膠原、Ⅳ型膠原等肝纖維化標(biāo)志物的表達(dá)量呈正相關(guān)，而HCC患者血清miR-125a-5p水平降低[30]。miRNA被外泌體包裹轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞內(nèi)，介導(dǎo)肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展，評估m(xù)iRNA表達(dá)水平的變化有助于肝臟炎癥損傷、纖維化及腫瘤疾病的監(jiān)測。

3.2外泌體源性的lncRNA在肝纖維化中的作用 除了miRNA，lncRNA同樣參與了肝纖維化的形成。有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠肝纖維化模型中肝組織分泌的lncR-p21表達(dá)顯著降低。因為lncR-p21通過增強p21的表達(dá)阻礙原代HSC的細(xì)胞周期進(jìn)程和增殖，抑制肝纖維化的形成；該研究還發(fā)現(xiàn)與健康受試者相比，肝硬化患者，尤其是肝硬化失代償期患者血清lncR-p21水平同樣顯著降低[31]。ZHANG等[32]發(fā)現(xiàn)一種富含于肝臟的lncRNA——肝纖維化相關(guān)lncRNA1(lnc-LFAR1)，可通過激活轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)和Notch信號增強HSC的活化而促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展。lncRNA參與調(diào)控HSC的活化、增殖和凋亡，是肝纖維化研究的新熱點，而外泌體源性的lncRNA在肝纖維化中的作用還需進(jìn)一步探討。

4 外泌體與HCC

國內(nèi)HCC患者HBV感染率高達(dá)80%，有研究表明，外泌體在腫瘤生物學(xué)中發(fā)揮著重要的作用，HCC細(xì)胞分泌的外泌體影響局部腫瘤微環(huán)境，并且通過轉(zhuǎn)移癌蛋白和核酸參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移[33-34]。

4.1外泌體源性的miRNA在HCC中的作用 在HBV感染患者的HCC細(xì)胞中，研究者發(fā)現(xiàn)了一種HBV編碼的miRNA，其被外泌體和HBV核心顆粒釋放到循環(huán)中參與HCC的發(fā)生、發(fā)展。通過觀察20例HBV陽性HCC患者和3例HBV陰性HCC患者中miR-3的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)肝組織來源的miR-3在HBV陽性HCC細(xì)胞中高表達(dá)，而在HBV陰性HCC細(xì)胞中不表達(dá)[21]，提示miR-3很可能是HBV感染患者肝組織分泌的特異性miRNA。巨噬細(xì)胞分泌的外泌體miR-142、miR-223被巨噬細(xì)胞以細(xì)胞接觸依賴性方式轉(zhuǎn)移到HCC細(xì)胞，從而影響HCC細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)以及內(nèi)源性表達(dá)的stathmin-1和胰島素樣生長因子-1受體，進(jìn)而在功能上抑制HCC細(xì)胞的增殖[35]。有研究發(fā)現(xiàn)在二乙基亞硝胺誘導(dǎo)的HCC大鼠模型中，肝組織及血液樣品中miR-21隨著肝臟炎癥損害的加重而增高，聯(lián)合檢測miR-21、miR-10b和甲胎蛋白(AFP)有望成為早期診斷HCC的生物學(xué)標(biāo)志物[36]。同樣，TIAN等[37]發(fā)現(xiàn)外泌體miR-21和miR-10b可促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，血清外泌體miR-21和miR-10b水平與HCC分期和低氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α、HIF-2α的表達(dá)相關(guān)，并且是HCC患者生存的獨立預(yù)測因素。關(guān)于外泌體miRNA對HCC診斷及預(yù)后價值的相關(guān)報道還包括：血清外泌體miR-221、miR-191、miR-181a、miR-26a可早期診斷HCC[38]，miR-125b[39]、miR-638[40]、miR-665[41]可評估HCC患者的預(yù)后。這些研究有助于HCC患者的早期診斷及預(yù)后評估，同時miRNA在腫瘤中的通訊和轉(zhuǎn)移也可能是腫瘤細(xì)胞免疫防御的新機制。

4.2外泌體源性的lncRNA在HCC中的作用 有研究報道，來自癌癥患者的外泌體lncRNA也可能成為新的腫瘤生物標(biāo)志物[42]，甚至有望成為HCC診斷及療效判斷的指標(biāo)[43]。部分lncRNA在HCC細(xì)胞來源的外泌體內(nèi)富集，如lncR Unigene56159在HBV相關(guān)的HCC組織中顯著上調(diào)，lncR Unigene56159可以直接與miR-140-5p結(jié)合，并有效地作為miR-140-5p的競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA)去抑制靶基因Slug的表達(dá)，而促進(jìn)HCC細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)化[44]。CD90陽性HCC細(xì)胞通過分泌外泌體lncR H19作用于內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤血管生成，增強鄰近HCC細(xì)胞的增殖和侵襲能力，在HCC的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用[45]。LEE等[46]分析了HCC組織和匹配的正常肝臟組織的臨床標(biāo)本，通過檢測組織及血清外泌體中l(wèi)ncRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)lncR ATB在HCC中顯著上調(diào)，而lncR MEG3在HCC中下調(diào)，并且lncR ATB的表達(dá)與HCC患者的腫瘤大小和不良預(yù)后顯著相關(guān)。外泌體源性的lncRNA不僅影響HCC的發(fā)生和發(fā)展，還有助于評估腫瘤患者的預(yù)后。

5 小 結(jié)

綜上所述，外泌體參與了HBV感染所致的肝炎、肝纖維化，HCC的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸，評估外泌體源性的病毒感染標(biāo)志物，以及相關(guān)miRNA、lncRNA等的表達(dá)，可為HBV感染相關(guān)肝臟疾病的診療選擇新的生物學(xué)標(biāo)志物，同時外泌體也為HBV感染相關(guān)肝臟疾病的發(fā)生機制提供了新的研究視角。

目前有關(guān)外泌體與肝臟疾病的研究尚處于初期階段，還需大量的臨床標(biāo)本以及循證醫(yī)學(xué)進(jìn)一步驗證。外泌體還可作為化療佐劑、免疫療法載體，本文雖未詳述，但這也是臨床診療所關(guān)注的重點。而外泌體源性miRNA、lncRNA、蛋白質(zhì)所介導(dǎo)細(xì)胞間的信號通路、激活機體的免疫應(yīng)答機制以及作為治療的有效載體仍是今后研究的方向。