消痰化瘀利竅中藥組方對(duì)改善慢性間歇性低氧大鼠心肌纖維化的作用及其機(jī)制*

李杰茹， 任 靜， 楊勝昌， 韓聚強(qiáng)， 郭亞凈， 吉恩生

((河北中醫(yī)學(xué)院生理教研室， 石家莊 050020)

心肌纖維化是以間質(zhì)成纖維細(xì)胞增生，以Ⅰ型膠原蛋白(collagenⅠ)和Ⅲ型膠原蛋白(collagen Ⅲ)為特征的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)過度沉積，是許多心血管病變進(jìn)展到特定階段的共同表現(xiàn)[1，2]。近年來臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，阻塞性睡眠呼吸暫停(obstructive sleep apnea, OSA)引起的慢性間歇性低氧(chronic intermittent hypoxia，CIH)亦可誘發(fā)心肌纖維化，是心肌纖維化的危險(xiǎn)因素[3-5]。OSA是一種睡眠狀態(tài)下反復(fù)出現(xiàn)呼吸暫停，是以患者血液中長期CIH為主要病理改變的呼吸障礙性疾病。OSA在現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)被稱為“鼾眠病”， 是由痰濕、血瘀、氣虛所致，其涉及到的臟腑病變主要是肺、脾胃、腎[6]。消痰化瘀利竅中藥組方是在臨床實(shí)踐中針對(duì)OSA患者脾虛失運(yùn)、肺氣失宣、痰阻血瘀的臟腑病變，以及疾病成因總結(jié)出的經(jīng)驗(yàn)組方，可有效緩解鼾癥，改善患者白天嗜睡、頭疼、血壓高、醒后乏力等臨床癥狀。前期研究證實(shí)，消痰化瘀利竅中藥組方具有抑制CIH大鼠心肌纖維化的作用，但具體作用機(jī)制尚不明確[7]。研究表明，TGF-β1是導(dǎo)致心肌纖維化最重要的因子之一[8]。因此，本研究利用CIH大鼠模型，模擬OSA病人缺氧復(fù)氧環(huán)境，觀察該中藥組方對(duì)改善慢性間歇性低氧性心肌纖維化的作用，并從TGF-β信號(hào)通路來探討其可能機(jī)制。為該中藥組方在臨床上應(yīng)用于改善OSA引發(fā)的心肌纖維化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 中藥消痰化瘀利竅組方的配制

生藥成分由丹參30 g、法半夏12 g、陳皮10 g、茯苓15 g、生黃芪 15 g、炒白術(shù)12 g、石菖蒲12 g、郁金12 g、射干12 g、 白芥子10 g、桔梗12 g、枳殼15 g、川芎12 g、赤芍15 g、地龍12 g 組成，以水煮醇沉法制備成含生藥濃度為2.4 g/ml的湯劑。組方中的中藥材購買于神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

40只清潔級(jí)雄性SD大鼠，購買于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，體重( 240±20) g，動(dòng)物許可證號(hào): SCXK [京]2016-0006。

1.3 試劑

兔抗鼠TGF-β抗體、兔抗鼠Smad2抗體、兔抗鼠Smad3抗體、兔抗鼠collagenⅠ抗體、兔抗鼠collagen Ⅲ抗體及兔抗鼠Tublin單克隆抗體均購于武漢賽維爾生物科技有限公司；天狼星紅染色染色試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及處理

新購的SD大鼠，在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)喂養(yǎng)一周后，選取40只，按簡單隨機(jī)法隨機(jī)分為4 組: 常氧組(Normoxia)、常氧+中藥干預(yù)組(Traditional Chinese medicine Compound，TCMC)、CIH模型組(CIH)、CIH模型+中藥干預(yù)組(TCMC+CIH)。遵循大鼠晝伏夜出的生活習(xí)性，在白天大鼠睡眠時(shí)間進(jìn)行CIH造模，CIH組和TCMC+CIH組的大鼠艙內(nèi)氧體積分?jǐn)?shù)在90 s內(nèi)從21%下降到9%，隨后90 s再充氧后逐漸上升到21%。暴露周期每180 s重復(fù)一次，每天8 h(9:00-17:00)，持續(xù)3周[9]。此外，消痰化瘀利竅中藥組方的中草藥經(jīng)“水煮醇沉法”制備完畢后，以每日24 g/kg的劑量(依據(jù)中藥藥理研究方法學(xué)的大鼠與臨床藥物劑量匹配值，計(jì)算該藥物在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體的有效劑量)給予TCMC+CIH 與TCMC兩組的大鼠灌胃服用，此外CIH與Normoxia 兩組大鼠在同一時(shí)段被灌服等體積生理鹽水。21 d后，四組實(shí)驗(yàn)大鼠禁食12 h。次日上午用戊巴比妥(100 mg /kg, i.p.i.)依次麻醉各組實(shí)驗(yàn)大鼠，開胸取出心臟用PBS液灌流后，切取左心室為取材樣品，將所得的左心室分為兩部分，一部分置于4%的多聚甲醛液中固定，備用于天狼星紅染色，另一部分放入-80℃冰箱中保存，供Western blot，Q-PCR檢測。

1.5 心臟膠原蛋白染色

采用天狼星紅染色法觀察心臟組織膠原蛋白的沉積。取適量心肌組織置于4%多聚甲醛液中固定48 h，而后酒精梯度脫水、石蠟包埋，連續(xù)6 μm切片，制作心肌組織石蠟切片備用。天狼猩紅色染色時(shí)，取備用的心肌石蠟白片，常規(guī)脫蠟、依次梯度水化，天狼星紅染色液滴染1 h，流水稍沖洗，去除切片表面染液，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封固。染色結(jié)果，常規(guī)顯微鏡可觀察心肌膠原纖維被染成紅色,心肌組織被染成黃色，或者無色。 偏振光顯微鏡下可以區(qū)分I型和III型膠原。

1.6 Western blot 檢測蛋白表達(dá)

將適量心肌組織剪碎，加入組織裂解液，低溫超聲破碎制成勻漿，4℃環(huán)境下以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，取上清，用 BCA 法測定蛋白濃度，制成蛋白樣品。取適量蛋白上樣，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉 90 min，TBST液，然后分別給予1∶500 稀釋的兔抗大鼠 TGF-β抗體、兔抗大鼠Smad2/3 抗體、兔抗大鼠p-Smad2/3 抗體兔抗大鼠、兔抗大鼠 CollagenⅠ抗體、兔抗大鼠 Collagen Ⅲ 抗體、兔抗大鼠 Fibronection抗體、兔抗大鼠 Tublin 抗體，4℃孵育過夜; TBST沖洗，加入滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔 IgG (1∶5 000)孵育 90 min，TBST 洗滌，ECL 發(fā)光顯色，灰度掃描后，用 Quantity One 分析軟件對(duì)蛋白電泳條帶進(jìn)行分析，以目標(biāo)蛋白條帶灰度/內(nèi)參Tublin條帶灰度值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.7 熒光實(shí)時(shí)定量 PCR 檢測

取適量心肌組織，利用Trizol試劑提取該組織總RNA，用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(RR047A,TaKaRa，Dalian，China)通過將1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)溶液：含40 ng cDNA，目的基因特異性引物，和2×SYBR PreMix Ex Taq(RR820A, TaKaRa，Dalian，China)。以 GAPDH 作為內(nèi)參。根據(jù)以下參數(shù)進(jìn)行反應(yīng)：預(yù)變性95℃×5 min，變性 94℃×30 s，退火 60℃×30 s，延伸72℃×30 s，共 40 個(gè)循環(huán)。用熒光定量PCR(Bio-Rad，CFX Connection，Hercules，USA)檢測PCR擴(kuò)增?；|(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)及基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-2 (tissue inhibitors of metalloproteinase, TIMP-2)的上游引物及下游引物見表1。采用2-ΔΔCt計(jì)算，以 GAPDH 為內(nèi)參定量目的基因(MMP-2、TIMP-2)mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

Tab. 1 PCR primer sequences

2 結(jié)果

2.1 消痰化瘀利竅中藥組方對(duì)CIH大鼠心肌間質(zhì)膠原沉積的影響

常規(guī)顯微鏡下觀察，天狼星紅染色膠原組織為紅色，心肌組織為黃色。Normoxia組和TCMC組大鼠心肌間質(zhì)中的膠原纖維量少，排列整齊。與Normoxia組比較，CIH大鼠心肌間質(zhì)中的膠原纖維含量明顯增加，且分布雜亂；與CIH組比較，CIH + TCMC組大鼠心肌間質(zhì)中的膠原纖維明顯減少(圖1)。同樣偏振光顯微鏡下，與Normoxia組比較，CIH組大鼠心肌組織顯示很強(qiáng)的雙折光性,橙色的粗纖維明顯增加，且分布雜亂；但TCMC組無明顯變化。與CIH組比較，CIH + TCMC組大鼠顯示很強(qiáng)的雙折光性，橙色的粗纖維明顯減少。

Fig. 1 Deposition of collagen fibers in myocardial tissues of each group(Sirius red staining ×200)

2.2 消痰化瘀利竅中藥組方對(duì)CIH大鼠心肌組織 CollagenⅠ、Collagen Ⅲ和Fibronectin蛋白表達(dá)的影響

與Normoxia大鼠比較，CIH大鼠心肌組織中 CollagenⅠ、Collagen Ⅲ和Fibronectin蛋白表達(dá)水平明顯升高(P均<0.01)，而TCMC組無明顯變化(P均>0.05)。與CIH大鼠相比，CIH +TCMC組 CollagenⅠ、Collagen Ⅲ和Fibronectin蛋白表達(dá)水平明顯降低(分別為P<0.05，P<0.01，P<0.05，圖2，表2)。

2.3 消痰化瘀利竅中藥組方對(duì)CIH誘導(dǎo)的大鼠心肌組織內(nèi)TGF-β/Smads 信號(hào)通路的影響

與Normoxia大鼠比較，CIH大鼠心肌組織中TGF-β、p-Smad2、p-Smad3蛋白表達(dá)水平明顯增多(P均<0.01)，而TCMC組無明顯變化(P均> 0.05)。與CIH大鼠相比，CIH +TCMC組TGF-β、p-Smad2、p-Smad3蛋白表達(dá)水平明顯減少(分別為P<0.01，P<0.05，P<0.01)。提示消痰化瘀利竅中藥組方提前干預(yù)后，TGF-β/Smads信號(hào)通路被抑制(圖 3，表3)。

Fig. 2 Protein expression levels of collagenⅠ, collagen Ⅲ and fibronectin in each group of myocardial tissue using Western blot

Tab. 2 Protein expressions of collagenⅠand collagen Ⅲ and fibronectin in myocardial tissues of each group ( protein expression /tublin) n=10)

Fig. 3 Expressions of TGF-, p-smad2 and p-smad3 in myocardial tissue by Western blot

Tab. 3 The protein expressions of TGF-, p-smad2 and p-smad3 in myocardial n=10)

Tab. 3 The protein expressions of TGF-, p-smad2 and p-smad3 in myocardial n=10)

**P<0.01 vs normoxia； # P<0.05,##P<0.01 vs CIH

2.4 消痰化瘀利竅中藥組方對(duì)CIH大鼠心肌組織 TIMP-2mRNA表達(dá)的影響

相對(duì)于Normoxia大鼠，CIH大鼠心肌組織中， TIMP-2mRNA表達(dá)水平明顯增多，MMP-2mRNA表達(dá)水平明顯減少(P均<0.01); 而TCMC組無明顯變化(P均>0.05)。與CIH組比較，CIH+TCMC組大鼠心肌組織 TIMP-2mRNA表達(dá)水平明顯減少，MMP-2mRNA水平明顯增多 (P均<0.05，表4)。

Tab. 4 mRNA expressions of TIMP-2 and MMP-2 in myocardial tissues of each group by n=10)

3 討論

正常狀態(tài)下，分布于心肌間質(zhì)中的成纖維細(xì)胞既可以合成、分泌膠原蛋白，還可合成基質(zhì)金屬蛋白酶及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑，以維持細(xì)胞外基質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡[10]。當(dāng)心肌組織受到缺氧、缺血及炎癥等因素刺激后，間質(zhì)纖維細(xì)胞增生、細(xì)胞外基質(zhì)過量沉積[11]、各型膠原比例失調(diào)，導(dǎo)致心肌順應(yīng)性降低，心臟舒縮功能障礙[12]，最終導(dǎo)致慢性心力衰竭[13]。因此延緩或抑制心肌纖維化是防治心功能下降的前提基礎(chǔ)。在長期間歇性低氧環(huán)境下的反復(fù)低氧、復(fù)氧引起的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)的刺激作用下，心臟成纖維細(xì)胞被激活并不斷增殖活化為肌成纖維細(xì)胞，持續(xù)激活的肌成纖維細(xì)胞生成大量的CollagenⅠ及 CollagenⅢ蛋白和纖維連接蛋白，形成細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，導(dǎo)致間質(zhì)纖維化[4,14]。本研究發(fā)現(xiàn)，CIH大鼠心肌組織大量膠原沉積，CollagenⅠ及 CollagenⅢ蛋白和Fibronectin蛋白表達(dá)水平增加明顯，經(jīng)中藥消痰化瘀利竅組方干預(yù)后，CollagenⅠ及 CollagenⅢ蛋白和Fibronectin蛋白的表達(dá)水平顯著下調(diào)，心肌纖維化程度明顯降低，提示中藥消痰化瘀利竅組方可能通過抑制肌成纖維細(xì)胞增殖，減少膠原蛋白沉積，從而抑制心肌纖維化。

MMPs是降解細(xì)胞外基質(zhì)的重要介質(zhì)，它們的活性與TIMPs的表達(dá)密切相關(guān)，TIMPs的表達(dá)能夠調(diào)控MMPs的活性。研究表明，維持ECM正常代謝的關(guān)鍵是MMPs和TIMPs之間的分泌平衡，它們之間的失衡是誘發(fā)多種類型組織纖維化的重要因素[15]，若TIMPs高表達(dá)或MMPs低表達(dá)導(dǎo)致MMPs和TIMPs的動(dòng)態(tài)失衡，可進(jìn)一步導(dǎo)致膠原降解受抑而使膠原過度沉積致纖維化[16]，TGF-β1可上調(diào)TIMPs水平從而抑制MMPs活性，減少ECM的降解[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，CIH大鼠心肌組織TGF-β蛋白和TIMP-2 mRNA表達(dá)水平均明顯升高，MMP-2 mRNA表達(dá)水平明顯下降，表明CIH激活TGF-β上調(diào)TIMP-2 mRNA表達(dá)導(dǎo)致MMP-2 mRNA降低，減緩ECM降解引起心肌間質(zhì)纖維化。中藥消痰化瘀利竅組方干預(yù)能明顯下調(diào)CIH大鼠心肌組織中TGF-β蛋白及TIMP-2 mRNA表達(dá)水平，致使MMP-2 mRNA表達(dá)水平明顯增高，促進(jìn)ECM的降解，緩解心肌纖維化。

TGF-β誘導(dǎo)信號(hào)通路在器官纖維化中發(fā)揮著重要作用，Smads是 TGF-β的下游效應(yīng)器, TGF-β可以通過誘導(dǎo)Smad2、Smad3蛋白的磷酸化調(diào)節(jié)心肌成纖維細(xì)胞的增殖、分化及細(xì)胞外基質(zhì)的合成[18,19]。若TGF-β過表達(dá)，通過上述通路，上調(diào)collagenⅠ、collagenⅢ蛋白的表達(dá)、Fibronectin蛋白合成增多，介導(dǎo)心肌纖維化。以往的研究表明，通過抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路來抑制心肌纖維化[20-22]。在本研究中，CIH大鼠心肌組織TGF-β、p-Smad2和p-Smad3 蛋白表達(dá)水平明顯升高，表明CIH大鼠心肌組織中的TGF-β/ Smad信號(hào)通路被激活；經(jīng)過中藥消痰化瘀利竅組方干預(yù)后，TGF-β蛋白表達(dá)水平和磷酸化水平的Smad2/3顯著降低，提示中藥消痰化瘀利竅組方可能通過抑制 TGF-β/Smad信號(hào)通路活化，進(jìn)而抑制肌成纖維細(xì)胞增殖，減少心肌組織膠原蛋白合成，達(dá)到抑制CIH大鼠的心肌纖維化。

綜上所述，中藥消痰化瘀利竅組方的干預(yù)可以下調(diào)CIH大鼠心肌組織中CollagenⅠ及 CollagenⅢ蛋白和Fibronectin蛋白的表達(dá)，干預(yù)CIH大鼠心肌纖維化的發(fā)生，這一作用與其調(diào)節(jié) TGF-β/Smads 信號(hào)通路有關(guān)；此外還可通過下調(diào) TGF-β表達(dá)，抑制TIMP-2mRNA表達(dá)，干預(yù)CIH大鼠心肌纖維化的發(fā)生。