超導(dǎo)量點—免疫熒光法快速測定糧食中黃曲霉毒素B1的方法驗證

胡元斌 許艷霞 王達能 馬 志 倪小英 唐顏蘋 余 楊

(1. 湖南省糧油產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測中心，湖南 長沙 410201；2. 深圳賽泰諾科技股份有限公司，廣東 深圳 518000)

黃曲霉毒素B1是已知的化學(xué)物質(zhì)中致癌性最強的一種，主要誘發(fā)肝癌，對人和動物均具有極強的危害性。食物黃曲霉毒素B1污染比較常見，花生、玉米、稻谷、小麥、花生油等糧油食品都極易受到污染，且以南方高溫、高濕地區(qū)受污染最為嚴重[1]。

黃曲霉毒素B1的檢測方法主要有儀器檢測法[2-5]和免疫學(xué)檢測法[6-8]。儀器檢測法有高效液相色譜法、同位素稀釋液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法、薄層色譜法、毛細管電泳法，其中高效液相色譜法是目前實驗室應(yīng)用最廣泛的方法[9-10]。儀器檢測法特異性強、準確度高，但對操作人員技術(shù)要求高，前處理繁瑣，難以實現(xiàn)大批量樣品檢測，且無法滿足及時高效的市場監(jiān)管需求。免疫學(xué)檢測法主要是利用抗原抗體的特異性免疫反應(yīng)對樣品中的抗原或抗體進行定量、定性或定位檢測，屬于快速檢測方法，與儀器檢測法相比，該方法具有設(shè)備小巧、檢測速度快、成本低等優(yōu)點，在市場監(jiān)管中具有廣泛的應(yīng)用，且適合大批量樣品的檢測。

根據(jù)標記物的不同，黃曲霉毒素B1免疫學(xué)檢測法有酶聯(lián)免疫法[11]、膠體金法[12]、時間分辨熒光法、熒光微球法、量子點法[13]等。量子點是一種準零維的納米材料，具有激發(fā)光譜寬，發(fā)射光譜窄，熒光壽命長，斯托克位移大，熒光強度大，且可通過粒徑控制熒光波長及強度等特點，是一種理想的熒光標記物，在生物成像、免疫檢測等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[14]。

研究擬以超導(dǎo)量子點為熒光標記物，利用超導(dǎo)量點優(yōu)越的熒光性能，結(jié)合免疫熒光技術(shù)，建立一種靈敏、準確的糧食黃曲霉毒素B1的快速檢測方法，并對該方法的準確性、重復(fù)性和臺間差等參數(shù)進行驗證，旨在考察該方法在糧食黃曲霉毒素B1的快速檢測的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

黃曲霉毒素B1快速定量檢測卡：深圳市賽泰諾生物技術(shù)有限公司；

ST稀釋液：深圳市賽泰諾生物技術(shù)有限公司；

黃曲霉毒素B1酶聯(lián)免疫檢測試劑盒：北京華安麥科生物技術(shù)有限公司；

黃曲霉毒素B1免疫親和柱：北京中檢維康生物技術(shù)有限公司；

甲醇：色譜純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

色譜柱：RBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)，美國Agilent公司；

糙米、玉米樣品：湖南家潤多超市。

1.1.2 儀器

免疫熒光快速定量檢測系統(tǒng)：QD-Infinity型，深圳市賽泰諾生物技術(shù)有限公司；

酶標儀：rayto RT-6000型，深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司；

液相色譜儀：Agilent 1100型，安捷倫科技有限公司。

1.2 樣品檢測

1.2.1 樣品預(yù)處理 稻谷樣品脫殼后粉碎至全部過20目篩，小麥和玉米直接粉碎至全部過20目篩，稱取過篩樣品5 g置容器中(如50 mL離心管)，加入60%甲醇溶液25 mL，混勻，置搖床震蕩10 min，選擇4 000×g離心5 min，取上清液備用。

1.2.2 超導(dǎo)量點—免疫熒光法快速法 取經(jīng)預(yù)處理的樣品上清液100 μL與ST緩沖液500 μL震蕩混勻，得待檢液1，取75 μL待檢液1垂直緩慢滴入檢測卡的加樣孔，孵育15 min后，選擇“快速檢測”模式，當(dāng)出現(xiàn)請插入檢測卡提示時，立即將檢測卡插入QD-Infinity快速免疫熒光分析儀，儀器自動根據(jù)檢測卡上的二維碼讀取產(chǎn)品信息并進行檢測，13 s儀器顯示檢測結(jié)果，檢測完畢。

1.2.3 酶聯(lián)免疫法 取經(jīng)預(yù)處理的樣品上清液，按照AFB1酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的檢測方法進行測試。

1.2.4 高效液相色譜法

(1) 上樣液制備：取經(jīng)預(yù)處理的樣品上層清液10 mL，加入20 mL蒸餾水稀釋于50 mL離心管中，渦旋混勻，再用微纖維濾紙過濾，并收集濾液作為上樣液。

(2) 凈化：免疫親和柱平衡后，將柱上面連接25 mL一次性注射器，準確移取15 mL上樣液，調(diào)節(jié)開關(guān)，使液體以1～2 d/s的速度流出；待液體排干后，用去離子水洗滌2次，每次10 mL；待液體排干后，上樣1 mL甲醇，流速1 d/s，收集洗脫液，用水稀釋定量至2 mL，最后用0.22 μm 微孔濾器過濾后轉(zhuǎn)移至樣品瓶采用柱后光化學(xué)衍生高效液相色譜法測量。

(3) 色譜條件：選擇ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)；流動相A為水，B為甲醇，C為乙腈；等度洗脫(58% A+20% B+22% C)；流速1.2 mL/min；柱溫30 ℃；進樣體積100 μL；激發(fā)波長360 nm；發(fā)射波長440 nm；柱后光化學(xué)衍生器。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用Excel 2010和SPSS 22.0處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 準確性

2.1.1 與酶聯(lián)免疫法比較 酶聯(lián)免疫法是當(dāng)前應(yīng)用較多的黃曲霉毒素B1的快速檢測方法，也是國標(GB 5009.22—2016第四法)規(guī)定方法。隨機選取43份不同黃曲霉毒素B1的樣品，分別采用超導(dǎo)量點—免疫熒光法快速法和酶聯(lián)免疫法測定，將兩種測定方法的結(jié)果進行配對t檢驗、相關(guān)分析和方差分析，見表1。

由表1可知，43份樣品的超導(dǎo)量點—免疫熒光法快速法和酶聯(lián)免疫法檢測結(jié)果平均值分別為10.84，11.47 μg/kg，兩種方法配對檢驗t值為1.002，而在95%的置信度下，t分布的雙邊臨界t值為2.326，因此，兩種方法的檢測結(jié)果之間無顯著性差異。

分別采用偏相關(guān)和距離分析分析了超導(dǎo)量點—免疫熒光法快速法和酶聯(lián)免疫法相關(guān)性(見表2)，偏相關(guān)結(jié)果表明，兩種方法檢測結(jié)果間的Pearson相關(guān)系數(shù)為0.965，表明兩種方法在0.01水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)。距離分析結(jié)果也表明兩種方法的Pearson相關(guān)系數(shù)為0.965，表明兩種方法的結(jié)果為相似矩陣。

表1 超導(dǎo)量點—免疫熒光法快速法與酶聯(lián)免疫法t檢驗表Table 1 The t-test results of QD-Infinity and ELISA

表2 超導(dǎo)量點—免疫熒光法快速法與酶聯(lián)免疫法偏相關(guān)分析?Table 2 The partial correlation analysis of QD-Infinity and ELISA (n=43)

? **. 在0.01水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)。

對超導(dǎo)量點—免疫熒光法快速法和酶聯(lián)免疫法的檢測結(jié)果之間進行了線性相關(guān)擬合，結(jié)果表明，兩種方法檢測結(jié)果線性相關(guān)系數(shù)R2=0.930 6，線性方程斜率為0.906，與1接近。說明超導(dǎo)量點—免疫熒光法快速法和酶聯(lián)免疫法的檢測結(jié)果非常接近，無顯著性差異。

假定方差齊性，采用S-N-K(s)比較方法，比較了兩種檢測方法結(jié)果之間的差異，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，兩組結(jié)果的F值為0.003，顯著性為0.957，遠大于0.05，表明兩組結(jié)果無顯著性差異。

2.1.2 與高效液相色譜法比較 高效液相色譜法是黃曲霉毒素B1檢測的經(jīng)典方法。隨機選取25份不同黃曲霉毒素B1的樣品，分別采用超導(dǎo)量點—免疫熒光法快速法和高效液相色譜法測定，將兩種測定方法的結(jié)果進行配對t檢驗、相關(guān)分析和方差分析，見表4。

圖1 超導(dǎo)量點—免疫熒光法快速法與酶聯(lián)免疫法相關(guān)性Figure 1 The correlation of QD-Infinity and ELISA

表3 超導(dǎo)量點—免疫熒光法快速法與酶聯(lián)免疫法方差分析Table 3 The variance analysis of QD-Infinity and ELISA

表4 超導(dǎo)量點—免疫熒光法快速法與高效液相色譜法t檢驗表Table 4 The t-test results of QD-Infinity and HPLC

由表4可知，25份樣品的超導(dǎo)量點—免疫熒光法快速法和高效液相色譜法檢測結(jié)果平均值分別為272.91，283.90 μg/kg，兩種方法配對檢驗t值為0.849，而在95%的置信度下，t分布的雙邊臨界t值為2.391，因此，兩種方法的檢測結(jié)果之間無顯著性差異。

分別采用偏相關(guān)和距離分析分析了超導(dǎo)量點—免疫熒光法快速法和高效液相色譜法相關(guān)性(見表5)，偏相關(guān)結(jié)果表明，兩種方法檢測結(jié)果間的Pearson相關(guān)系數(shù)為0.990，表明兩種方法在0.01水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)。距離分析結(jié)果也表明兩種方法的Pearson相關(guān)系數(shù)為0.990，表明兩種方法的結(jié)果為相似矩陣。

對超導(dǎo)量點—免疫熒光法快速法和酶聯(lián)免疫法的檢測結(jié)果之間進行了線性相關(guān)擬合，結(jié)果表明，兩種方法檢測結(jié)果線性相關(guān)系數(shù)R2=0.980 8，線性方程斜率為1.089 9，與1接近，說明兩種方法的檢測結(jié)果非常接近，無顯著性差異。

假定方差齊性，采用S-N-K(s)比較方法，比較了超導(dǎo)量點免疫熒光法和高效液相色譜法兩種檢測方法結(jié)果之間的差異，結(jié)果見表6。結(jié)果表明，兩組結(jié)果的F值為0.010，顯著性為0.920，遠大于0.05，表明兩組結(jié)果無顯著性差異。

表5 超導(dǎo)量點—免疫熒光法快速法與高效液相色譜法偏相關(guān)分析?Table 5 The partial correlation analysis of QD-Infinity and HPLC (n=25)

? **. 在0.01水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)。

2.2 重復(fù)性

隨機選取1個樣品，采用超導(dǎo)量點—免疫熒光法重復(fù)測定6次，結(jié)果分別為7.10，7.33，7.44，6.59，6.69，6.36 μg/kg，平均值為6.92 μg/kg，相對標準偏差為6.29%(低于10%)，表明該方法具有較好的重復(fù)性。

圖2 超導(dǎo)量點—免疫熒光法快速法與高效液相色譜法相關(guān)性Figure 2 The correlation of QD-Infinity and HPLC

表6 超導(dǎo)量點—免疫熒光法快速法與高效液相色譜法方差分析Table 6 The variance analysis of QD-Infinity and HPLC

2.3 穩(wěn)定性

隨機選取3個不同濃度梯度(編號為a、b、c，對應(yīng)濃度分別為3.72，23.31，9.95 μg/kg)的樣品，采用超導(dǎo)量點—免疫熒光法快速法，每份樣品分別孵育15，16，18，20 min 后，進行測定，考察孵育時間對檢測結(jié)果的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可看出，隨著孵育時間的增長，測定結(jié)果逐漸升高。與15 min相比，a、b、c 3個樣品孵育20 min 后，檢測結(jié)果分別升高15.9%，17.8%，18.9%。

2.4 臺間差

在隨機兩臺QD-Infinity免疫熒光快速定量檢測系統(tǒng)上對3個不同濃度梯度的樣品(樣品編號分別為1、2、3，濃度分別為5.1，20.4，37.1 μg/kg)進行檢測，每個樣本平行檢測6次，測定結(jié)果采用配對t檢驗來比較2臺儀器間是否存在顯著性差異，經(jīng)計算t=0.393，t0.025,17=2.458，t

圖3 超導(dǎo)量點—免疫熒光法孵育時間的影響Figure 3 The influence of time for the results of QD-Infinity

表7 超導(dǎo)量點—免疫熒光法臺間差結(jié)果Table 7 The differents equipments QD-Infinity

3 結(jié)論

超導(dǎo)量點—免疫熒光法是一種以超導(dǎo)量子點為熒光探針的免疫分析方法，具有靈敏、準確、快速等優(yōu)點。通過與高效液相色譜法及酶聯(lián)免疫吸附法比較，該方法測定糧食中的黃曲霉毒素B1具有較高的準確性和符合國標(GB 5009.22—2016)要求的精密度，任意兩臺儀器間的檢測解結(jié)果也無顯著性差異。該方法檢測結(jié)果與孵育時間密切相關(guān)，隨著孵育時間的延長，檢測結(jié)果逐漸上升，因此，在使用過程中應(yīng)嚴格控制孵育時間。超導(dǎo)量點—免疫熒光法測定糧食中黃曲霉毒素B1準確、高效，具有較高的應(yīng)用前景。