植酸酶及其應(yīng)用前景(綜述)(續(xù)2)

張相鑫 譯自Applied Biochemistry and Microbiology，Vol.54(2018)，№4：352～360

唐彩琰 校

4 獲得高科技的新型植酸酶

開發(fā)新型高效植酸酶制劑的主要要求與它們的活性有關(guān)，包括較寬的有效pH范圍、熱穩(wěn)定和耐蛋白酶水解等。因此，有人認為應(yīng)從能在極端條件下生存的生物中尋找新的植酸酶生產(chǎn)者，或基因修飾先前研究過的能夠生產(chǎn)植酸酶的生物，以便改善植酸酶的特性。在研究了生長在火山、溫泉和沙漠地區(qū)的微生物所生產(chǎn)的植酸酶后，研究人員發(fā)現(xiàn)了新的熱穩(wěn)定性植酸酶。芽孢桿菌ZJ0702株和醫(yī)學(xué)環(huán)狀桿菌分泌的植酸酶熱穩(wěn)定性最高，這些酶可在90 ℃～100 ℃的環(huán)境中保持活性。從喜馬拉雅地區(qū)土壤中分離到的草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)EUFR-3株生產(chǎn)的植酸酶具有較高的活性，可在較寬的pH(pH3～8)范圍下保持穩(wěn)定，并在pH為7.0和溫度為40 ℃時表現(xiàn)出最大的活性。這些特性使草酸青霉菌EUFR-3株生產(chǎn)的植酸酶在食品工業(yè)中有廣泛的應(yīng)用前景。

利用宏基因組測序技術(shù)分析從不同生態(tài)系統(tǒng)中分離到的植酸酶的序列以及它們在大腸桿菌中的表達情況，使獲得具有不同最適pH范圍的熱穩(wěn)定性植酸酶成為可能。這些植酸酶有望在動物生產(chǎn)中得到應(yīng)用。

黑曲霉菌和煙曲霉菌生產(chǎn)的PhyA植酸酶最早得到廣泛研究，是可用于動物生產(chǎn)的植酸酶之一。通過位點特異性誘變替代某些氨基酸，研究人員改善了植酸酶的熱穩(wěn)定性和最佳pH。這些研究還揭示了會影響植酸酶特性的最重要位點。P257氨基酸殘基位于連接芽孢桿菌合成蛋白的兩個β-層的環(huán)上，其會影響這種生理活動的可塑性和該植酸酶的熱穩(wěn)定性。這種效應(yīng)與其他氫鍵的形成以及該環(huán)表面的P257氨基酸殘基有關(guān)。利用位點特異性誘變在分離自槌狀顆粒菌的植酸酶的催化中心附近增加4個新的二硫鍵，可提高該植酸酶的熱穩(wěn)定性，且不會影響酶的活性。

研究人員在黑曲霉菌中表達了煙曲霉菌的PhyA基因，從而獲得了第一個重組植酸酶。該重組植酸酶具有較高的熱穩(wěn)定性，且可在較寬的pH范圍內(nèi)保持活性。長期以來，人們一直用大腸桿菌培養(yǎng)物獲得包括植酸酶在內(nèi)的重組蛋白。胞外蛋白質(zhì)的表達可以防止蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)聚集，免受宿主蛋白酶的水解，從而提高蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。研究人員利用大腸桿菌培養(yǎng)物獲得了芽孢桿菌MD2株的胞外熱穩(wěn)定性植酸酶，表明培養(yǎng)條件會顯著影響植酸酶的產(chǎn)量。在氯化鈣存在的條件下，重組植酸酶的活性顯著提高。研究表明，地衣芽孢桿菌PB-13株的植酸酶基因在大腸桿菌BL21株中表達后獲得的重組植酸酶rPhyB13 BBP在pH為4～8和溫度為80 ℃的環(huán)境中仍有活性，且可抵抗胰蛋白酶的水解。

試驗表明，選擇的宿主會影響重組酶的產(chǎn)量和特性。例如，研究表明，如果將真菌細胞用作重組植酸酶的生產(chǎn)者，可以提高蛋白質(zhì)的糖基化水平。大腸桿菌appA植酸酶基因在巴斯德畢赤酵母菌中表達后可生產(chǎn)大量的重組蛋白，而通過替代對應(yīng)的核苷酸進行N-糖基化位點靶向修飾獲得不同糖基化水平的AppA植酸酶。在蛋白質(zhì)糖基化水平較高的三個突變體中，只有一個突變體被證明具有較高的熱穩(wěn)定性和植酸親和力。此外，對由該突變體合成的植酸酶晶體結(jié)構(gòu)進行研究后發(fā)現(xiàn)，該植酸的催化活性和熱穩(wěn)定性與該蛋白α-結(jié)構(gòu)域的可塑性變化有關(guān)。

枯草芽孢桿菌植酸酶基因在巴斯德畢赤酵母菌中的表達會提高所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的糖基化水平和熱穩(wěn)定性，而該植酸酶最適宜的pH范圍和溫度沒有改變。組氨酸酸性磷酸酶(Histidine Acidic Phosphatase，HAP)糖基化會提高酶在酸性條件下的穩(wěn)定性，并可保護蛋白質(zhì)免受胃蛋白酶的水解。為了獲得志賀氏菌CD2株的重組植酸酶，研究人員用巴斯德畢赤酵母代替大腸桿菌使得酶的熱穩(wěn)定性提高。嗜熱側(cè)孢霉菌的植酸酶基因在巴斯德畢赤酵母菌中的表達可明顯提高目標產(chǎn)物的產(chǎn)量。在巴斯德畢赤酵母菌甘油醛-3-磷酸(Glyceraldehyde-3-Phosphate，GAP)脫氫酶的組成型啟動子中導(dǎo)入一個密碼子，可使重組嗜熱側(cè)孢霉菌胞外rStPhy植酸酶的產(chǎn)量提高40倍以上。GAP的使用使研究人員能夠消除甲醇誘導(dǎo)的弊端。

提高植酸酶效率的另一種方法是將該酶固定在殼聚糖、修飾型ZnO或Fe3O4的納米顆粒表面。應(yīng)用這種方法可提高植酸酶的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性，也可對金屬離子產(chǎn)生抗性。將大腸桿菌的植酸酶吸附在發(fā)酵芽孢桿菌孢子表面，也可提高植酸酶的熱穩(wěn)定性。

5 植酸酶的工業(yè)應(yīng)用

工業(yè)化生產(chǎn)的植酸酶被廣泛用于家禽、豬和水產(chǎn)動物的養(yǎng)殖。在飼料中添加植酸酶可提高動物對磷和蛋白質(zhì)的吸收率，促進動物的能量代謝，同時可減少動物對磷酸鹽添加劑的需求量，從而可改善生態(tài)條件。

人類自1991年起開始對植酸酶進行工業(yè)化生產(chǎn)，當(dāng)時德國巴斯夫(BASF)公司研發(fā)出利用黑曲霉菌生產(chǎn)植酸酶的方法。目前，植酸酶制劑主要由數(shù)十家公司生產(chǎn)，除巴斯夫公司外，還有美國的杜邦公司和諾偉思國際公司、丹麥的丹尼斯克動物營養(yǎng)公司和諾維信公司、英國的英聯(lián)食品公司、保加利亞的浩衛(wèi)制藥公司以及印度的高端酶技術(shù)公司等。

已進行商品化推廣應(yīng)用的植酸酶制劑主要是3-植酸酶和6-植酸酶。3-植酸酶來源于真菌(曲霉屬和青霉屬等)，6-植酸酶來源于細菌[大腸桿菌(E. coli)和布氏檸檬酸桿菌等]。用于畜禽生產(chǎn)的商用6-植酸酶制劑于2003年上市，研究證明該植酸酶具有更強的水解植酸的能力。這些植酸酶的優(yōu)點是它們在動物胃腸道的酸性和堿性環(huán)境中都具有活性、熱穩(wěn)定性和對蛋白酶的抗性。

與真菌源性植酸酶相比，使用細菌源性植酸酶可以提高動物的生產(chǎn)力，并使動物產(chǎn)品的主要生產(chǎn)成本降低20%。丹麥丹尼斯克公司的Fayzym植酸酶、保加利亞浩衛(wèi)制藥公司的Khostazym植酸酶和荷蘭帝斯曼公司的Rhonozym植酸酶等植酸酶產(chǎn)品都是6-植酸酶。2013年，美國市場上出現(xiàn)了以布丘菌屬(腸桿菌科)的細菌為代表生產(chǎn)的植酸酶。這些植酸酶制劑在pH較低的環(huán)境中仍有活性。植酸酶制劑對飼料中植酸的水解效果和所需劑量取決于飼料的組成和植酸酶制劑的生產(chǎn)工藝。飼料含高水平的鈣可能會顯著降低植酸酶對植酸的水解效果。

植酸酶在美國和西歐各國已得到廣泛的應(yīng)用，這些國家的應(yīng)用方法被認為是植酸酶的行業(yè)標準。近年來，植酸酶在中國、印度和東南亞地區(qū)被越來越多地用作飼料添加劑。在俄羅斯，植酸酶制劑的使用還不是特別普遍。然而，畜禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展、經(jīng)濟上的可行性以及生態(tài)保護力度的加強都刺激著植酸酶的推廣應(yīng)用。在俄羅斯，只有69種含植酸酶的飼料添加劑被批準用于動物生產(chǎn)。這些飼料添加劑主要由歐洲制造商提供，如德國巴斯夫公司推出的11種商標名為Natufos的植酸酶產(chǎn)品，丹麥諾維信公司上市的6種商標名為Rhonozym的植酸酶產(chǎn)品，保加利亞標偉特公司提供的10種商標名分別為Kormofit、Khostazym和Optyfos的植酸酶產(chǎn)品。美國、中國和印度分別向俄羅斯推出了2種、10種和 10種植酸酶產(chǎn)品。

Natufos植酸酶制劑含有來自黑曲霉菌的未經(jīng)基因修飾的植酸酶。Rhonozym HaiFos植酸酶制劑是丹麥諾維信公司利用布氏檸檬酸桿菌生產(chǎn)的，天然活性為10 000 U/g，能承受95 ℃的高溫。武漢新華揚生物有限公司利用細菌植酸酶生產(chǎn)了成本低的植酸酶制劑Sunfize，該酶制劑已被俄羅斯多家家禽養(yǎng)殖場如Sverdlovskaya雞場和Ravis Sosnovskaya雞場(斯維爾德洛夫斯克地區(qū))使用。

目前，俄羅斯Agroferment公司生產(chǎn)的Agrofit植酸酶正被用作飼料添加劑加入家禽、豬和魚的飼料中。該植酸酶由沒有經(jīng)過基因修飾的灰青霉菌PhPl-33 BKM F-3867 D株生產(chǎn)。研究表明，Agrofit植酸酶在pH 2.5～7.0范圍內(nèi)有活性，其被制成干燥的顆粒狀制劑后，在90 ℃下加熱5 min仍有活性。Agrofit植酸酶的活性為5 000 U/g，與其他國家同類產(chǎn)品的活性相當(dāng)。Agroferment公司還生產(chǎn)Agroxyl酶制劑和Agrocell酶制劑，這些酶制劑除含有植酸酶外，還含有其他酶，如β-葡聚糖酶、蛋白酶、木聚糖酶和纖維素酶等。

飼料去植酸化也可以通過在飼料中添加產(chǎn)植酸酶的非致病性菌株來實現(xiàn)。農(nóng)業(yè)廢棄物和工業(yè)廢料經(jīng)微生物發(fā)酵后植酸的含量會減少，無機磷酸鹽的濃度會提高，從而可以提高它們在動物營養(yǎng)中的價值。研究發(fā)現(xiàn)，從芝麻根際部分離到的克氏檸檬酸桿菌PM-7株能有效水解小麥幼苗、麥麩、米麩、甘蔗渣、棉籽殼、芝麻粉、芥末粉以及椰肉中的植酸。將用小麥粉、芝麻粉餅和豆奶培養(yǎng)的嗜熱鏈球菌TLR50株用于家禽養(yǎng)殖，可提高飼料的無機磷酸鹽、蛋白質(zhì)和糖的含量，降低植酸的濃度。

通過培育出能夠在唾液腺中表達大腸桿菌植酸酶基因(appA基因)的轉(zhuǎn)基因動物，可實現(xiàn)提高植物植酸中磷的吸收率的目的。對小鼠和豬的試驗表明，激活轉(zhuǎn)基因動物唾液中的植酸酶，可促進動物對飼料中植酸的吸收，減少動物的磷排放量。另一種可以向動物提供磷酸鹽的方法是利用微生物的植酸酶基因獲得轉(zhuǎn)基因植物。高活性植酸酶可幫助轉(zhuǎn)基因植物吸收積累在土壤中的植酸。此外，飼用谷物中的高活性植酸酶可導(dǎo)致谷物中的植酸儲備量減少。將這些植物用作動物飼料的原料，可促進動物對飼料中植酸磷的吸收。

利用真菌和細菌的植酸酶基因可培育出轉(zhuǎn)基因植物。表達PhyA基因或appA基因的歐洲油菜可在只有植酸鹽作為唯一磷源的條件下生長，能夠提供較高的生物產(chǎn)量，同時還會提高種子中植酸酶的活性，降低植酸的濃度。為了找出含有高活性植酸酶的植物，研究人員還對煙草、大豆、小麥、甘薯和油菜進行了試驗。結(jié)果表明，這些轉(zhuǎn)基因植物在生長期間以植酸鹽為磷源，能將胞外植酸酶分泌到植物的根際部。轉(zhuǎn)基因植物根際部釋放出的胞外植酸酶會提高可供植物利用的磷的水平，也為鄰近的植物創(chuàng)造了有利的生長條件。值得注意的是，植物在實驗室無菌土壤中表達植酸酶基因所產(chǎn)生的影響要比其在自然環(huán)境的更顯著。這顯然是植酸酶被排放到環(huán)境后迅速喪失活性造成的。

下調(diào)控制植酸合成最后階段的基因會降低轉(zhuǎn)基因水稻中植酸的濃度，同時提高無機磷酸鹽的含量。該突變不會影響種子的生長或發(fā)芽。

為了降低土壤中不易被植物吸收的植酸的水平，相關(guān)研究人員正在利用細菌植酸酶或含有高活性植酸酶的微生物(生物肥料)開發(fā)其他方法。為了實現(xiàn)這一目標，需要篩選出合適的土壤微生物作為生物肥料。

植酸酶也可用于工業(yè)和農(nóng)業(yè)的其他領(lǐng)域。在紙漿和造紙行業(yè)中，將植酸酶用作具有木聚糖酶活性的未純化的或技術(shù)級的酶制劑的組成部分，能夠減少有毒化合物的形成，改善生態(tài)環(huán)境。眾所周知，從化學(xué)結(jié)構(gòu)上來說有機磷殺蟲劑是一類亞磷酸酯，它們的毒性作用與抑制乙酰膽堿酯酶的活性有關(guān)。植酸酶能有效地降解有機磷殺蟲劑，如氯磷、單溴磷和甲基對硫磷。

植酸酶反應(yīng)中形成的植酸衍生物在醫(yī)學(xué)上得到了廣泛的應(yīng)用。肌醇可參與細胞信號傳導(dǎo)。它在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮著重要的作用，可降低糖尿病和腫瘤的發(fā)生風(fēng)險。

植酸酶廣泛應(yīng)用于人類生活的各個領(lǐng)域。當(dāng)前，植酸酶在畜禽和水產(chǎn)動物養(yǎng)殖上的應(yīng)用不僅能產(chǎn)生可觀的經(jīng)濟效益，而且能保護生態(tài)安全。研發(fā)和引進新型植酸酶制劑，可為我們提供有利于生態(tài)安全的農(nóng)業(yè)技術(shù)和工業(yè)技術(shù)。

(續(xù)完)