模擬海拔5 500 m低壓低氧環(huán)境對大鼠HPT軸和腸道菌群的影響*

謝亞磊， 梅 頌， 熊艷蕾， 劉詩穎， 徐成麗

((中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院， 北京 100005)

平原人快速進入高海拔地區(qū)會產(chǎn)生低氧應(yīng)激，使心腦肺等重要臟器功能、循環(huán)和神經(jīng)系統(tǒng)等發(fā)生一系列適應(yīng)性變化，對低氧應(yīng)激失代償時進展為急性高原病，甚至危及生命[1]。諸多研究發(fā)現(xiàn)低氧環(huán)境下機體神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)中下丘腦-垂體-甲狀腺(hypothalamus-pituitary- thyroid, HPT)軸通過調(diào)節(jié)甲狀腺激素(thyroid hormone, TH)的合成分泌參與機體各項生理功能的調(diào)節(jié)。腸道微生物群組成與宿主諸多生理功能密切相關(guān)[2]。微生物與宿主在代謝、免疫和內(nèi)分泌方面的相互作用尤為密切[2]。已有研究發(fā)現(xiàn)高原居民腸道菌群中梭菌屬、脫硫弧菌屬、類桿菌屬、乳酸桿菌屬和普雷沃氏菌屬與平原居民有顯著差異[3]。一項以7名登山者為對象的研究發(fā)現(xiàn)，海拔5 000 m高度時腸道中變形菌和大腸桿菌的γ細菌等潛在致病菌數(shù)量增加，雙歧桿菌和阿托波氏菌屬，科里氏桿菌屬等數(shù)量降低[4]。但尚無研究探討低氧環(huán)境下HPT軸與腸道菌群間的聯(lián)系。腸道微生物能夠通過自分泌或者代謝腸道內(nèi)容物，產(chǎn)生諸多化學(xué)物質(zhì)，如激素、脂肪酸等，通過循環(huán)系統(tǒng)參與機體各項生理活動[5]。腸道微生物可能通過調(diào)節(jié)代謝產(chǎn)物參與宿主生理活動。因此，我們將通過構(gòu)建低氧動物模型，探究高海拔低壓低氧環(huán)境下機體甲狀腺功能與腸道菌群的變化及兩者間關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 材料

無特殊病原菌級SD健康成年雄性大鼠，體重(321±13)g，10周齡，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[許可證號：SCXK(京)2016-0006]。飼養(yǎng)環(huán)境為自然光照，溫度為(20±4)℃，濕度為30%～60%，全價大鼠維持飼料購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司，飲用自來水，自由飲食。大鼠隨機分組為常氧對照組和低氧實驗組，共計16組大鼠，每組8只。大鼠血清HPT軸激素水平使用武漢CUSABIO公司的TRH(CSB-E08040r)、TSH(CSB-E05115r)、TT4(CSB-E05082r)、TT3(CSB-E05085r)、FT4(CSB-E05079r)和FT3(CSB-E05076r)試劑盒檢測。大鼠腸道菌群DNA使用德國QIAGNE公司PowerFecal DNA Kit(12830-50)試劑盒提取。腸道菌群16s rDNA測序由北京諾禾致源科技股份有限公司采用Illumina Hiseq技術(shù)測序平臺完成。

1.2 低氧動物模型的構(gòu)建

低氧組大鼠被放置于低壓低氧模擬艙(貴州風(fēng)雷航空軍械有限公司，F(xiàn)LYDWC50-IIC)，以平均9 m/s的速度升至海拔5 500 m(空氣O2含量10%，379 mmHg)，根據(jù)實驗設(shè)計模擬不同時間的持續(xù)低氧(1，3，7，14，21和28 d)，1 d和3 d恢復(fù)組(1-R、3-R)分別為持續(xù)低氧1 d和3 d后常氧恢復(fù)一周。持續(xù)低氧期間，每天固定時間開艙20 min，進行飲食添加、更換墊料、記錄體重和攝食。對照組大鼠飼養(yǎng)于常氧環(huán)境(北京，海拔52 m，氣壓760 mmHg)。

1.3 動物組織樣品采集

持續(xù)低氧結(jié)束后，各組隨機選擇6只大鼠取樣。戊巴比妥鈉水溶液腹腔注射麻醉。麻醉徹底后，迅速開腹，取直腸末端大便，置于凍存管中液氮凍存。心臟采血并離心分裝血清，-80℃保存。ELISA檢測大鼠血清甲狀腺激素水平。

1.4 腸道菌群16s rDNA測序與分析

提取大鼠腸道菌群DNA，以16S rDNA的V4區(qū)為待測序區(qū)域，進行文庫構(gòu)建，上機測序(北京諾禾致源科技股份有限公司，Illumina Hiseq技術(shù)測序平臺)。整理測序數(shù)據(jù)后，得到最終有效數(shù)據(jù)。腸道菌群物種注釋通過QIIME軟件(version 1.9.1)分析，以97%的一致性聚類為OTUs(Operational Taxonomic Units)。對OTUs代表序列與Greengene數(shù)據(jù)庫(http://greengenes.secondgenome.com/)比對并進行物種注釋，并根據(jù)物種注釋結(jié)果，統(tǒng)計腸道菌群相對豐度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 實驗期間大鼠體重及攝食量監(jiān)測

大鼠體重和攝食量的監(jiān)測顯示，與常氧組相比，各低氧組大鼠低氧1 d后體重顯著下降(P<0.01)，進食明顯減少。動態(tài)監(jiān)測28 d組大鼠體重及攝食量發(fā)現(xiàn)，隨低氧暴露時間延長，低氧組大鼠體重及攝食量逐漸增加，但仍顯著低于對照組。低氧恢復(fù)組大鼠體重及攝食量常氧7 d后恢復(fù)至對照組水平。各組大鼠體重及攝食量變化如表1所示。

Tab. 1 Weight and food intake of SD rats after different hypoxia exposure times (g, n=8)

2.2 模擬海拔5 500 m環(huán)境對大鼠HPT軸激素的影響

大鼠HPT軸激素水平檢測顯示，與常氧組相比，1、3、14、21和28 d低氧組TRH顯著降低(P< 0.05)，1 d和3 d恢復(fù)組則有所恢復(fù)；1和28 d低氧組TSH顯著下降(P<0.01)。1、14和28 d低氧組TT4及TT3顯著增加(P<0.05)。1 d恢復(fù)組TT4未恢復(fù)、TT3恢復(fù)。3 d低氧組TT4顯著降低(P< 0.01)且可恢復(fù)。21 d低氧組TT4顯著增加(P< 0.01)。1 d低氧組FT4及FT3顯著增加(P< 0.05)，7 d低氧組顯著降低(P<0.05)。1 d恢復(fù)組FT4恢復(fù)。低氧1 d恢復(fù)組FT3含量顯著低于對照組水平(P<0.01)，3 d低氧恢復(fù)組FT3含量顯著高于對照組(P<0.05)，其余指標無顯著差異。HPT軸激素含量如圖1所示。

Fig. 1 Effects of hypobaric and hypoxia environment at the simulated altitude of 5500 m on serum HPT axis hormones in n=6)

2.3 模擬海拔5 500 m環(huán)境對大鼠腸道菌群的影響

大鼠腸道菌群的鑒定，共鑒定出330個菌屬，相對豐度具有顯著性差異(P<0.05)的菌屬共計12個，如圖2所示。與常氧組相比，各低氧組副擬桿菌屬豐度顯著增加(P<0.05)，1 d恢復(fù)組未恢復(fù)，3 d恢復(fù)組恢復(fù)。1 d低氧組乳酸桿菌屬豐度顯著增加(P<0.05)，且恢復(fù)組完全恢復(fù)，7、14和21 d低氧組顯著降低(P<0.05)。球毛菌屬、阿克曼氏菌屬豐度在低氧14、21和28 d后顯著增加(P<0.05)。迷蹤菌屬豐度在低氧7、14、21和28 d后顯著增加(P< 0.05)。丁酸球菌屬、擬桿菌屬、臭味桿菌屬和RC4-4菌屬豐度在低氧1天和3 d后顯著增加(P<0.05)，且1和3 d恢復(fù)組丁酸球菌屬及臭味桿菌屬豐度可恢復(fù)。擬桿菌屬豐度僅3 d恢復(fù)組可恢復(fù)，RC4-4菌屬豐度僅1 d恢復(fù)組可恢復(fù)。21 d低氧組丁酸球菌屬豐度顯著增加(P<0.05)；28 d低氧組臭味桿菌屬豐度顯著增加(P<0.05)。薩特氏菌屬豐度僅在低氧14 d后顯著降低(P<0.01)。普氏菌屬豐度僅在低氧3 d及28 d后顯著降低(P<0.05)。[普氏菌屬]豐度在低氧3 d后顯著降低(P<0.05)，低氧28 d后顯著增加(P<0.05)，1 d和3 d恢復(fù)組仍顯著高于對照組(P<0.01)。

2.4 模擬海拔5 500 m環(huán)境下大鼠血清HPT軸激素與腸道菌群相關(guān)分析

分析低氧組大鼠12種存在顯著差異的腸道菌屬與大鼠血清HPT軸激素的相關(guān)性，結(jié)果如圖3所示。阿克曼氏菌屬與TRH顯著負相關(guān)(r=-0.37,P=0.01)，與FT4顯著正相關(guān)(r=0.516,P<0.01)。擬桿菌屬與FT4顯著負相關(guān)(r=-0.305,P= 0.035)。丁酸球菌屬與TRH和TSH顯著負相關(guān)(r=-0.596,P<0.01;r<-0.474,P<0.01)。乳酸桿菌屬與TRH和TSH顯著正相關(guān)(r=0.57,P<0.001;r=0.472,P=0.01)，與FT4顯著負相關(guān)(r=-0.296,P=0.041)。臭味桿菌屬與TT3顯著負相關(guān)(r= -0.287,P=0.048)。副擬桿菌屬與FT4顯著正相關(guān)(r=0.313,P=0.030)。RC4-4與TSH和TT3顯著正相關(guān)(r=0.416,P=0.003;r=0.414,P= 0.003)。普氏菌屬與TSH顯著負相關(guān)(r=-0.328,P=0.023)。迷蹤菌屬與TRH和TSH顯著負相關(guān)(r=-0.35,P=0.015;r=-0.483,P=0.01)。薩特氏菌屬與TRH和TSH顯著負相關(guān)(r=-0.314,P=0.03;r=-0.327,P=0.023)(圖3見彩圖頁Ⅲ)。

Fig. 2 Effects of hypobaric and hypoxia environment at the simulated altitude of 5500 m on serum HPT axis hormones in rats n=6)

3 討論

大鼠體重和攝食量均在模擬海拔5 500 m環(huán)境下第1日后顯著下降。隨低壓低氧時間的延長，體重及攝食量逐漸增加，但仍低于對照組，說明低壓低氧引起大鼠體重下降。1 d和3 d急性低氧后，再在常氧環(huán)境中恢復(fù)7 d，體重及攝食量能夠恢復(fù)至常氧對照組水平，說明急性低氧引起的體重降低能夠在常氧環(huán)境中恢復(fù)。體重的降低是由于低氧環(huán)境下靜息代謝率增加導(dǎo)致的能量失衡，而靜息代謝率的增加與低氧應(yīng)激時交感神經(jīng)系統(tǒng)活性增加及甲狀腺功能亢進有關(guān)[6]。靜息代謝率是指機體在靜息狀態(tài)下維持正常生理功能所需能量。除能量消耗增加外，低壓低氧環(huán)境中神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)變化導(dǎo)致的食欲降低也同樣導(dǎo)致體重的下降[7]。

血清HPT軸激素檢測結(jié)果提示，急性低壓低氧環(huán)境使大鼠甲狀腺功能處于亢進狀態(tài)，F(xiàn)T3、FT4和TT3、TT4水平均顯著增加，TSH和TRH水平則由于HPT軸的負反饋調(diào)節(jié)而顯著下降。急性低氧恢復(fù)組數(shù)據(jù)說明，急性低氧后大鼠可在常氧環(huán)境中恢復(fù)至正常對照組水平。隨著低氧時間延長，大鼠逐漸習(xí)服低氧環(huán)境，甲狀腺激素水平也逐漸恢復(fù)至對照組水平。HPT軸中TRH、TSH、TT4和TT3含量也在低氧7 d后逐漸恢復(fù)至對照組水平。慢性低氧暴露組TRH和TSH含量顯著低于對照組，而TT4和TT3含量顯著高于對照組，F(xiàn)T3和FT4與對照組相比則無顯著差異，說明大鼠逐漸適應(yīng)低氧環(huán)境，甲狀腺功能亢進狀態(tài)逐漸恢復(fù)。慢阻肺患者長期低氧對下丘腦和垂體存在抑制作用，而血清T3和T4含量則正常[8]。模擬海拔6 900 m低氧5周的大鼠實驗發(fā)現(xiàn)，血清TSH顯著升高，T3和T4含量顯著下降[9]。

副擬桿菌屬是腸道菌群中主要菌屬之一。其豐度與肥胖負相關(guān)，與脂肪組織產(chǎn)熱增加、腸道完整性增強、炎癥和胰島素抵抗水平降低有關(guān)[10]。低氧組副擬桿菌屬豐度均顯著增加，可能與大鼠體重降低和維持腸道屏障有關(guān)。擬桿菌屬是哺乳動物腸道菌群重要組成部分，通過分泌膽汁酸鹽水解酶參與膽汁酸代謝，有助于降低血清膽固醇，參與宿主免疫調(diào)節(jié)[11]。急性低氧組擬桿菌屬豐度均顯著增加，可能與大鼠急性低氧應(yīng)激下免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。RC4-4為蛋白胨球菌科，其豐度與循環(huán)水平氨基酸、膽堿顯著負相關(guān)，與膽固醇、脂肪酸顯著正相關(guān)[12]。低氧組RC4-4菌屬豐度均顯著增加可能參與大鼠代謝調(diào)節(jié)。丁酸球菌屬產(chǎn)丁酸、異丁酸，屬于紫單胞菌科。二甲雙胍能顯著增加高脂飲食肥胖模型小鼠腸道中丁酸球菌屬豐度[13]。該菌屬可能影響大鼠在低氧環(huán)境下的代謝調(diào)節(jié)。臭味桿菌屬屬擬桿菌門，產(chǎn)丁酸鹽，代謝綜合征患者腸道中豐度顯著降低[14]。低氧應(yīng)激引起的臭味桿菌屬豐度顯著增加同樣可能參與大鼠代謝調(diào)節(jié)。普氏菌屬在腸道菌群中占比較大，與植物性飲食相關(guān)[15]，其豐度增加與高纖維飲食介導(dǎo)的糖代謝改善有關(guān)。低氧環(huán)境人體腸道中普氏菌屬豐度顯著降低[16]。本實驗結(jié)果與上述研究一致。

薩特氏菌屬為變形菌門，代謝綜合征患者中豐度較高，與總膽固醇顯著正相關(guān)，與丁酸鹽和改善肝損傷的鯊烯和硬脂酸顯著正相關(guān)，促進糖尿病癥狀改善[14]。其豐度僅在14 d低氧后顯著降低，其他各低氧組均無顯著差異，由散點圖推測可能是對照組存在極端值所致。阿克曼氏菌屬為疣微菌門，參與維持腸道屏障完整性，是已知益生菌，影響葡萄糖代謝、脂質(zhì)代謝和腸道免疫[17]。已有研究發(fā)現(xiàn)阿克曼氏菌屬為高海拔地區(qū)藏羚羊腸道菌群中優(yōu)勢菌屬[18]。乳酸桿菌屬和阿克曼氏菌屬相對豐度的變化與低氧應(yīng)激時間有關(guān)。乳酸桿菌屬為已知重要益生菌，慢性低氧大鼠模型(氧含量10%，低氧21 d)腸道乳酸桿菌豐度顯著降低，與本實驗研究結(jié)果一致[19]。而另一項以低氧暴露30 d(每日低氧8 h)大鼠為對象的研究則發(fā)現(xiàn)腸道中乳酸桿菌屬豐度顯著增加[20]。該結(jié)果可能與大鼠低氧暴露時間較短有關(guān)。球毛菌屬為螺旋體科，生長發(fā)育遲緩的小牛被補充益生菌后，該菌屬豐度顯著增加[21]，尚未發(fā)現(xiàn)低氧相關(guān)報道。迷蹤菌屬是迷蹤菌門中唯一已知菌屬，僅E.minutum1個菌種，被認為是益生菌，可以改善腸道菌群的失調(diào)[22]，尚未發(fā)現(xiàn)低氧相關(guān)報道。本實驗研究發(fā)現(xiàn)慢性低氧組大鼠球毛菌屬和迷蹤菌屬相對豐度顯著增加。

相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)低氧環(huán)境下大鼠腸道菌群中已知顯著差異菌屬與血清中HPT軸激素存在顯著相關(guān)性。有研究發(fā)現(xiàn)，通過放射性碘攝取分析顯示，經(jīng)抗生素處理的大鼠的甲狀腺功能降低[23]。與正常腸道菌群的小鼠相比，無菌小鼠TSH顯著增加[24]。甲狀腺功能減退的橋本氏甲狀腺炎患者腸道中擬桿菌屬豐度顯著增加，普氏菌屬豐度顯著降低[25]。但是菌屬豐度變化與該研究中高濃度TSH和低濃度TT4、TT3的相關(guān)性并沒有被揭示。以甲狀腺癌和甲狀腺結(jié)節(jié)患者為對象的研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照相比，患者腸道中普氏菌屬顯著增加，丁酸球菌屬、擬桿菌屬、乳酸桿菌屬和薩特氏菌屬顯著降低，且FT3與擬桿菌屬和乳酸桿菌屬顯著負相關(guān)[26]。相關(guān)性結(jié)果提示腸道菌群可能通過影響代謝產(chǎn)物進而影響宿主甲狀腺功能，但是具體分子調(diào)節(jié)機制仍需進一步探索。