多巴胺對(duì)急性間歇性低氧誘導(dǎo)的大鼠頸動(dòng)脈體低氧敏感性的影響*

賈祥磊, 劉玉珍, 李超紅, 范婭楠

((1. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院， 2. 河南省神經(jīng)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 新鄉(xiāng) 453100)

頸動(dòng)脈體是重要的外周血?jiǎng)用}氧分壓感受器，主要由I型細(xì)胞和II型細(xì)胞組成。I型細(xì)胞聚集成簇，是氧敏感細(xì)胞，含有多種神經(jīng)遞質(zhì)，與竇神經(jīng)傳入纖維末梢形成突觸連接。頸動(dòng)脈體對(duì)外周血氧的變化有較高敏感性，在低氧條件下，竇神經(jīng)活動(dòng)增強(qiáng)，去除低氧后，竇神經(jīng)活動(dòng)恢復(fù)正常[1]。阻塞性睡眠呼吸暫停(obstructive sleep apnea, OSA)患者長(zhǎng)期睡眠中處于低氧狀態(tài)，竇神經(jīng)的活動(dòng)增加。研究表明，慢性間歇性低氧引起的交感神經(jīng)活性增加和OSA 患者出現(xiàn)的血壓升高有關(guān)[2]。研究表明，在阻塞性睡眠呼吸暫停綜合癥的發(fā)病早期，患者在睡眠中處于一個(gè)急性間歇性低氧階段。在研究中發(fā)現(xiàn)，模擬高碳酸血癥患者的模型實(shí)驗(yàn)中，給予頸動(dòng)脈體急性間接性低氧，頸動(dòng)脈體的放電活動(dòng)增加，產(chǎn)生長(zhǎng)時(shí)程易化的現(xiàn)象，說(shuō)明在急性間歇性低氧刺激頸動(dòng)脈體可以產(chǎn)生可塑性[3]。在低氧條件下，可激活酪氨酸羥化酶，作為酪氨酸羥化酶下游產(chǎn)物的多巴胺以遞質(zhì)形式從細(xì)胞中分泌，從I型細(xì)胞分泌到突觸間隙，作用于竇神經(jīng)。本實(shí)驗(yàn)?zāi)MOSA 患者早期癥狀，給予頸動(dòng)脈體急性間歇性低氧后，再次給予頸動(dòng)脈體低氧時(shí)，記錄竇神經(jīng)放電活動(dòng)是否發(fā)生改變，多巴胺在可塑性中起到何作用。旨在為多巴胺在早期OSA中如何調(diào)控頸動(dòng)脈體-竇神經(jīng)的活動(dòng)生理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重220～280 g，每籠5只飼養(yǎng)。攝食飲水自由。墊料每周清掃更換一次。

1.2 緩沖液

NaCl 118 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，KH2PO41.2 mmol/L，MgSO41.6 mmol/L，NaHCO325 mmol/L，Glucose 5.6 mmol/L，CaCl22.5 mmol/L(生工生物工程股份有限公司)，多巴胺(上海禾豐制藥有限公司)，異氟烷(瑞沃德生命科技有限公司)

1.3 電信號(hào)記錄系統(tǒng)

八通道電生理信號(hào)采集系統(tǒng)Powerlab(Adinstruments公司)

1.4 分離頸動(dòng)脈體-竇神經(jīng)

用異氟烷麻醉動(dòng)物后斷頭，快速分離出頸動(dòng)脈分叉。移至冰的緩沖液中，在體視鏡下，將頸動(dòng)脈體-竇神經(jīng)分離出來(lái)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容分為急性間歇低氧(acute intermittent hypoxia, AIH)之前給低氧為Pre，AIH之后第一次給低氧為Post，AIH后第三次低氧為3 th ，AIH之前低氧和多巴胺為Pre 5%O2+Dopamine，AIH之后給予低氧和多巴胺為Post 5%O2+Dopamine。組內(nèi)各指標(biāo)進(jìn)行比較。

1.5 竇神經(jīng)電信號(hào)記錄

將分離的竇神經(jīng)和頸動(dòng)脈體移入37℃灌流槽(6 ml/min)，緩沖液充入氣體飽和(95% O2+5% CO2)，然后把分離的竇神經(jīng)吸入到記錄的玻璃電極中(電極尖端直徑約100 μm)。在低氧記錄中飽和的氣體為5%O2+5%CO2+90%N2平衡。根據(jù)參考文獻(xiàn)[4]，最終記錄中使用多巴胺的濃度為100 μmol/L。

1.6 急性間歇性低氧

5% O2+5% CO2+90% N2的緩沖液30 s，95 %O2+5% CO2的緩沖液90 s，2 min一個(gè)循環(huán)，共10個(gè)循環(huán)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 急性間歇性低氧對(duì)頸動(dòng)脈體低氧敏感性的影響

如圖1A所示，記錄竇神經(jīng)基礎(chǔ)放電10 min，給予低氧刺激，竇神經(jīng)的活動(dòng)增加。10 min過(guò)后，給予急性間歇性低氧循環(huán)，10個(gè)循環(huán)，共20 min。給予急性間歇性低氧結(jié)束10 min后，再給予多次低氧刺激，刺激間隔10 min，AIH后第一次低氧記為Post，第二次低氧為 2 nd。圖1B所示，給予急性間歇性低氧后(Post)，竇神經(jīng)較Pre對(duì)低氧的放電活動(dòng)增加。給予急性間歇性低氧前的低氧刺激(Pre)為基準(zhǔn)，標(biāo)化為100%，給予急性間歇性低氧應(yīng)激后，竇神經(jīng)對(duì)低氧的反應(yīng)增加2.5倍(267±61vs100±21，圖1C)。

Fig. 1 Increased sensitivity of sinus nerve to hypoxia stress after acute intermittent hypoxia stress

2.2 多巴胺對(duì)急性低氧應(yīng)激后頸動(dòng)脈體低氧敏感性的影響

如圖2A中所示，AIH之前給低氧為Pre，AIH之后第一次給低氧為Post，AIH之后給予低氧和多巴胺為5%O2+Dopamine，Post后第三次低氧為3 th。如圖2B所示，5%O2+Dopamine較Post，發(fā)現(xiàn)竇神經(jīng)給予多巴胺(100 μmol/L)后，可以抑制竇神經(jīng)的活動(dòng)。給予急性間歇性低氧前的低氧(Pre)刺激為基準(zhǔn)，標(biāo)化為100%，如圖2C所示，Post與Pre比較，說(shuō)明竇神經(jīng)對(duì)低氧的反應(yīng)增加。但加入多巴胺后，從5%O2+Dopamine(27±5)與Post(272±54)比較，說(shuō)明多巴胺抑制了這種增強(qiáng)。洗脫多巴胺之后(3 th)，竇神經(jīng)放電增強(qiáng)。

Fig. 2 Dopamine inhibits the sensitivity of carotid body to hypoxia after acute hypoxia stress

2.3 多巴胺對(duì)急性間歇性缺氧后竇神經(jīng)放電抑制作用的影響

如圖3A所示，AIH之前給低氧為Pre，AIH之后給低氧為Post，AIH之前低氧和多巴胺為Pre 5%O2+Dopamine，AIH之后給予低氧和多巴胺為Post 5%O2+Dopamine。如圖3B所Pre 5%O2+Dopamine與Post 5%O2+Dopamine相比較(72±8vs24±3)，當(dāng)頸動(dòng)脈體給予急性間歇性低氧后(圖3A所示AIH)，Post 5%O2+Dopamine條件下的竇神經(jīng)放電活動(dòng)減弱，說(shuō)明多巴胺更加抑制竇神經(jīng)的活動(dòng)。

Fig. 3 Dopamine inhibits carotid body's hypoxia sensitivity enhancement after acute hypoxia stress

3 討論

低氧對(duì)機(jī)體的影響是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，慢性間斷性低氧大鼠認(rèn)知功能減退，且前額葉皮層和海馬神經(jīng)元病理性損傷[5]，包括機(jī)體的免疫機(jī)能也受到低氧的影響[6]。阻塞性睡眠呼吸暫停綜合癥就是睡眠中長(zhǎng)期氧氣低通量病癥，但對(duì)于早期的患者是處于急性低氧期。那么，急性間歇性低氧對(duì)于頸動(dòng)脈體活動(dòng)是否有影響，對(duì)此本文進(jìn)行了探討。

研究表明，頸動(dòng)脈體為重要的外周化學(xué)感受器，主要功能是感受動(dòng)脈血氧分壓的變化，通過(guò)竇神經(jīng)，反射性地對(duì)呼吸系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)。頸動(dòng)脈體可以瞬間感知機(jī)體氧濃度的變化，并迅速做出反應(yīng)[7]。本實(shí)驗(yàn)中給予頸動(dòng)脈體急性間歇性低氧刺激，頸動(dòng)脈體對(duì)低氧的敏感性增強(qiáng)，竇神經(jīng)的放電活動(dòng)增加。說(shuō)明急性間歇性低氧應(yīng)激可以改變頸動(dòng)脈體對(duì)低氧反應(yīng)，急性間歇性低氧使頸動(dòng)脈體出現(xiàn)可塑性。

多巴胺受體在中樞系統(tǒng)廣泛表達(dá)，屬于G蛋白耦聯(lián)受體家族。多巴胺受體可分為D1類和D2類受體。D1類受體包括D1和D5受體(在大鼠也稱D1A和D1B受體)，D2類受體包括D2，D3和D4受體。D1類受體激活后升高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，D2類受體激活后降低細(xì)胞內(nèi)cAMP水平[8]。在中樞系統(tǒng)海馬區(qū)，阻斷多巴胺受體可以使大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力降低。CA1區(qū)在D1受體基因敲除小鼠的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)完全消失，小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力明顯受損[9, 10]。多巴胺受體在頸動(dòng)脈體中也有表達(dá)，參與對(duì)低氧的調(diào)控[11]。Gonzalez等在兔的頸動(dòng)脈體實(shí)驗(yàn)上證明，多巴胺在頸動(dòng)脈體細(xì)胞內(nèi)合成，儲(chǔ)存，當(dāng)給予5 min低氧刺激后，檢測(cè)孵育液，發(fā)現(xiàn)多巴胺作為遞質(zhì)從細(xì)胞分泌，多巴胺是一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)參與到頸動(dòng)脈體對(duì)低氧的反應(yīng)中[12, 13]。后來(lái)， Iturriaga等在貓和大鼠中也證明多巴胺的存在，但是研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)給予離體灌流頸動(dòng)脈體低氧刺激，多巴胺外流增加在竇神經(jīng)放電快速增加后延遲出現(xiàn)，重復(fù)低氧灌流低氧刺激頸動(dòng)脈體，竇神經(jīng)放電增加而多巴胺的釋放量卻在減少[14]。但是，也有人認(rèn)為，多巴胺受體在頸動(dòng)脈體低氧調(diào)控中起到雙重作用，發(fā)現(xiàn)給予低氧刺激頸動(dòng)脈體多巴胺受體表達(dá)上調(diào)，而在孤束核多巴胺受體下調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)在發(fā)育中的大鼠，多巴胺的激活可抑制N-型鈣離子通道的活動(dòng)，抑制神經(jīng)放電活動(dòng)[15]。本研究結(jié)果表明，在外源性的多巴胺存在時(shí)，對(duì)竇神經(jīng)放電呈現(xiàn)抑制作用。而給予急性間歇性低氧處理后，在多巴胺的存在下較急性間歇性低氧前更加抑制竇神經(jīng)活動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)施加急性間歇性低氧應(yīng)激后，頸動(dòng)脈體上的功能性多巴胺受體可能增多，從而更加的抑制竇神經(jīng)的活動(dòng)。給予外源性多巴胺，作用突觸后D2R受體上，可導(dǎo)致AC抑制，細(xì)胞內(nèi)cAMP減少引起電流抑制，導(dǎo)致膜興奮性降低，從而減弱突觸傳遞。Dopamine也可能在突觸前抑制，通過(guò)負(fù)反饋抑制細(xì)胞Ca2+電流降低神經(jīng)的興奮傳遞。另外，當(dāng)給予外源性多巴胺時(shí)，通過(guò)抑制cAMP，而抑制ATP通過(guò)P2x2/3受體對(duì)突觸后的興奮作用[16]。關(guān)于多巴胺如何調(diào)控頸動(dòng)脈體-竇神經(jīng)的活動(dòng)還需進(jìn)一步研究。

對(duì)于阻塞性睡眠呼吸暫停綜合癥早期患者來(lái)說(shuō)，還未達(dá)到阻塞性睡眠呼吸暫停的病理指征，但患者睡眠中存在短暫的急性間歇性低氧現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)急性間歇性低氧后，再給予低氧刺激時(shí)頸動(dòng)脈體的活動(dòng)加強(qiáng)。早期的患者睡眠中急性間歇性低氧，低氧期間竇神經(jīng)的活動(dòng)較急性間歇性低氧應(yīng)激前增加，從而進(jìn)一步調(diào)節(jié)交感神經(jīng)興奮[17]，因此對(duì)于有高血壓基礎(chǔ)等疾病的患者，可能增加睡眠中猝死風(fēng)險(xiǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，多巴胺可以抑制急性間歇性低氧后竇神經(jīng)放電活動(dòng)，但是否能用多巴胺來(lái)調(diào)節(jié)早期阻塞性睡眠呼吸暫停患者睡眠中竇神經(jīng)活動(dòng)的興奮性，需進(jìn)一步驗(yàn)證。