蒼術(shù)素對(duì)大鼠心臟正性肌力的作用及其機(jī)制*

高 麗， 張文慧， 王羽維， 朱曉佳， 肖鈺潔， 高倩雯， 李 偉， 陳 龍,3△

((1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 江蘇 南京 210023； 2. 泰州市第四人民醫(yī)院， 江蘇 泰州 225300； 3. 泰州中國(guó)醫(yī)藥城中醫(yī)藥研究院， 江蘇 泰州 225300)

蒼術(shù)素(atractylodin)是中藥蒼術(shù)的主要成分之一，具有廣泛的藥理作用[1]。這些藥理作用包括抗神經(jīng)炎癥反應(yīng)[2]、改善急性肝衰竭[3]、抑制藥物誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎發(fā)生[4]、抗腫瘤[5]、通過(guò)促進(jìn)平滑肌收縮調(diào)節(jié)胃腸道功能[6]等。

蒼術(shù)素這種廣泛的藥理作用是由于其激素樣作用，研究表明蒼術(shù)素是葛瑞林(Ghrelin)信號(hào)通路的增效劑[7]。葛瑞林是機(jī)體內(nèi)源性多肽，首次由日本學(xué)者在胃內(nèi)分離發(fā)現(xiàn)，早期研究發(fā)現(xiàn)葛瑞林具有刺激腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞分泌生長(zhǎng)激素作用。因此，神經(jīng)細(xì)胞上的葛瑞林作用靶點(diǎn)被稱(chēng)為生長(zhǎng)激素促分泌受體(growth hormone secretagogue receptor)或葛瑞林受體(ghrelin receptor)，而較早發(fā)現(xiàn)的葛瑞林稱(chēng)為生長(zhǎng)激素促分泌受體配體(endogenous ligand of growth hormone secretagogue receptor)[8]。進(jìn)一步研究表明，心肌細(xì)胞也能合成并分泌葛瑞林[9,10]，且心肌細(xì)胞表達(dá)有生長(zhǎng)激素促分泌受體[8]，葛瑞林具有保護(hù)心肌細(xì)胞免于心肌缺血[9,10]及增加心肌收縮力的作用[11]。而正性肌力作用的最明顯的表征則是心肌收縮力上升以及心輸出量增加等。

蒼術(shù)素對(duì)心肌細(xì)胞直接的生物學(xué)作用研究也較為深入。日本漢方“三和六君子湯(rikkunshito)”能夠改善心衰狀態(tài)的小鼠心臟功能，具有抗心肌細(xì)胞鈣化、抗心肌萎縮及降低交感神經(jīng)張力作用[7]。而服用該方人體的血清中主要成分為蒼術(shù)素[12]。此外，蒼術(shù)素具有增加胞漿鈣及cAMP濃度[7]、促進(jìn)蛋白磷酸化作用[13]。

基于蒼術(shù)素對(duì)葛瑞林(Ghrelin)信號(hào)通路的增效作用[7]、對(duì)胃腸道平滑肌的收縮力增強(qiáng)作用[6]及保護(hù)心肌細(xì)胞作用[7]，本研究首次采用在體、離體大鼠心臟實(shí)驗(yàn)闡明蒼術(shù)素對(duì)心臟正性肌力的作用及其機(jī)制，為臨床用其治療心力衰竭提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

蒼術(shù)素(Atractylodin)：購(gòu)于四川成都樂(lè)美天/德思特生物，批號(hào)：DST190401-004，純度大于99%；H89：PKA (Protein kinase A) 抑制劑及KN-93：CaMKII (Ca2+/calmodulin dependent protein kinase II)抑制劑購(gòu)于Selleck公司；Calyculin A：PP1、PP2A (Protein phosphatases 1 and 2A) 抑制劑購(gòu)于Genne Operation公司；熒光染色劑Fluo-4 AM：購(gòu)于東仁化學(xué)科技(上海)有限公司；其它試劑均購(gòu)于Sigma公司。

1.2 儀器

生理多導(dǎo)記錄儀(PowerLab 8/35, AD Instruments, 澳大利亞)；放大器(35-2083 Rev. F Millar)、雙壓力容積導(dǎo)管(SPR-901 型) (MILLAR公司，美國(guó))；Olympus IX53倒置顯微鏡(Olympus公司, 日本)；科研級(jí)高靈敏致冷CCD (ZYLA-5.5-CL3, ANDOR公司，英國(guó))；超高速波長(zhǎng)切換裝置(Lambda DG-4, Sutter, 美國(guó))；灌流給藥系統(tǒng)(VC3-8, ALA公司，美國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠(300～350 g)，購(gòu)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK(蘇)2011-0053；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理批準(zhǔn)號(hào)：ACU171115；在恒溫、各12 h明暗周期的飼養(yǎng)室內(nèi)，自由進(jìn)食和飲水。

1.4 濃度設(shè)計(jì)

根據(jù)大鼠在體預(yù)實(shí)驗(yàn)，蒼術(shù)素劑量選擇能夠引起最大藥效的最低劑量(大約)，最終選擇濃度為3 mg/kg蒼術(shù)素進(jìn)行在體實(shí)驗(yàn)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，H89對(duì)PKA抑制的IC50(half maximal inhibitory concentration)為135 nmol/L[14]，KN-93對(duì)CaMKII抑制的IC50為370 nmol/L[15]，Calyculin A (CA)抑制PP1的IC50為2 nmol/L，抑制PP2A的IC50為0.5～1 nmol/L[16]。因此離體大鼠心臟及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，H89，KN-93及CA分別選擇為200 nmol/L, 500 nmol/L, 10 nmol/L，以確保其PKA, CaMKII, PP1及PP2A超過(guò)半數(shù)活性被抑制。

1.5 在體大鼠壓力-容積環(huán)分析

雄性SD大鼠經(jīng)腹腔注射20%烏拉坦(5 ml/kg)麻醉。已定標(biāo)的雙壓力Millar導(dǎo)管經(jīng)右側(cè)位的頸總動(dòng)脈插入到大鼠的左心室內(nèi)，手術(shù)線(xiàn)固定。打開(kāi)Labchart 8軟件調(diào)整導(dǎo)管在心室內(nèi)的位置，直到壓力-容積環(huán)呈現(xiàn)規(guī)則的矩形狀[16,17]。大鼠的左心室壓、左心室容積、主動(dòng)脈收縮壓及主動(dòng)脈舒張壓均穩(wěn)定時(shí)，即停止調(diào)節(jié)導(dǎo)管位置。記錄給藥前各指標(biāo)作為空白對(duì)照，空白對(duì)照記錄結(jié)束后，將蒼術(shù)素溶于DMSO (0.3 ml)腹腔注射，待藥效穩(wěn)定后記錄大鼠加藥后各血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，如左心室發(fā)展壓(left ventricular developed pressure, LVDP)、搏出功(stroke work, SW)、心輸出量(cardiac output, CO)、心率(heart rate, HR)、動(dòng)脈收縮壓(systolic blood pressure, SBP)和動(dòng)脈舒張壓(diastolic blood pressure, DBP)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，自頸靜脈推注30%高滲鹽水20～50 μl及取自身血液進(jìn)行容積定標(biāo)，采用6只大鼠重復(fù)上述實(shí)驗(yàn) (n=6)。前期實(shí)驗(yàn)表明0.3 ml DMSO腹腔注射對(duì)大鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)無(wú)明顯作用(實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)未顯示)。

1.6 離體大鼠心臟左心室收縮力分析

雄性SD大鼠麻醉同在體實(shí)驗(yàn)，取心臟置于0℃至4℃無(wú)鈣臺(tái)氏灌流液中，使其停搏。離體大鼠心臟掛于已充滿(mǎn)灌流液的Langendorff裝置上，在充氧 (95% O2+5% CO2)，溫度為(37.5±0.5)℃條件下，經(jīng)主動(dòng)脈逆行灌流，灌流壓為90 cm H2O (1 cm H2O=0.098 kPa)。經(jīng)由左心房插入左心室，連接RM6240型多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)，記錄左心室收縮曲線(xiàn)。刺激器通過(guò)一對(duì)刺激電極約5 V的刺激強(qiáng)度加于離體心臟心房?jī)蓚?cè)，刺激心臟以4 Hz固定頻率(即心率240)進(jìn)行起搏[17]。以含鈣灌流液為母液配制成相應(yīng)濃度藥物依次灌流給藥，正常灌流液→ 0.1→1→10 μmol/L 蒼術(shù)素濃度梯度灌流；或正常灌流液→200 nmol/L H89 (PKA抑制劑)→200 nmol/L H89+10 μmol/L 蒼術(shù)素；或正常灌流液→500 nmol/L KN-93 (CaMKII抑制劑)→500 nmol/L KN-93+10 μmol/L 蒼術(shù)素；或正常灌流液→10 nmol/L Calyculin A (PP1, PP2A抑制劑)→10 nmol/L Calyculin A+10 μmol/L 蒼術(shù)素。記錄參數(shù)為左心室發(fā)展壓 (LVDP, Left ventricular develop pressure)，該離體心臟實(shí)驗(yàn)每組重復(fù)6例 (n=6)。灌流液的組成 (mmol/L): NaCl 135, Glucose 10, KCl 5.4, HEPES 5, MgCl21, NaH2PO40.33, CaCl21.8, NaOH調(diào)pH至7.3。

1.7 大鼠左心室心肌細(xì)胞鈣釋放測(cè)定

雄性SD大鼠麻醉方法同在體實(shí)驗(yàn)，大鼠離體心臟置于Langendorff裝置上灌流，用含2 mg/ml CollagenaseⅡ的灌流液消化后。剪取心臟于無(wú)鈣臺(tái)氏灌流液中充分剪碎過(guò)濾，靜置后用無(wú)鈣臺(tái)氏灌流液沖洗2次。隨后用0.25 mmol/L, 0.5 mmol/L, 1 mmol/L鈣離子的臺(tái)氏液進(jìn)行梯度復(fù)鈣。隨后細(xì)胞懸液加入鈣熒光指示劑Fluo-4 AM (5 μmol/L)于37℃避光孵育30 min。孵育后細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，外液為含鈣 (1.8 mmol/L)臺(tái)氏液[18]。由刺激器通過(guò)一對(duì)刺激電極以1 Hz，15 V的強(qiáng)度加于心肌細(xì)胞兩側(cè)，刺激細(xì)胞收縮。單色激發(fā)光源發(fā)出激發(fā)光，通過(guò)耦合系統(tǒng)引入熒光顯微鏡，并聚焦到細(xì)胞表面，激發(fā)細(xì)胞中的熒光探針Fluo-4 AM發(fā)出熒光，采用空氣冷卻用CCD相機(jī)采集并記錄熒光信號(hào)。激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，吸收波長(zhǎng)510 nm[16]。加藥順序同上實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)6例 (n=6)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 蒼術(shù)素對(duì)在體大鼠血流動(dòng)力學(xué)的影響

雙壓力Millar導(dǎo)管能夠同時(shí)記錄左心室壓力、左心室容積及主動(dòng)脈壓力。結(jié)果表明，蒼術(shù)素(3 mg/kg)顯著增加搏出功(SW)、心輸出量(CO)及心率(HR)，顯著降低動(dòng)脈舒張壓(DBP)，而對(duì)左心室發(fā)展壓(LVDP)和動(dòng)脈收縮壓(SBP)無(wú)明顯影響(表1)。

Tab. 1 Effects of atractylodin (3 mg/kg) on left ventricular and aortic hemodynamic parameters of normal anesthetized rats n=6 )

2.2 蒼術(shù)素及蒼術(shù)素在H89或KN-93或Calyculin A干預(yù)下，對(duì)大鼠離體心臟收縮力的影響

大鼠離體心臟灌流實(shí)驗(yàn)被用于分析蒼術(shù)素對(duì)心臟的直接作用，通過(guò)給予固定頻率(4 Hz)刺激離體心臟，可排除頻率對(duì)左心室收縮力的影響。并且證實(shí)蒼術(shù)素的正性肌力作用是獨(dú)立于神經(jīng)體液調(diào)節(jié)，且PKA 抑制劑 H89能夠阻斷蒼術(shù)素的正性肌力作用。結(jié)果表明，(1)蒼術(shù)素(0.1, 1, 10 μmol/L)濃度依賴(lài)性增加大鼠左心室發(fā)展壓；(2)H89 (200 nmol/L)及KN-93 (500 nmol/L)均能顯著性降低大鼠LVDP；Calyculin A (10 nmol/L) 能顯著性增加大鼠LVDP；(3)只有H89 (200 nmol/L)能夠阻斷蒼術(shù)素(10 μmol/L)增加LVDP的作用，而KN-93 (500 nmol/L)及Calyculin A (10 nmol/L)均未能阻斷蒼術(shù)素增加LVDP的作用(表2)。

Tab. 2 Effects of atractylodin on isolated rat left ventricular developed pressure (LVDP) or Ca2+ transient amplitudes from left ventricular myocytes in the absence and presence of H89 or KN-93 or calyculin A n=6 )

2.3 蒼術(shù)素及蒼術(shù)素在H89或KN-93或Calyculin A干預(yù)下，對(duì)大鼠左心室心肌細(xì)胞鈣釋放的影響

為了探究蒼術(shù)素(Atractylodin)在體及離體心臟的正性肌力作用的機(jī)制，而采用左心室肌細(xì)胞鈣釋放實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)采用PKA 抑制劑H89、CaMKII抑制劑 KN-93、PP1, PP2A抑制劑Calyculin A干預(yù)atractylodin對(duì)鈣釋放的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，(1)蒼術(shù)素(10 μmol/L)增加大鼠左心室鈣釋放幅值；(2)H89 (200 nmol/L)及KN-93 (500 nmol/L)均能顯著性降低鈣釋放幅值；Calyculin A (10 nmol/L) 能顯著性增加鈣釋放幅值；(3)只有H89 (200 nmol/L)能夠阻斷蒼術(shù)素(10 μmol/L) 增加鈣釋放幅值的作用，而KN-93 (500 nmol/L)及Calyculin A (10 nmol/L)均未能阻斷蒼術(shù)素增加鈣釋放幅值的作用。蒼術(shù)素及3個(gè)抑制劑對(duì)大鼠左心室鈣釋放幅值作用的統(tǒng)計(jì)結(jié)果及代表性曲線(xiàn)見(jiàn)表2及圖1。

Fig. 1 Representative curves of rat left ventricular myocyte Ca2+ transient changes by atractylodin (10 μmol/L) in the absence (A) and presence of H89 (PKA inhibitor) (B) or KN-93 (CaMKII inhibitor) (C) or CA (Calyculin A, PP1 and PP2A inhibitor) (D)

鈣釋放曲線(xiàn)分為快速上升相及下降相，上升相主要由RyR2通道開(kāi)放引起，下降相主要由肌漿網(wǎng)鈣泵2a (SERCA2a)回吸收，以及通過(guò)Na+-Ca2+交換體(NCX)及質(zhì)膜上的鈣泵(PMCA)外排至細(xì)胞外引起的。其中SERCA2a的回吸收介導(dǎo)了快速下降相(α)，NCX和PMCA外排介導(dǎo)了緩慢下降相(β)。蒼術(shù)素(10 μmol/L)顯著增強(qiáng)SERCA2a介導(dǎo)的快成分，其衰減速率常數(shù)α值顯著增加(5.11±0.99 in control to 5.67±1.01 with atractylodin,P<0.01,n=6)；并降低NCX和PMCA介導(dǎo)的慢成分，其衰減速率常數(shù)β值顯著降低 (0.22±0.07 in control to 0.18±0.07 with atractylodin,P<0.01,n=6)。PKA抑制劑H89(200 nmol/L)能夠降低衰減速率常數(shù)α值(5.78±0.63 in control, 5.55±0.56 with H89, 5.17±0.52 with H89+Atractylodin,P<0.05,n=6)；并不影響β值(0.19±0.07 in control, 0.19±0.07 with H89, 0.21±0.07 with H89+Atractylodin,P>0.05,n=6)。鈣釋放下降相擬合曲線(xiàn)見(jiàn)圖2。

Fig. 2 The decaying phase curves of Ca2+ transients from rat left ventricular myocytes were presented as the relationships between timings of ms in X axis and the log10 fluorescence intensities in Y axis. The curves were expressed as an equation of y=A×e-αt+B×e-βt. The equation of fast component was described as y=A×e-αt and slow one as y=B×e-βt. (A) and (B) were the representative two exponential fittings before and after atractylodin (10 μmol/L). (C), (D) and (E) were the representative two exponential fittings in control, H89 and H89+atractylodin treatment. (F) and (G) were the original data of α and β before and after atractylodin administration, (H) and (I) were the raw data of α and β in control, H89 and H89+atractylodin treatment

3 討論

蒼術(shù)素通過(guò)作用于葛瑞林(Ghrelin)信號(hào)通路改善心衰狀態(tài)的小鼠心臟功能[7]，雖然文獻(xiàn)報(bào)道了蒼術(shù)素具有改善心衰狀態(tài)的作用，但有關(guān)蒼術(shù)素是否對(duì)心臟有直接作用；蒼術(shù)素對(duì)心臟作用的血流動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)的影響；心肌細(xì)胞的ghrelin受體是否介導(dǎo)蒼術(shù)素的心臟作用；介導(dǎo)蒼術(shù)素心臟作用的亞細(xì)胞作用靶點(diǎn)與ghrelin受體的關(guān)系等問(wèn)題尚不十分清楚。本研究中的在體及離體實(shí)驗(yàn)均表明蒼術(shù)素具有正性肌力作用，這種作用是基于蒼術(shù)素增加心肌細(xì)胞鈣釋放的幅值。進(jìn)一步對(duì)鈣釋放的分析表明，鈣泵(SERCA2a)活性增加導(dǎo)致胞漿鈣回吸收增加，是蒼術(shù)素增加鈣釋放幅值增加作用的原因。而離體實(shí)驗(yàn)表明蒼術(shù)素的正性肌力作用是源于其對(duì)心臟的直接作用。鈣離子在調(diào)控心臟收縮和舒張過(guò)程中發(fā)揮重要作用，鈣穩(wěn)態(tài)紊亂則會(huì)導(dǎo)致心臟功能異常[19]，其中就包括心力衰竭，其主要特征就是心臟收縮力降低。大量研究表明，SERCA2a表達(dá)或活性的降低是導(dǎo)致心臟收縮力下降的重要因素[20]。心肌細(xì)胞鈣釋放實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明，蒼術(shù)素增加鈣釋放的作用能夠被PKA抑制劑H89所阻斷。PKA是磷酸化受磷蛋白(phospholamban, PLB) (16位磷酸化位點(diǎn))的主要蛋白激酶，而磷酸化的PLB能夠增加肌漿網(wǎng)鈣泵(SERCA2a)的功能[21]。本研究雖然不能排除正性肌力作用的其它作用機(jī)理，但PKA-SERCA2a途徑是蒼術(shù)素發(fā)揮正性肌力作用的機(jī)制之一。

本研究采用雙壓力容積導(dǎo)管，同時(shí)分析蒼術(shù)素對(duì)心臟及血管的血流動(dòng)力學(xué)效應(yīng)，心室容積指標(biāo)的測(cè)量可準(zhǔn)確分析心輸出量。蒼術(shù)素顯著增加大鼠心臟的搏出功及心輸出量，表現(xiàn)出蒼術(shù)素明顯的正性肌力作用。此外，蒼術(shù)素還能增加心率。蒼術(shù)素引起心輸出量及心率增加并沒(méi)有導(dǎo)致收縮壓增加，反而導(dǎo)致舒張壓下降。合理的解釋是由于蒼術(shù)素能夠引起外周血管擴(kuò)張導(dǎo)致外周阻力下降，而在體實(shí)驗(yàn)中蒼術(shù)素導(dǎo)致心率上升可能是外周阻力下降后引起的代償性心率增加，而不是蒼術(shù)素對(duì)心臟的直接作用。事實(shí)上，ghrelin作用于血管上ghrelin受體導(dǎo)致血管擴(kuò)張[22]，蒼術(shù)素具有增強(qiáng)ghrelin受體信號(hào)通路作用[8]。因此，可以預(yù)見(jiàn)蒼術(shù)素能夠?qū)е峦庵苎軘U(kuò)張，但蒼術(shù)素對(duì)血管擴(kuò)張的直接證據(jù)有待進(jìn)一步研究。離體心臟實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛑苯佑^(guān)察蒼術(shù)素對(duì)心臟的作用，還能排除神經(jīng)體液因素的參與。本研究為了進(jìn)一步排除心率對(duì)心室發(fā)展壓的影響，采用電刺激(4 Hz)離體大鼠心臟，確保實(shí)驗(yàn)過(guò)程中離體心臟心率保持著每分鐘240次。結(jié)果表明，蒼術(shù)素能夠濃度依賴(lài)性增加大鼠左心室發(fā)展壓，其作用能夠被PKA抑制劑所阻斷，表明蒼術(shù)素的正性肌力作用是ghrelin-PKA通路介導(dǎo)。心肌細(xì)胞鈣釋放實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明蒼術(shù)素能夠增加胞漿鈣釋放幅值，雖然不能確定蒼術(shù)素增加鈣釋放幅值是其正性肌力作用的唯一機(jī)制，但可以明確鈣釋放幅值增加是蒼術(shù)素正性肌力作用的主要因素。此外，對(duì)CaMKII抑制劑KN-93及PP1和PP2A抑制劑Calyculin A 不能阻斷蒼術(shù)素增加心肌細(xì)胞鈣釋放幅值，而PKA抑制劑H89能夠顯著阻斷蒼術(shù)素對(duì)其作用，與離體心臟實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。本實(shí)驗(yàn)室首次采用靜脈給藥“藥物濃度-時(shí)間關(guān)系”分析法[17]，對(duì)鈣釋放進(jìn)一步分析，表明蒼術(shù)素增加鈣釋放幅值是基于其增加SERCA2a活性，促進(jìn)鈣回吸收增加。事實(shí)上，鈣釋放幅值的增加主要是肌漿網(wǎng)內(nèi)與胞漿之間的鈣濃度差，短期的鈣釋放幅值增加依賴(lài)于蘭尼堿受體(RyR2)開(kāi)放程度，但穩(wěn)定的鈣釋放幅值增加依賴(lài)于SERCA2a的活性[23]。

綜上，蒼術(shù)素具有正性肌力作用，其作用機(jī)制通過(guò)PKA-SERCA2a通路發(fā)揮其作用。在發(fā)揮正性肌力作用的同時(shí)，還能擴(kuò)張外周血管降低舒張壓，可為其作為先導(dǎo)化合物開(kāi)發(fā)用于臨床治療心力衰竭的藥物而提供了理論基礎(chǔ)。