原花青素提高魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的帕金森模型細(xì)胞活力的研究*

許逸嵐， 徐 煬， 李鴻飛， 沈鑠恒， 阮文麗， 郭曉歡， 趙鏝娜， 韓瑜穎， 張 衡

((紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部， 浙江 紹興 312000)

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是一種常見(jiàn)的與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，目前已成為中老年人健康的“第三殺手”，它主要的病理改變?yōu)榇竽X中黑質(zhì)紋狀體多巴胺神經(jīng)元的進(jìn)行性改變和細(xì)胞內(nèi)路易體的積累，表現(xiàn)為靜止性震顫、肌僵直、運(yùn)動(dòng)遲緩和姿勢(shì)平衡障礙等[1]。目前臨床上使用的藥物為苯海索等抗膽堿藥物、溴隱亭等多巴胺受體激動(dòng)劑以及左旋多巴，然而他們只能緩解臨床癥狀卻不能延緩疾病的進(jìn)程，同時(shí)還存在著許多副作用[2]。因此，只有從PD的具體發(fā)病機(jī)制出發(fā)，才有可能研制出真正延緩PD的進(jìn)程的藥物。王汝歡等[3]人通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，血管性認(rèn)知功能障礙的大鼠海馬區(qū)氧化應(yīng)激水平升高，通過(guò)使用抗炎抗氧化的藥物可使大鼠體內(nèi)的超氧化物歧化酶(SOD)的水平顯著提高，從而改善其認(rèn)知障礙。Wahba等[4]人發(fā)現(xiàn)，納米抗氧化劑GAL@Ce-HAp可以下調(diào)阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease, AD)大鼠腦中的氧化應(yīng)激標(biāo)記物，抑制其海馬中的神經(jīng)元退化。這表明氧化應(yīng)激能夠損傷神經(jīng)細(xì)胞，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，在諸多神經(jīng)退行性疾病的進(jìn)程中起到了重要的介導(dǎo)作用[5]。原花青素(proanthocyanidins，PC)是存在于許多種植物中的天然酚類(lèi)化合物，具有明顯的抗氧化作用[6]。有研究表明，PC對(duì)AD模型大鼠腦組織有一定保護(hù)作用，可以通過(guò)清除氧自由基來(lái)減少脂質(zhì)的過(guò)氧化物反應(yīng)，從而減輕ROS對(duì)腦組織的損傷[7-8]。一項(xiàng)歷時(shí)20年的流行病學(xué)調(diào)查表明，較多攝入富含PC的食物的實(shí)驗(yàn)參與者患PD的概率較低，這可能與PC能夠抑制PD的發(fā)病有一定關(guān)系[9]，但其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步探索。因此本研究選用人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y構(gòu)建PD細(xì)胞模型，通過(guò)觀察原花青素對(duì)魚(yú)藤酮構(gòu)建的PD細(xì)胞模型的氧化應(yīng)激損傷的影響，并探討具體機(jī)制，為PC用于PD的臨床抗氧化治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器有限公司，HF90)，熒光倒置顯微鏡(MODEL IX70-S1F2，日本OLYMPUS公司)，磁力攪拌器(上海志威電器有限公司，85-1)，酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO RAD公司，iMark)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Instruments公司，CytoFLEX)。

1.2 試劑

胎牛血清(Gibco公司)，DMEM 培養(yǎng)基(Hyclone公司)、胰蛋白酶(biosharp公司)，青霉素及鏈霉素(上海吉諾公司)，二甲基亞砜DMSO(碧云天公司)，噻唑藍(lán)溴化四唑(MTT試劑，阿拉丁公司)，活性氧檢測(cè)試劑盒(碧云天公司)，魚(yú)藤酮粉末(上海百舜生物科技有限公司)，原花青素粉末(上海源葉生物科技有限公司)

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y(來(lái)源于浙江大學(xué)孫秉貴教授實(shí)驗(yàn)室)細(xì)胞接種于含有10% 胎牛血清和 1% 雙抗(青霉素 100 000 U/L，鏈霉素 100 000 U/L)的 DMEM培養(yǎng)基中，放入37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)到 80%～90% 后用胰蛋白酶消化傳代至新的培養(yǎng)瓶中。

1.4 PD細(xì)胞模型的構(gòu)建與MTT法細(xì)胞活力檢測(cè)

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液洗滌，經(jīng)胰酶消化后，用含有 10% 胎牛血清和 1% 雙抗的DMEM培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，并將細(xì)胞的密度調(diào)整為1×105cells/ml，分別接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(100 μl/well)，將細(xì)胞置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞過(guò)夜培養(yǎng)至合適密度，分別用溶于終濃度0.1%DMSO中的不同濃度的魚(yú)藤酮(終濃度為1、2.5、5、10 μmol/L)處理細(xì)胞，構(gòu)建PD細(xì)胞模型。每個(gè)濃度分別設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，另設(shè)空白對(duì)照組與DMSO對(duì)照組(加入等量培養(yǎng)液處理細(xì)胞、終濃度0.1%DMSO處理細(xì)胞)，各設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。加藥后24 h時(shí)，向各個(gè)培養(yǎng)孔中加入MTT溶液(5 mg/ml) 10 μl/孔，37℃孵育4 h，棄去上清后，每孔加入150 μl DMSO，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度值(OD)。

1.5 相差顯微鏡觀察細(xì)胞數(shù)量與形態(tài)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞的密度調(diào)整為2×104cells/ml，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(500 μl/well)，將細(xì)胞培養(yǎng)至合適密度后，用溶于0.1% DMSO的濃度為10 μmol/L的魚(yú)藤酮作用于細(xì)胞，另設(shè)對(duì)照組(加入等量培養(yǎng)液處理細(xì)胞)，各設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)處理24 h后，置于IX70-S1F2顯微鏡下觀察，每個(gè)復(fù)孔選定10個(gè)視野觀察區(qū)域(每組共計(jì)40個(gè)區(qū)域，n=40)統(tǒng)計(jì)分析不同組別單個(gè)視野觀察區(qū)域細(xì)胞的平均數(shù)目，用于表征細(xì)胞數(shù)量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞的密度調(diào)整為105cells/ml，分別接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(2 ml/well)，將細(xì)胞培養(yǎng)至合適密度，用濃度為10 μmol/L的魚(yú)藤酮作用于細(xì)胞，另設(shè)對(duì)照組(加入等量培養(yǎng)液處理細(xì)胞)，各設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用胰酶消化細(xì)胞，用移液管將細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液收集至離心管中，1 500 r/min離心4 min，去除上清后加入1 ml預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)，再次離心沉淀細(xì)胞，再次去除上清后，加入1 ml預(yù)冷的70%乙醇，4℃ 固定24 h。固定結(jié)束后，離心沉淀細(xì)胞后去除上清，加入1 ml預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞后，再次離心沉淀細(xì)胞，去除上清，最終加入配制好的碘化丙啶染色液，并于37℃ 細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光孵育30 min。最后，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 原花青素處理與MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞的密度調(diào)整為1×105cells/ml，分別接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(100 μl/well)，將細(xì)胞培養(yǎng)至合適密度后，用溶于0.1%DMSO中濃度為10 μg/ml的原花青素預(yù)孵育SH-SY5Y細(xì)胞4 h后，加入濃度為10 μmol/L的魚(yú)藤酮繼續(xù)處理24 h，此組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，另設(shè)置對(duì)照組(加入等量培養(yǎng)液處理細(xì)胞)，原花青素(原花青素終濃度為10 μg/ml)單獨(dú)處理組，魚(yú)藤酮(魚(yú)藤酮終濃度為10 μmol/L)單獨(dú)處理組，各設(shè)置6個(gè)復(fù)孔處理24 h后，通過(guò)MTT法用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度值(OD)。

1.8 流式檢測(cè)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS變化

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞的密度調(diào)整為105cells/ml，分別接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(2 ml/well)，將細(xì)胞培養(yǎng)至合適密度，用溶于濃度為10 μg/ml的原花青素預(yù)孵育SH-SY5Y細(xì)胞4 h后，加入濃度為10 μmol/L的魚(yú)藤酮繼續(xù)處理24 h，此組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，另設(shè)對(duì)照組(加入等量培養(yǎng)液處理細(xì)胞)，魚(yú)藤酮(終濃度為10 μmol/L)單獨(dú)處理組，各設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，處理24 h后，吸去孔板中培養(yǎng)液，收集細(xì)胞至離心管后，在每管中加入濃度為10 μmol/L的 DCFH-DA探針150 μl，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育20 min后，用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞2次，最后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)處理用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行分析，各組采用單因素方差(one-way ANOVA)分析，并用Newman-Keuls檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，兩組之間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 魚(yú)藤酮抑制SH-SY5Y細(xì)胞活力

MTT法結(jié)果顯示(表1)，與對(duì)照組相比，較低濃度的魚(yú)藤酮對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的活性無(wú)明顯影響，當(dāng)魚(yú)藤酮濃度達(dá)到2.5 μmol/L時(shí)，細(xì)胞的活力明顯受到抑制，魚(yú)藤酮的濃度越高對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞活力的抑制作用越明顯。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇10 μmol/L作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)處理細(xì)胞的魚(yú)藤酮濃度。同時(shí)，與對(duì)照組相比，0.1%DMSO處理組無(wú)明顯差異，表明此濃度下DMSO對(duì)細(xì)胞活力無(wú)影響，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)不再設(shè)置 0.1%DMSO組。

2.2 魚(yú)藤酮使SH-SY5Y細(xì)胞數(shù)量減少

魚(yú)藤酮處理后，置于相差顯微鏡下觀察對(duì)照組與魚(yú)藤酮處理組細(xì)胞，與對(duì)照相比，10 μmol/L魚(yú)藤酮處理組細(xì)胞的數(shù)量大幅度減少(表1，圖1)。

Tab. 1 Effects of different concentrations of rotenone on cell viability

Fig. 1 Effect of rotenone on cell number(uncoulored ×200)

2.3 魚(yú)藤酮對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示(表1，圖2)，與對(duì)照組相比，10 μmol/L魚(yú)藤酮處理組的SH-SY5Y細(xì)胞在G0/G1期比例明顯增加，G2/M期的比例明顯下降, 兩者S期比例無(wú)明顯差別。這表明魚(yú)藤酮能夠抑制SH-SY5Y細(xì)胞的生長(zhǎng)，使其主要停滯于G0/G1期。

Fig. 2 Effect of rotenone on cell cycle

2.4 原花青素對(duì)PD細(xì)胞模型活力的影響

MTT法結(jié)果顯示(表2)，與對(duì)照組相比，原花青素可以明顯提高神經(jīng)細(xì)胞的活力。魚(yú)藤酮處理組細(xì)胞活力相對(duì)于對(duì)照組明顯下降，表明魚(yú)藤酮明顯抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。而SH-SY5Y細(xì)胞預(yù)孵育原花青素后，細(xì)胞活力明顯升高，表明原花青素能夠緩解魚(yú)藤酮造成的細(xì)胞損傷。

2.5 原花青素抑制魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的PD模型細(xì)胞ROS的產(chǎn)生

經(jīng)過(guò)DCFH-DA探針染色后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組ROS的含量(表2，圖3)，與對(duì)照組相比，魚(yú)藤酮單獨(dú)處理組細(xì)胞的ROS含量大幅度增加；與魚(yú)藤酮單獨(dú)處理組相比，預(yù)孵育原花青素組ROS含量明顯下降。

Tab. 2 Proanthocyanidins inhibits the effect of rotenone on cell viability

Fig. 3 Proanthocyanidins inhibits rotenone-induced ROS production

3 討論

帕金森病作為常見(jiàn)的一種神經(jīng)退行性疾病，其致病機(jī)制與線粒體功能障礙、炎癥反應(yīng)、興奮性毒性、蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊等多種因素密切相關(guān)[10]。但目前有許多研究表明， PD的發(fā)生與氧化應(yīng)激存在一定關(guān)系[11-12]。本研究顯示魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的帕金森細(xì)胞模型的ROS含量大幅度上升，細(xì)胞活力和數(shù)量有明顯下降，表明PD患者的神經(jīng)元在一定程度上發(fā)生了凋亡，同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示帕金森細(xì)胞模型的細(xì)胞周期也發(fā)生改變，處于G0/G1期的細(xì)胞比例增加，處于G2/M期的細(xì)胞比例減少，這進(jìn)一步表明ROS的產(chǎn)生在一定程度上會(huì)抑制細(xì)胞增殖，氧化應(yīng)激反應(yīng)可能是PD發(fā)病的一大原因?？赡苁荘D患者體內(nèi)不平衡的氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生了大量ROS，而ROS能夠直接損傷蛋白質(zhì)、 DNA、脂質(zhì)等生物大分子[13-14]，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡和缺失。Huang等人發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)藥物誘導(dǎo)的PD細(xì)胞模型存在細(xì)胞凋亡與ROS水平上調(diào)的現(xiàn)象，且敲除PD相關(guān)基因后，ROS含量明顯下降[15]。Han等人研究表明，氯霉素能夠有效降低PD模型的ROS含量，并且顯著提高了其多巴胺能神經(jīng)元的活力[16]。這些證據(jù)都表明，通過(guò)減少PD發(fā)病過(guò)程中ROS的產(chǎn)生有可能會(huì)減緩PD的發(fā)病進(jìn)程，從而達(dá)到治療PD的目的。

原花青素是一種存在于許多種植物中的天然酚類(lèi)化合物，林琨等人通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，原花青素可以減輕陶瓷磷酸三鈣磨損顆粒誘發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而減少骨溶解[17]。龔頻等人研究發(fā)現(xiàn)，原花青素能夠通過(guò)有效清除自由基，達(dá)到預(yù)防和有效治療糖尿病并發(fā)癥的目的[18]。這些都證明了原花青素有抗炎，抗氧化作用，在諸多方面有其獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值。我們的研究結(jié)果顯示，原花青素能夠提升細(xì)胞活力，同時(shí)有效降低PD細(xì)胞模型中的ROS含量，故我們推測(cè)原花青素可以通過(guò)抑制PD模型細(xì)胞ROS的生成來(lái)延緩疾病的進(jìn)程。然而，由于PD發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性，原花青素是否還通過(guò)其他生物分子或信號(hào)網(wǎng)絡(luò)而對(duì)PD有效，仍需要深入研究。