少年足球運(yùn)動員運(yùn)動性疲勞后的差異代謝物篩選*

郭 飛， 向 茹， 王一民， 史銀斌， 曹衛(wèi)華， 池愛平， 曹 犇

((陜西師范大學(xué)體育學(xué)院， 陜西 西安 710119)

運(yùn)動性疲勞產(chǎn)生的生理原因與能量消耗、代謝物堆積、自由基生成過多等有關(guān)[1]。合理的運(yùn)動性疲勞能夠進(jìn)一步提高機(jī)體的運(yùn)動機(jī)能水平，而通過合適的訓(xùn)練手段使機(jī)體達(dá)到合理的運(yùn)動性疲勞狀態(tài)，也是科學(xué)訓(xùn)練的目的之一。因此，對于運(yùn)動性疲勞的科學(xué)檢測，具有重要的實(shí)際意義。目前人們多采用常規(guī)的生理指標(biāo)(如心率與血壓等)、生化指標(biāo)(如血尿素氮與血乳酸等)以及主觀自覺用力程度分級量表(rate of perceived exertion, RPE)等用于運(yùn)動性疲勞的檢測[1]，而較少對機(jī)體內(nèi)小分子代謝物的變化進(jìn)行監(jiān)測。

足球運(yùn)動項目對運(yùn)動員的有氧運(yùn)動能力和無氧運(yùn)動能力均有較高要求，足球運(yùn)動員的運(yùn)動性疲勞產(chǎn)生必然與其機(jī)體的有氧代謝和無氧代謝水平有關(guān)。對于少年足球運(yùn)動員而言，由于其機(jī)體處于生長發(fā)育階段，具有能源物質(zhì)代謝快、機(jī)體易疲勞等特點(diǎn)，因而其在運(yùn)動性疲勞后代謝物的變化必然具有一定的特異性。代謝組學(xué)是檢測機(jī)體小分子代謝物變化的一種常用方法，已有研究將其應(yīng)用在運(yùn)動人體科學(xué)研究領(lǐng)域[2]。因此，為了探索少年足球運(yùn)動員在運(yùn)動性疲勞后差異代謝物的變化特征，本研究模擬足球運(yùn)動的能量代謝特點(diǎn)，建立少年足球運(yùn)動員有氧運(yùn)動和無氧運(yùn)動相結(jié)合的運(yùn)動模型，采用氣相-質(zhì)譜法(gas chromatograph-mass spectrometer, GC-MS)，對其運(yùn)動性疲勞后的尿液差異代謝進(jìn)行檢測與篩選，為少年足球運(yùn)動員的科學(xué)訓(xùn)練提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

研究對象來自陜西省少年體校12名男性足球運(yùn)動員，年齡14～16歲。研究對象均滿足本實(shí)驗的入選標(biāo)準(zhǔn)：① 身體健康，無任何疾?。虎?參加專業(yè)訓(xùn)練年限3～4年，均達(dá)到我省足球預(yù)備隊選拔要求；③ 運(yùn)動前，通過RPE量表確定沒有任何身體疲勞積累；④ 均無抽煙與飲酒習(xí)慣。在獲得本人、學(xué)校和監(jiān)護(hù)人的同意后，進(jìn)入本實(shí)驗流程。本實(shí)驗方案與實(shí)驗過程獲得陜西師范大學(xué)學(xué)術(shù)與倫理道德委員會的許可與監(jiān)督。

1.2 運(yùn)動模型的建立與評定標(biāo)準(zhǔn)

在參考相關(guān)文獻(xiàn)[3]的基礎(chǔ)上，建立一個有氧運(yùn)動+無氧運(yùn)動的功率自行車復(fù)合運(yùn)動訓(xùn)練模型，其中，有氧運(yùn)動采用奧斯特蘭德(Astrand-ryhmin)運(yùn)動模式[4]，即：運(yùn)動員完成6 min踏騎運(yùn)動(負(fù)荷：150 W，轉(zhuǎn)速：60～65 r/min)；無氧運(yùn)動采用溫蓋特(Wingate)無氧運(yùn)動模式[5]，即：運(yùn)動員完成30 s最大速度踏騎運(yùn)動，負(fù)荷按照測試者體重設(shè)定；每組運(yùn)動包含1次有氧運(yùn)動和1次無氧運(yùn)動，中間間隙休息時間為1 min；重復(fù)運(yùn)動組數(shù)為3組，組間休息時間為3 min；運(yùn)動方案見圖1所示。

運(yùn)動員在進(jìn)行30 min的熱身活動后開始上述重復(fù)的復(fù)合運(yùn)動，同時佩戴polar表(RS800sd，芬蘭)記錄運(yùn)動員不同時間點(diǎn)的心率；此外，記錄運(yùn)動員每組運(yùn)動后的最大攝氧量(VO2 max)、平均無氧功率和RPE值。運(yùn)動性疲勞的判定標(biāo)準(zhǔn)：運(yùn)動后RPE量表達(dá)到 17～19級[6,7]，并且測定運(yùn)動當(dāng)日晨、運(yùn)動后3 h和次日晨的尿蛋白，確定測試者尿蛋白當(dāng)日晨顯陰性、運(yùn)動后3 h顯陽性且次日晨顯陰性[1]，確保運(yùn)動員運(yùn)動性疲勞的造模成功。

Fig. 1 Exercise protocol of teenage football players

1.3 尿樣采集

為了避免飲食與體力活動等對代謝組學(xué)檢測造成干擾，在實(shí)驗前1 d開始，12名研究對象統(tǒng)一飲食、進(jìn)行日?；顒雍头谴髲?qiáng)度運(yùn)動。分別于準(zhǔn)備活動前30 min和整個模型運(yùn)動結(jié)束后3 h采集運(yùn)動員的中段尿液1 ml，加入質(zhì)量體積為0.5/1000(w/v)的疊氮鈉防腐，之后置于-80℃保存待測。

1.4 GC-MS法檢測

取100 μl尿液樣本，每管加入L-2-氯苯丙氨酸20 μl(內(nèi)標(biāo))，離心10 min(10 000 r/min)取上，干燥后加入80 μl甲氧胺鹽80℃孵育30 min；再加入100 μl的N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺 70℃孵育120 min后冷卻至室溫，再加入10 μl飽和脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)混合液，混勻后上機(jī)檢測。檢測儀器為Agilent 7890氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；測試條件：進(jìn)樣量1 μl，采用不分流模式；柱溫50℃保持1 min，以10℃/min的速率增加到300℃，維持7 min；離子源溫度220℃，掃描方式50～500 m/z。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 運(yùn)動員在運(yùn)動中的VO2 max和平均無氧功率的比較

少年足球運(yùn)動員在3組運(yùn)動中的VO2 max和平均無氧功率測試結(jié)果見表 1。

Tab. 1 Results of VO2 max and average anaerobic power after exercise n=12)

表 1 結(jié)果顯示，測試對象在3組的運(yùn)動中VO2 max值維持在一個恒定的水平，變化不明顯；運(yùn)動員在第1組和第2組運(yùn)動的平均無氧功率值之間變化不顯著，但是第3組運(yùn)動后平均無氧功率值與第1組運(yùn)動后相比較，呈顯著下降趨勢(P<0.05)。說明在本實(shí)驗的3組運(yùn)動中，運(yùn)動員的有氧運(yùn)動能力變化不明顯，而其無氧運(yùn)動能力有一定程度下降。

2.2 尿液差異代謝物篩選結(jié)果

2.2.1 尿液樣本采集與GC-MS檢測結(jié)果 通過對運(yùn)動員進(jìn)行3組運(yùn)動末RPE量表的詢問，結(jié)果均為18～19級；且所有測試者尿蛋白在整個運(yùn)動模型結(jié)束后顯陽性，次日晨11名測試者尿蛋白恢復(fù)至陰性，提示其運(yùn)動性疲勞有較好的恢復(fù)；另外有1人次日晨尿蛋白依然顯示陽性，提示其運(yùn)動性疲勞沒有很好的恢復(fù)，為了檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，對該運(yùn)動員運(yùn)動后的尿液樣本不予GC-MS測試。樣本經(jīng)過處理后進(jìn)行GC-MS的檢測，得到的總離子流色譜圖(total ion current, TIC)如圖2所示。

圖2是整個運(yùn)動模型前后運(yùn)動員尿液樣本的GC-MS總離子流質(zhì)譜圖。運(yùn)動前和運(yùn)動后總計檢測出635個代謝物的質(zhì)譜峰，從樣本代謝物的總離子流色譜圖結(jié)果來看，兩組代謝物的質(zhì)譜峰群的差異性較明顯，其中運(yùn)動前的代謝物的質(zhì)譜峰群較為密集，說明運(yùn)動員在參與該運(yùn)動模型后，機(jī)體內(nèi)物質(zhì)與能量代謝系統(tǒng)產(chǎn)生了較大變化。

Fig. 2 Total ion chromatograms of GC-MS detection

2.2.2 代謝物質(zhì)譜峰數(shù)據(jù)的PCA和OPLS-DA分析 對上面得到的635個代謝物的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理和過濾，再使用SIMCA軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化后，對數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析和OPLS-DA分析。PCA分析和OPLS-DA分析的結(jié)果如圖3所示。

Fig. 3 PCA and OPLS-DA analysis of urine metabolites

PCA得分圖是對原始數(shù)據(jù)樣品分布的一個總體呈現(xiàn)，從得分圖(圖3 A)可以看出，運(yùn)動前的樣本PCA得分分布在Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ象限，運(yùn)動后的樣本PCA得分分布在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ象限，二者在第Ⅰ象限有重疊部分，因此，為了完全分開這兩種情況下的差異代謝物信號，需進(jìn)一步對數(shù)據(jù)進(jìn)行OPLS-DA分析，過濾掉相關(guān)性不高的差異代謝物正交信號。OPLS-DA分析結(jié)果見圖3 B所示， 運(yùn)動前的OPLS-DA得分分布在Ⅱ、Ⅲ象限，而運(yùn)動后的OPLS-DA得分分布在Ⅰ、Ⅳ象限，說明在OPLS-DA分析篩選后，兩組差異代謝物的分離效果比較理想。

2.2.3 差異代謝物的篩選 將OPLS-DA分析后的代謝物數(shù)據(jù)信息輸入KEGG數(shù)據(jù)庫，根據(jù)代謝物的信息與KEGG數(shù)據(jù)庫中對應(yīng)的代謝物信息進(jìn)行比對，依據(jù)代謝物的相似度大于700、代謝物貢獻(xiàn)值VIP大于1和組間比較的t檢驗概率P值小于0.05作為差異代謝物的篩選標(biāo)準(zhǔn)，最終篩選到25個差異代謝物(表2)。

Tab. 2 Selected differential metabolites after exercise

被篩選的差異代謝物與氨基酸代謝有關(guān)。運(yùn)動疲勞后，羥胺(hydroxylamine)、檸檬酸(citric acid)和山梨糖醇(sorbitol)這3個差異代謝物與運(yùn)動前相比較，其信號強(qiáng)度呈現(xiàn)顯著性升高(P<0.05，P<0.01)，三者依次與氮代謝、三羧酸代謝、半乳糖代謝相關(guān)。其余22個差異代謝物的信號強(qiáng)度在運(yùn)動后均不同程度顯著性下降。

2.2.4 差異代謝物的代謝通路歸屬 上述25個差異代謝物所涉及的代謝通路較多，需要將其輸入MetPA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行代謝通路權(quán)重得分比較，才能確定這些差異代謝物所影響的主要通路。上述差異代謝物的代謝通路歸屬結(jié)果見圖4。

圖4結(jié)果顯示，以差異代謝物在相應(yīng)代謝通路中的權(quán)重影響力得分大于0.05作為其代謝通路歸屬的篩選標(biāo)準(zhǔn)，有5條代謝通路符合篩選標(biāo)準(zhǔn)，按照其權(quán)重影響力大小排序，依次是：甘氨酸-絲氨酸-蘇氨酸代謝(glycine, serine and threonine metabolism)、三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle)、酪氨酸代謝(tyrosine metabolism)、氮代謝(nitrogen metabolism)和甘油磷酯代謝(glycerophospholipid metabolism)，這幾條代謝通路歸屬于蛋白質(zhì)代謝、三羧酸循環(huán)和脂代謝等通路。

Fig. 4 The impact score of the metabolic pathways

3 討論

從物質(zhì)與能量代謝的角度，足球運(yùn)動是一項典型的有氧與無氧代謝相結(jié)合的復(fù)合性運(yùn)動項目。優(yōu)秀的足球運(yùn)動員必須具備較好的有氧代謝能力和無氧代謝能力。本研究實(shí)驗對象選取的少年足球運(yùn)動員是陜西省足球隊的預(yù)備隊員，對其運(yùn)動能力與訓(xùn)練監(jiān)控研究對于提高我省足球競技水平具有重要的意義。本研究通過功率自行車建立有氧運(yùn)動和無氧運(yùn)動結(jié)合的運(yùn)動模型，模擬少年足球運(yùn)動員在實(shí)戰(zhàn)中的運(yùn)動強(qiáng)度，最終達(dá)到運(yùn)動性疲勞。實(shí)驗結(jié)果顯示，在該運(yùn)動模型下，運(yùn)動員均達(dá)到運(yùn)動性疲勞的狀態(tài)；在3組的運(yùn)動訓(xùn)練中，運(yùn)動員的最大攝氧量均維持在恒定水平，但其平均無氧功率呈現(xiàn)下降趨勢。代謝組學(xué)是目前常用的生物檢測手段。同時，國內(nèi)外很多研究將其應(yīng)用在運(yùn)動訓(xùn)練中，包括有氧運(yùn)動[10,11]、無氧運(yùn)動[12,13]以及普通人群的體育鍛煉中[14]。從運(yùn)動模型的角度來分析相關(guān)的代謝通路，一般高強(qiáng)度間歇訓(xùn)練可檢測到生物能量代謝通路的變化，例如脂代謝、蛋白質(zhì)代謝、三羧酸循環(huán)等。而中等強(qiáng)度的持續(xù)性訓(xùn)練，則不會出現(xiàn)上述代謝通路的變化[15]，因此，運(yùn)動強(qiáng)度可能是引起運(yùn)動員機(jī)體代謝通路出現(xiàn)變化的關(guān)鍵因素。本研究設(shè)計的運(yùn)動模型是有氧運(yùn)動和無氧運(yùn)動結(jié)合的模型，屬于大強(qiáng)度間隙訓(xùn)練，訓(xùn)練結(jié)束后運(yùn)動員產(chǎn)生運(yùn)動性疲勞。

本實(shí)驗結(jié)果證實(shí)，少年足球運(yùn)動員運(yùn)動后出現(xiàn)顯著變化的代謝與蛋白質(zhì)代謝、三羧酸循環(huán)和脂代謝紊亂相關(guān)，這個結(jié)果與Shlomit等[16]的研究結(jié)果具有相似性。在大強(qiáng)度運(yùn)動中，糖原是肌肉收縮的主要能源物質(zhì)，隨著運(yùn)動時間的延長，一定量的蛋白質(zhì)分解代謝會發(fā)生，其釋放的能量來補(bǔ)充糖原供能的不足，隨著運(yùn)動型疲勞的產(chǎn)生程度，蛋白質(zhì)代謝的程度也相應(yīng)增加。本研究結(jié)果顯示，在運(yùn)動性疲勞后均明顯降低的標(biāo)記物有：甘氨酸-絲氨酸-蘇氨酸代謝中的肌氨酸、L-別蘇氨酸、肌酸、絲氨酸；酪氨酸代謝中的琥珀酸和4-羥基苯乙酸；而氮代謝中的羥胺含量反而明顯增加，提示少年足球運(yùn)動員發(fā)生運(yùn)動型疲勞之后，其甘氨酸-絲氨酸-蘇氨酸、酪氨酸代謝通路可能出現(xiàn)紊亂情況，同時氮代謝通路紊亂顯示其存在“負(fù)氮平衡”的可能性。類似的研究也證明，舉重運(yùn)動員疲勞后，其組氨酸和甘氨酸相對含量降低，而耐力運(yùn)動員組氨酸和酪氨酸含量降低[17]；對于少年運(yùn)動員有氧運(yùn)動后代謝物變化的研究發(fā)現(xiàn)：甘氨酸-絲氨酸-蘇氨酸、支鏈氨基酸等多種氨基酸含量降低[16]。上述研究結(jié)果說明不同運(yùn)動類型引起的差異代謝物也不同，而對于少年運(yùn)動員來說，運(yùn)動型疲勞導(dǎo)致的氨基酸代謝紊亂以及“負(fù)氮平衡”依然是主要特征。

三羧酸循環(huán)是運(yùn)動時能源物質(zhì)代謝的中間環(huán)節(jié)，而琥珀酸和檸檬酸是該代謝通路中關(guān)鍵的代謝物。有研究表明，耐力運(yùn)動員運(yùn)動性疲勞后琥珀酸含量顯著降低而檸檬酸含量顯著增加，而力量運(yùn)動員未發(fā)現(xiàn)同樣的變化[17]。本實(shí)驗結(jié)果顯示，運(yùn)動員運(yùn)動后尿液差異代謝物中，琥珀酸顯著降低而檸檬酸顯著增加，說明有氧與無氧運(yùn)動結(jié)合的復(fù)合運(yùn)動模型導(dǎo)致的運(yùn)動性疲勞與三羧酸循環(huán)紊亂有關(guān)。

眾所周知，脂肪酸通常是長時間的中、低強(qiáng)度運(yùn)動的主要能量來源[18]。目前研究發(fā)現(xiàn)，脂肪酸代謝系列中的甘油磷脂代謝，在劇烈運(yùn)動后會受到明顯的影響[19]。由于甘油磷脂是細(xì)胞膜的主要成分，對細(xì)胞膜識別蛋白質(zhì)以及生物信號傳導(dǎo)等功能發(fā)揮重要作用[20]。因此，推測劇烈運(yùn)動引起的機(jī)體細(xì)胞傳導(dǎo)功能紊亂可能與該通路紊亂有關(guān)。同樣，本次實(shí)驗的結(jié)果證實(shí)少年足球運(yùn)動員在運(yùn)動型疲勞后，其尿液樣本代謝物中乙醇胺的含量顯著下降，該物質(zhì)也是甘油磷酯代謝通路中關(guān)鍵代謝物，提示乙醇胺可作為該運(yùn)動模型下甘油磷酯代謝的一個生物標(biāo)記物。

綜上所述，本研究通過有氧與無氧運(yùn)動結(jié)合的運(yùn)動模型，篩選出少年足球運(yùn)動員發(fā)生運(yùn)動性疲勞后的差異代謝物，可能與機(jī)體的部分氨基酸代謝、甘油磷酯代謝以及三羧酸循環(huán)紊亂有關(guān)。上述代謝通路中發(fā)生顯著變化的差異代謝物為肌氨酸、L-別蘇氨酸、肌酸、絲氨酸、琥珀酸、檸檬酸、4-羥基苯乙酸、羥胺和乙醇胺，這些差異代謝物在后續(xù)的研究中，可通過靶標(biāo)代謝組學(xué)的檢測方法進(jìn)行定量化研究后，有望成為評估少年足球運(yùn)動員運(yùn)動性疲勞的生物標(biāo)記物。