甘麥大棗湯對抑郁模型大鼠海馬神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)的影響*

郭 銳， 秦衛(wèi)帥， 張雙勇， 張淑玲

((1. 鄭州市中醫(yī)院腦病一科， 河南 鄭州 450007； 2. 鄭州市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 河南 鄭州 450003)

抑郁癥是以情緒低落、快感缺失、行為遲緩等為主要特征的精神性疾病，重度抑郁癥患者會有明顯的自殺念頭及行為，嚴(yán)重威脅人類身心健康。目前，全球大約有9億人口患有不同程度的抑郁癥，且發(fā)病率逐年升高，預(yù)測到2020年，將上升為世界第二大疾病[1]。目前，抑郁癥的確切發(fā)病機(jī)制不明，但存在一些較為公認(rèn)的假說，包括神經(jīng)遞質(zhì)假說、細(xì)胞因子假說、神經(jīng)營養(yǎng)假說等[2]。越來越多的研究證明，神經(jīng)突觸可塑性改變在抑郁癥的形成過程中作用關(guān)鍵，抑郁狀態(tài)下，往往伴隨著神經(jīng)元凋亡及突觸可塑性下降等病理改變，海馬則是其主要靶部位[3-4]。甘麥大棗湯出自漢代張仲景《金匱要略》，具有養(yǎng)心安神、和中緩急功效，主要用于改善睡眠，近年來其抗抑郁功效逐漸被重視，臨床常使用甘麥大棗湯及其加減方治療各類抑郁癥，療效明顯[5-6]。為了更好的明確甘麥大棗湯的抗抑郁功效及其機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)，本研究在建立抑郁動物模型的基礎(chǔ)上，以觀察神經(jīng)突觸結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)蛋白MAP-2和GAP-43表達(dá)為切入點(diǎn)，評價甘麥大棗湯抗抑郁的療效及探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD大鼠60只，雄性，體質(zhì)量180～220 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物許可證：SCXK(京)2016-0011。大鼠購入后先適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，實驗期間大鼠均在室溫(25±1)℃、相對濕度(50±5)%環(huán)境下喂養(yǎng)。

1.2 藥物

甘麥大棗湯由炙甘草9 g、小麥30 g、大棗5粒組成，中藥原藥材均購自鄭州市中醫(yī)院，全方共煎煮2次，第一次加入10倍量水，第二次加入8倍量水，合并兩次水煎液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，冷凍干燥，打粉稱重后保存?zhèn)溆?。根?jù)人臨床用量折算出大鼠等效劑量，高、低劑量分別為等效劑量的2倍、1倍，分別含生藥量9.72、4.86 g/kg；氟西汀購自禮來蘇州制藥有限公司，批號為0925A，給藥劑量為10.8 mg/kg。

1.3 試劑與儀器

5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)試劑盒購自武漢伊萊瑞特公司；RIPA裂解液、BCA試劑盒購自美國Thermo公司；核酸蛋白定量儀購自英國BioDrop公司；兔抗大鼠MAP-2、GAP-43、GAPDH多克隆抗體購自美國CST公司，HPR標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自武漢博士德公司；凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司；組織切片機(jī)購自美國WPI公司；顯微鏡購自德國Zeiss公司。

1.4 動物分組與造模

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，根據(jù)體質(zhì)量將其隨機(jī)分為5組，包括正常對照組，抑郁模型組，氟西汀組，甘麥大棗湯高、低劑量組，每組12只。除正常對照組外，其余各組大鼠均給予21 d慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激(CUMS)，應(yīng)激因素包括24 h禁食禁水、24 h晝夜顛倒、4 min 50 V電擊、1 min夾尾、4 h 80 db噪音、5 min 50℃熱水浴、5 min 4℃冰水浴，每天隨機(jī)采用1次，同一種應(yīng)激不連續(xù)出現(xiàn)，應(yīng)激造模期間動物均孤籠飼養(yǎng)。

1.5 動物給藥

于應(yīng)激造模同時灌胃給藥，氟西汀組給予陽性對照藥氟西汀，劑量為10.8 mg/kg，甘麥大棗湯高、低劑量組分別給予復(fù)方中藥甘麥大棗湯9.72、4.86 g/kg，對照組與模型組則給予等體積的蒸餾水，給藥體積為10 ml/kg，每日1次，連續(xù)21 d。末次給藥完成后，所有大鼠進(jìn)行行為學(xué)檢測，檢測完成后麻醉，部分大鼠取腦組織固定于多聚甲醛中，另一部分大鼠剝離海馬組織冷凍保存。

1.6 行為學(xué)檢測

1.6.1 糖水消耗實驗 于測試前12 h對大鼠禁水不禁食，每只大鼠給予兩個水瓶，水瓶擺放位置隨機(jī)，一瓶裝1%蔗糖水，另一瓶裝蒸餾水，記錄大鼠6 h內(nèi)分別攝入蔗糖水和蒸餾水的體積，計算糖水偏好度=蔗糖水消耗量/(蔗糖水消耗量+蒸餾水消耗量)×100%。

1.6.2 曠場測試 于測試前1 h將待測大鼠放入測試房間適應(yīng)環(huán)境，測試開始后，關(guān)閉房間燈光，將大鼠置于底面有25個小方格的黑色敞箱中，待其自由活動1 min后，記錄大鼠4 min內(nèi)水平運(yùn)動格數(shù)以及垂直豎立次數(shù)，計算兩者之和作為自主活動評分。

1.7 ELISA法檢測單胺遞質(zhì)5-HT、NE含量

取冷凍保存的海馬組織，稱重，按10 μl/mg組織加入預(yù)冷的PBS液，冰上勻漿后離心，取上清液，加入到預(yù)先包被5-HT、NE抗體的試劑盒中，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，于酶標(biāo)儀450 nm波長下測定光密度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算海馬組織中單胺遞質(zhì)的含量。

1.8 Golgi染色觀察海馬神經(jīng)元突觸形態(tài)

取腦組織切成小塊，浸泡于媒染液中，避光放置3 d；然后置于1.5%硝酸銀水溶液中浸泡鍍銀，置暗處放置3 d，每天定時更換新銀液，充分鍍銀后，切片，漂洗，脫水，樹膠二甲苯封片，晾干后置于顯微鏡下觀察神經(jīng)元突觸形態(tài)。

1.9 免疫組化法檢測海馬MAP-2、GAP-43陽性表達(dá)

取固定完全的腦組織，脫水，包埋，切片，室溫下脫蠟，水化，進(jìn)行熱抗原修復(fù)；滴加山羊血清封閉液封閉非特異性位點(diǎn)，除去封閉液，滴加一抗孵育過夜；洗滌，滴加二抗室溫下孵育25 min，洗滌，滴加DAB染液，染色合適即終止，蘇木素復(fù)染，脫水，滴加適量中性樹膠封片，晾干片子后于顯微鏡下拍照。使用Image-pro Plus軟件分析海馬MAP-2、GAP-43積分光密度值(IOD值)。

1.10 Western blot法檢測MAP-2、GAP-43蛋白相對表達(dá)量

取冷凍保存的海馬組織，加入RIPA裂解液充分裂解后勻漿，離心后取上清液，測定總蛋白含量。制備分離膠和濃縮膠，蛋白上樣，凝膠電泳至溴酚藍(lán)跑出分離膠后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，根據(jù)目的蛋白分子量裁剪條帶，分別加入稀釋后的兔抗大鼠多克隆一抗(MAP-2，1∶1 000；GAP-43，1∶1 000；GAPDH，1∶2 000)，4℃孵育過夜。次日用TBST液洗滌條帶3次，每次15 min，加入山羊抗兔單克隆二抗(1∶500)室溫下孵育4 h，TBST液洗3次，每次15 min，之后進(jìn)行ECL顯影。應(yīng)用Image J軟件分析條帶灰度值，根據(jù)目的蛋白和內(nèi)參蛋白對應(yīng)灰度值的比值計算蛋白相對表達(dá)水平。

1.11 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 甘麥大棗湯對行為學(xué)的影響

與對照組比較，抑郁模型組大鼠糖水偏好度與自主活動能力均顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，給予氟西汀或高劑量甘麥大棗湯干預(yù)后，大鼠對糖水的喜好度及自主活動水平均顯著回升(P< 0.01)。此外，低劑量甘麥大棗湯也能改善模型大鼠的自主活動評分(P<0.05，表1)。

Tab. 1 Effects of Ganmai Dazao Tang on the behavioral changes in depressive rats n=12)

2.2 甘麥大棗湯對海馬單胺遞質(zhì)含量的影響

與對照組比較，抑郁模型大鼠海馬單胺遞質(zhì)5-HT、NE含量均顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，氟西汀和高劑量甘麥大棗湯組大鼠海馬5-HT、NE含量均顯著升高(P<0.05或P<0.01)，低劑量甘麥大棗湯對大鼠單胺遞質(zhì)含量無明顯影響(P>0.05，表2)。

Tab. 2 Effects of Ganmai Dazao Tang on the monoamine neurotransmitters in depressive rats (ng/g, n=6)

2.3 甘麥大棗湯對海馬神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)的影響

正常大鼠海馬神經(jīng)元豐富，樹突棘分枝較長且均一，排列整齊致密；與對照組比較，模型組大鼠海馬神經(jīng)元排列散亂，樹突棘萎縮，分枝變短，稀疏無規(guī)則，突觸損傷明顯；與模型組比較，氟西汀和高劑量甘麥大棗湯組大鼠神經(jīng)元突觸損傷明顯減輕，樹突棘的復(fù)雜性和可塑性得到恢復(fù)，低劑量甘麥大棗湯組樹突棘的長度與數(shù)量有一定增加，但效果不如高劑量組明顯(圖1)。

Fig. 1 Effects of Ganmai Dazao Tang on synaptic morphology of hippocampal neurons in depressive rats (×200)

2.4 甘麥大棗湯對海馬突觸結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)的影響

與對照組比較，模型組大鼠海馬突觸結(jié)構(gòu)蛋白MAP-2和GAP-43表達(dá)均顯著下調(diào)(P<0.01)；與模型組比較，氟西汀和高劑量甘麥大棗湯組大鼠突觸結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.05或P<0.01)，低劑量甘麥大棗湯組僅MAP-2的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05，圖2，3，表3)。

Fig. 2 Hippocampal MAP-2 and GAP-43 immunohistochemical staining(×200)

Fig. 3 Hippocampal MAP-2 and GAP-43 Western blot

Tab. 3 Effects of Ganmai Dazao Tang on the expressions of MAP-2 and GAP-43 in depressive rats n=4)

3 討論

持續(xù)的不可預(yù)見性應(yīng)激是導(dǎo)致抑郁癥發(fā)生的關(guān)鍵原因，依據(jù)此特點(diǎn)創(chuàng)建的CUMS模型已被廣泛使用于國內(nèi)外的抑郁癥相關(guān)研究中。在本研究中，CUMS造模21 d后，行為學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)模型大鼠蔗糖水偏好度及自主活動能力均明顯下降，符合抑郁癥患者的臨床特征，提示抑郁模型建立成功。

海馬是調(diào)控學(xué)習(xí)與記憶功能的關(guān)鍵腦區(qū)，其病理生理情況決定了抑郁癥的發(fā)生發(fā)展。臨床和基礎(chǔ)研究均證實，在抑郁狀態(tài)下，大腦海馬存在體積變小、萎縮、神經(jīng)元缺失等病理損傷現(xiàn)象[7-8]。5-HT是導(dǎo)致抑郁癥發(fā)生最為關(guān)鍵的一種單胺神經(jīng)遞質(zhì)，目前臨床抑郁癥一線用藥，如氟西汀、帕羅西汀、西酞普蘭等均是通過選擇性地抑制腦內(nèi)5-HT的再攝取，增加神經(jīng)元間5-HT含量，從而保證神經(jīng)元信號的正常傳導(dǎo)，發(fā)揮抗抑郁功效[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，甘麥大棗湯不僅能顯著改善模型大鼠的抑郁樣行為，還能升高海馬單胺遞質(zhì)的含量，表明其有良好的抗抑郁效果，與文獻(xiàn)報道一致[11]。

突觸是神經(jīng)元間信息傳遞的基礎(chǔ)，神經(jīng)元通過突觸互相聯(lián)系，從而形成一個復(fù)雜的大腦信息處理網(wǎng)絡(luò)[12-13]。多種神經(jīng)性疾病的發(fā)生均會出現(xiàn)突觸形態(tài)、密度異常、骨架蛋白缺失等病理特征[14]。MAP-2是一種微管相關(guān)蛋白，主要表達(dá)于神經(jīng)元樹突和突觸后致密區(qū)，是神經(jīng)元樹突靜態(tài)結(jié)構(gòu)蛋白。MAP-2參與神經(jīng)元生長、突起形成和突觸可塑性調(diào)節(jié)等，維持突觸結(jié)構(gòu)與功能，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)元間的正常信號傳遞起著關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[15]。GAP-43是一種分子量為43 kD的神經(jīng)調(diào)節(jié)素，主要分布在突觸前膜，與神經(jīng)元生長發(fā)育、軸突生長及再生以及突觸重塑等關(guān)系密切。研究報道，參與學(xué)習(xí)記憶的海馬長時程增強(qiáng)(LTP)的強(qiáng)度及持續(xù)時間與腦內(nèi)GAP-43表達(dá)水平有關(guān)[16-17]。本研究中，抑郁模型大鼠海馬MAP-2和GAP-43表達(dá)下降，這可能與Golgi染色顯示的神經(jīng)元突觸損傷有關(guān)，而在氟西汀或者甘麥大棗湯治療后，模型大鼠突觸損傷得以改善，樹突棘長度、密度及分枝等明顯增加，同時海馬MAP-2和GAP-43表達(dá)回升。

本實驗以海馬為關(guān)鍵靶區(qū)研究甘麥大棗湯的抗抑郁功效及機(jī)制，發(fā)現(xiàn)甘麥大棗湯能有效改善抑郁模型大鼠的快感缺失、運(yùn)動不能等抑郁特征，升高海馬單胺遞質(zhì)含量，其作用可能與調(diào)控突觸結(jié)構(gòu)蛋白MAP-2和GAP-43的表達(dá)而保護(hù)神經(jīng)元突觸有關(guān)。本研究從突觸結(jié)構(gòu)探討了甘麥大棗湯的抗抑郁機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供了更多的實驗依據(jù)，下一步擬從突觸功能進(jìn)行相關(guān)研究。