FABP5-PPARγ信號(hào)通路對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶及脂質(zhì)代謝的影響*

陳丹丹， 董 瑩， 楊曉丹

((1. 天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦血管病科， 天津 300300； 2. 吉林省腫瘤醫(yī)院放療三科， 長(zhǎng)春 130012； 3. 中國(guó)人民解放軍第九八三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 天津 300142)

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是由腦血管疾病引起的認(rèn)知功能和智能障礙綜合征,是老年癡呆一種常見(jiàn)的病因之一[1]。VD的發(fā)病率逐年升高，并趨于年輕化，已經(jīng)成為繼阿爾茨海默病的第二大癡呆類(lèi)型。VD的主要臨床癥狀表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶及認(rèn)知功能的下降，且階梯式加重，進(jìn)而影響患者的日常生活及社會(huì)活動(dòng)[2]。但VD的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前其分子機(jī)制主要集中在膽堿能系統(tǒng)、突觸可塑性變化、氧化應(yīng)激、tau蛋白磷酸化、炎癥反應(yīng)等。有研究提出，脂質(zhì)代謝異常與認(rèn)知功能障礙有著密切的關(guān)系[3]，且在VD患者腦內(nèi)出現(xiàn)脂質(zhì)代謝異常的情況。脂肪酸結(jié)合蛋白5(fatty acid binding protein 5, FABP5)參與脂肪酸的攝取、結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝。在AD模型鼠腦內(nèi)FABP5表達(dá)減少，其通過(guò)降低花生四烯酸乙醇胺調(diào)節(jié)認(rèn)知功能，與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)[4]，但其在VD中的作用鮮有報(bào)道。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ)是核激素受體家族中的配體激活受體，參與脂肪、葡萄糖和能量代謝的協(xié)調(diào)[5]，是控制脂肪因子基因表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，PPARγ在VD模型中表達(dá)降低。在前列腺癌中FABP5可通過(guò)FABP5-PPARγ-VEGF信號(hào)通路轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)量的脂肪酸，從而增加血管的生成、加快前列腺癌的惡性進(jìn)展[6]。

本實(shí)驗(yàn)旨在研究FABP5在VD模型中的作用，檢測(cè)FABP5及其下游分子表達(dá)的變化，以探討FABP5-PPARγ信號(hào)通路對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及脂質(zhì)代謝的影響，為在臨床上有效治療VD提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

健康成年雄性SD大鼠，體重220～250 g，50只，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，于SPF級(jí)飼養(yǎng)。SB-FI-26購(gòu)自美國(guó)APEXBIO公司，F(xiàn)ABP5及LPL一抗購(gòu)自ABCAM公司，PPARγ及p- PPARγ一抗購(gòu)自美國(guó)Cell signaling公司，BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物公司，ECL發(fā)光液購(gòu)自武漢博士德生物公司，二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司，Trizol及RT-qPCR試劑盒購(gòu)自天津鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司。甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)試劑盒購(gòu)自中生北控生物科技福分有限公司；游離脂肪酸(FFA)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型制備

(1)將30只SD大鼠隨機(jī)分為三組：正常對(duì)照組(WT組)、假手術(shù)組(sham組)和VD模型組(VD組)，每組10只。VD模型采用永久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法制備；假手術(shù)組大鼠僅分離頸總動(dòng)脈但不結(jié)扎。術(shù)后使用104U慶大霉素3 d以預(yù)防感染。WT組不做任何處理。(2)將20只SD大鼠隨機(jī)分為2組(n=10)：WT組和鼻腔給予FABP5抑制劑SB-FI-26組。給藥組每日鼻腔給予1 mg/kg的FABP5抑制劑SB-FI-26溶液，WT組大鼠每日鼻腔給予同等體積的生理鹽水,給藥4周，以探討FABP5是否通過(guò)調(diào)控PPARγ來(lái)發(fā)揮其在VD中的作用。

1.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)造?；虮乔唤o藥4周后行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。(1)定位航行實(shí)驗(yàn)：將平臺(tái)放置于水迷宮第三象限的中央，每天將大鼠頭朝壁側(cè)從相鄰象限放入水中，記錄大鼠找到并爬上平臺(tái)所需時(shí)間，即逃避潛伏期。實(shí)驗(yàn)時(shí)間為120 s，若大鼠在120 s內(nèi)未找到平臺(tái)，則將其引至平臺(tái)停留20 s，逃避潛伏期記為120 s。每天訓(xùn)練2次，兩次間隔時(shí)間為20 min。定位航行實(shí)驗(yàn)歷時(shí)5 d。(2)空間探索實(shí)驗(yàn)：在實(shí)驗(yàn)第6日撤去平臺(tái)，在第一象限將大鼠頭朝壁側(cè)放入水中，每只大鼠游泳1次，歷時(shí)120 s。記錄大鼠跨越隱匿平臺(tái)的次數(shù)及入水朝向角。

1.4 腦組織樣本的制備

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)經(jīng)左心尖灌注至肝臟變白，斷頭取腦。一側(cè)分離皮質(zhì)和海馬放入-80℃冰箱備用；一側(cè)分離大腦，稱(chēng)取適量腦組織，勻漿，4℃下用正庚烷和異丙醇 (2∶3.5, v/v) 抽提脂質(zhì)，3 000 r/min低溫冷凍離心10 min，取上清存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 RT-qPCR檢測(cè)FABP5、PPARγ和LPL在大腦海馬及皮層的轉(zhuǎn)錄水平

用Trizol試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)提取大鼠皮層及海馬組織的總RNA，在7500 Real-Time qPCR 儀(美國(guó)Applied Biosystems)上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，根據(jù)目的基因與內(nèi)參基因的Ct值求得目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 Western blot檢測(cè)FABP5、PPARγ、pPPARγ和LPL在大腦海馬及皮層的蛋白表達(dá)水平

取出大鼠海馬和皮層組織，根據(jù)組織質(zhì)量加入適量蛋白裂解液于冰上進(jìn)行勻漿，提取蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度并調(diào)成等濃度；煮沸變性3 min，制膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，然后稀釋一定比例的一抗孵育(FABP5 1∶800，PPARγ 1∶5 000，pPPARγ 1∶1 000，LPL 1∶800)4℃搖床過(guò)夜，加入稀釋二抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h，PBS沖洗，加入ECL發(fā)光液于化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)拍照。采用Image J圖像處理軟件分析條帶的光密度(OD)值。

1.7 生化檢測(cè)腦組織TG、TC和FFA含量

取制備好的腦組織上清液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定各組腦組織中的TC、TG和FFA含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的比較

2.1.1 3組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的比較 定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，從第2日開(kāi)始 VD組大鼠的逃避潛伏期較WT組和sham組延長(zhǎng)，且隨著進(jìn)一步的訓(xùn)練，VD組大鼠的逃避潛伏期與WT組和sham組的差異更加顯著，WT組和sham間無(wú)顯著性差異(表1)?？臻g探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與WT組和sham組相比，VD模型大鼠跨越隱匿平臺(tái)的次數(shù)明顯減少、入水朝向角顯著增大(表2)。Morris水迷宮結(jié)果顯示，VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力受損。

Tab. 1 The escape latency in navigation test among three groups of rats (s, n=10)

Tab. 2 The number of cross-hidden platform and the orientation angle in space exploration experiment among three groups of rats n=10)

2.1.2 使用抑制劑后2組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力的比較 與WT組大鼠相比，SB-FI-26給藥組大鼠的逃避潛伏期延長(zhǎng)(表3)；跨越隱匿平臺(tái)的次數(shù)明顯減少，入水朝向角增大(表4)。因此當(dāng)鼻腔給予SB-FI-26后，F(xiàn)ABP5受到抑制，從而使得大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力降低。

Tab. 3 The escape latency in navigation testbetween two groups of rats (s, n=10)

Tab. 4 The number of cross-hidden platform and the orientation angle in space exploration experiment between two groups of rats n=10)

2.2 3組大鼠FABP5、PPARγ和LPL在大鼠海馬和皮層中的轉(zhuǎn)錄水平的比較

與WT組和sham組相比，VD組大鼠海馬及皮層FABP5、PPARγ和LPL的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，WT及sham組無(wú)顯著性差異(表5)。

與WT組相比，SB-FI-26給藥組大鼠海馬及皮層中的PPARγ和LPL的轉(zhuǎn)錄水平明顯降低(表6)，表明SB-FI-26通過(guò)抑制FABP5可抑制PPARγ和LPL的轉(zhuǎn)錄。

Tab. 5 Expressions of FABP5, PPARγ and LPL in each group by RT-qPCR n=10)

Tab. 6 Effects of FABP5 inhibitor SB-FI-26 on FABP5-PPARγ signaling pathway in WT rats by RT-qPCR n=10)

2.3 3組間FABP5-PPARγ通路相關(guān)蛋白在大鼠腦內(nèi)表達(dá)水平的比較

與WT組和sham組相比，VD組大鼠大腦皮層及海馬FABP5表達(dá)明顯減少；總PPARγ在皮層中的表達(dá)降低，在海馬中的表達(dá)降低更顯著；pPPARγ在皮層中的表達(dá)顯著減少，在海馬中的表達(dá)降低更顯著；LPL在海馬中的表達(dá)減少，其在皮層中的表達(dá)降低更為顯著(表7，圖1)。

和WT組比較，SB-FI-26給藥組大鼠大腦皮層和海馬中FABP5、總PPARγ、pPPARγ及LPL蛋白的表達(dá)顯著降低(表8，圖2)。

Tab. 7 Relative expressions of FABP5, PPARγ, p-PPARγ and LPL protein inhippocampus and cortex n=10)

Fig. 1 Expressions of FABP5, PPARγ, p-PPARγ and LPL protein in hippocampus and cortex

Tab. 8 Effects of FABP5 inhibitor SB-FI-26 on FABP5-PPARγ signaling pathway by Western n=10)

*P<0.05,**P<0.01 vs WT group

2.4 3組大鼠腦組織脂代謝的比較

如表9所示，VD組大鼠腦內(nèi)TC、TG和FFA含量均顯著高于WT組，sham組和WT組無(wú)顯著差異，結(jié)果表明VD大鼠腦內(nèi)出現(xiàn)脂代謝異常。

Fig. 2 Effects of FABP5 inhibitor SB-FI-26 on FABP5-PPARγ signaling pathway by Western blot

Tab. 9 Comparison of TC, TG and FFA levels in the brain of each group (mmol/L, n=10)

如表10所示，與WT組相比，SB-FI-26給藥組大鼠腦內(nèi)的TC、TG和FFA含量明顯升高，正常大鼠FABP5被抑制后同樣出現(xiàn)脂質(zhì)代謝異常情況，因此推測(cè)FABP5介導(dǎo)大鼠腦內(nèi)脂質(zhì)代謝。

Tab. 10 Effects of FABP5 inhibitor SB-FI-26 on TC, TG and FFA levels in the brain of WT rats(mmol/L, n=10)

3 討論

血管性癡呆(VD)是一種由腦血管異常引起的認(rèn)知功能下降的進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，是老年癡呆的主要類(lèi)型之一，其具體病因尚不完全明確。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，脂質(zhì)參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)的構(gòu)建、物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，神經(jīng)元信號(hào)的傳遞及突觸的發(fā)育等，有助于維持神經(jīng)細(xì)胞的正常生理功能。因此，大腦中脂質(zhì)代謝異常部分反映腦功能障礙。諸多研究發(fā)現(xiàn)，很多腦部的疾病均出現(xiàn)腦內(nèi)脂蛋白代謝的異常，如阿爾茨海默癥、亨廷頓氏舞蹈癥(HD)、尼曼匹克病(NPC)、中風(fēng)及精神分裂癥等[7, 8]，同樣在VD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，體內(nèi)也出現(xiàn)脂代謝異常，血脂過(guò)高可沉積于血管壁上，造成血管粥樣硬化，還可造成血氧降低，進(jìn)而損害學(xué)習(xí)記憶能力，因此脂代謝異常也是VD發(fā)生的危險(xiǎn)因素之一[9]。

脂肪酸結(jié)合蛋白5(FABP5)是一種15 KDa的胞質(zhì)蛋白，屬于FABP家族，有研究揭示，F(xiàn)ABP在大腦發(fā)育中有多種作用，包括神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的生成、分化、神經(jīng)元細(xì)胞遷移，并且它還參與脂肪酸(FAs)的攝取、結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝[10]。FABP5與前列腺癌、膀胱癌、胰腺、乳腺癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等惡性腫瘤有關(guān)，F(xiàn)ABP5除了和腫瘤相關(guān)，還和學(xué)習(xí)記憶有關(guān)。Pan Y等研究指出，敲除FABP5后，減少外源性二十二碳六烯酸(DHA)進(jìn)入腦內(nèi)皮層細(xì)胞和腦毛細(xì)血管的吸收，降低腦實(shí)質(zhì)內(nèi)源性DHA水平，小鼠表現(xiàn)出認(rèn)知缺陷[11]，本研究結(jié)果顯示，VD模型大鼠腦內(nèi)FABP5表達(dá)顯著減少，大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降，正常WT大鼠腦內(nèi)的FABP5被抑制后，學(xué)習(xí)記憶能力也顯著降低。因此推測(cè)FABP5的異常表達(dá)和學(xué)習(xí)記憶能力有關(guān)。FABP5轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)量脂肪酸可通過(guò)激活過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPARγ)促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)和血管生成[6]。

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor ，PPAR)是配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，屬于核受體超家族，以α，β/δ和γ三種同種型存在。PPAR-γ存在于血管細(xì)胞上，在血管內(nèi)皮功能障礙中發(fā)揮保護(hù)作用[12]。PPAR-γ及其受體還廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。這些受體的激活可通過(guò)減少氧化應(yīng)激[13]和炎性機(jī)制來(lái)防止神經(jīng)元死亡[14]，在神經(jīng)保護(hù)調(diào)節(jié)中起著重要的作用。PPAR-γ激動(dòng)劑吡格列酮和羅格列酮可以減弱鏈脲佐菌素(STZ)對(duì)大鼠學(xué)習(xí)和記憶的影響，減弱STZ誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙[15]。最近報(bào)道指出，PPAR-γ參與AD的記憶和認(rèn)知功能的改善[16]。PPARγ是影響脂質(zhì)代謝的重要轉(zhuǎn)錄因子。在巨噬細(xì)胞內(nèi)PPARγ介導(dǎo)脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase，LPL)的表達(dá)。PPARγ結(jié)合視黃酸受體(RXR)以形成PPAR-RXR的結(jié)構(gòu)， PPAR-RXR可被脂肪酸和LPL脂質(zhì)分解激活，從而引發(fā)脂質(zhì)積聚過(guò)程[17]。此外，據(jù)報(bào)道 在LPL基因的啟動(dòng)子位點(diǎn)存在過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體反應(yīng)元件(PPRE)，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞中LPL的表達(dá)[18]。 體內(nèi)外的研究表明，PPARγ可啟動(dòng)表達(dá)將前體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成熟脂肪細(xì)胞所需的基因，是脂肪生成所必須的調(diào)節(jié)劑。

脂蛋白脂肪酶(LPL)是脂肪酶基因家族的一員，可以水解脂蛋白中的甘油三酯，參與調(diào)解脂肪酸代謝，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)脂蛋白、脂質(zhì)和脂溶性維生素的吸收，是影響血脂水平的重要脂質(zhì)代謝酶[19]。LPL主要分布在脂肪和肌肉組織中，其在大腦中也高表達(dá)。然而，目前對(duì)LPL在大腦中的作用知之甚少，仍在研究之中。大腦神經(jīng)元對(duì)脂蛋白的吸收與突觸結(jié)構(gòu)和功能的完整性有關(guān)，因此LPL促進(jìn)脂蛋白在腦內(nèi)的吸收有著重要的作用。有研究表明，LPL可以與載脂蛋白E及其受體、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1(low-density lipoprotein receptor-related protein 1，LRP1)結(jié)合，并出現(xiàn)在AD模型的老年斑中。在星形膠質(zhì)細(xì)胞中，LPL可以結(jié)合β淀粉樣蛋白(Aβ)，并促進(jìn)Aβ的吸收及清除[20]。這些結(jié)果都提示LPL在大腦中具有重要的生理作用，其改變可能和大腦的學(xué)習(xí)記憶損傷有關(guān)。

綜上，本研究結(jié)果表明， VD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力降低，腦內(nèi)出現(xiàn)脂質(zhì)代謝紊亂，F(xiàn)ABP5、PPARγ、p-PPARγ及LPL在轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平上均顯著降低；當(dāng)對(duì)WT鼠給予FABP5抑制劑處理后，WT大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力顯著降低，F(xiàn)ABP5、PPARγ、p-PPARγ及LPL的表達(dá)也明顯減少，提示FABP5可能通過(guò)FABP5- PPARγ-LPL影響大鼠腦內(nèi)的脂質(zhì)代謝，進(jìn)而影響其學(xué)習(xí)記憶能力。