納米二氧化硅復(fù)合寒冷對A549細(xì)胞毒性及其炎性因子分泌的影響*

張 莉， 張永強(qiáng)， 李 曦， 武 帥， 楊丹鳳

((軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所， 天津 300050)

近年來，隨著灰霾、霧霾問題的日益嚴(yán)重，其對人體健康的影響備受關(guān)注。室外大氣污染被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)列為人類致癌誘因之一。

大氣顆粒物成分復(fù)雜，按空氣動力學(xué)大小可分為可吸入顆粒物(PM10，空氣動力學(xué)直徑<10 μm)、細(xì)顆粒物(PM2.5，空氣動力學(xué)直徑<2.5 μm)、超細(xì)顆粒物(UFPs，空氣動力學(xué)直徑<0.1 μm)[1]。已有研究報道，超細(xì)顆粒物更容易透過肺氣血屏障，隨血液循環(huán)沉積在各組織臟器中，對健康的危害更大[2]。

大氣顆粒物中的硅元素占很大的比例，主要以氧化形式存在，SiO2是其重要的一員[3]。近年來，隨著納米材料在工業(yè)和日常生活中的廣泛應(yīng)用，大大提高人們暴露于納米顆粒物的幾率。如納米硅顆粒，由于其高豐度、高能量密度和良好的熱、化學(xué)性質(zhì)，已經(jīng)被作為一種潛在的能量載體[4]。納米硅顆粒被普遍認(rèn)為是低毒甚至是無毒的，但體內(nèi)實驗表明，對小鼠氣管滴注低劑量的納米硅，具有急性或亞急性的肺毒性[5]。納米二氧化硅(Nano-SiO2)顆粒與UFPs一樣，能透過生物屏障進(jìn)入血液循環(huán)并沉積在靶器官中，發(fā)揮著潛在的生物學(xué)毒性效應(yīng)[6]。流行病學(xué)、臨床和病理研究表明，吸入SiO2可引起肺組織的炎癥反應(yīng)并釋放炎癥因子，與矽肺、慢性支氣管炎、肺癌等肺部疾病相關(guān)[7]。

與此同時，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，低溫刺激和冷空氣可使呼吸系統(tǒng)疾病，如哮喘、上呼吸道感染、慢性支氣管炎、肺炎等的發(fā)病風(fēng)險明顯增加[8]。我國近幾年冬季霧霾天氣尤為嚴(yán)重，在冬季氣壓低、空氣流通性差，顆粒物漂浮于空氣中更易隨冷空氣吸入體內(nèi)，以致機(jī)體面臨超細(xì)顆粒物及寒冷暴露的雙重刺激。

A549細(xì)胞為人肺腺癌上皮細(xì)胞模型，與呼吸性毒物有緊密聯(lián)系，在毒理學(xué)體外研究中得到廣泛使用，該細(xì)胞易于培養(yǎng)、對外界刺激較為敏感，被應(yīng)用為評價外來物質(zhì)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)能力的理想模型。因此，本研究以Nano-SiO2顆粒作為超細(xì)顆粒物代表，探討Nano-SiO2與寒冷復(fù)合暴露對A549細(xì)胞毒性及其炎性因子分泌的影響，為進(jìn)一步揭示冬季霧霾天氣對人類健康的潛在危害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與材料

A549細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫；Nano-SiO2(平均粒徑<40 nm，純度99.9%，結(jié)晶型)購自上海潤和納米有限公司。

1.2 試劑

胎牛血清(Hyclone，美國)，高糖DMEM培養(yǎng)基(Hyclone，美國)，胰蛋白酶(Gibco，美國)，青-鏈霉素雙抗溶液(Gibco，美國)，Trizol(Invitrogen，美國)，Ex Taq(TaKaRa，日本)，SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa，日本)，引物(上海生工，中國)，IL-6，IL-8 ELISA檢測試劑盒(武漢博士德生物有限公司，中國)，CCK8檢測試劑盒(同仁，日本)，乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，中國)。

1.3 儀器

CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱(Thermo，美國)，TGL-6臺式高速冷凍離心機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司，中國)，酶標(biāo)儀(Tecan，瑞士)，BK-900C超聲波清洗器(巴克超聲設(shè)備有限公司，中國)，倒置顯微鏡(Olymbas，日本)，ABI-7300型PCR儀(ABI，美國)，PCR儀(Bio-Red，美國)。

1.4 Nano-SiO2混懸液制備

用電子天平準(zhǔn)確稱取Nano-SiO220 mg，加入10 ml的FBS后密封，使用漩渦振蕩器初步震蕩混勻；置于超聲清洗儀中超聲震蕩8 h(期間每2 h漩渦震蕩混勻一次)，振動頻率為60 Hz，制成2 mg/ml的Nano-SiO2母液。再用染毒母液配制成10 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml和200 μg/ml的染毒培養(yǎng)液。

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞用高糖DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2條件下傳代培養(yǎng)。

1.4.2 CCK8檢測細(xì)胞存活率與分組 將A549細(xì)胞按每孔5×103cells/ml接種于96孔板中，將細(xì)胞分為對照組和實驗組，對照組加入培養(yǎng)液正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，實驗組分別用10, 50, 100, 200 μg/ml Nano-SiO2對A549染毒和/或31℃，33℃，35℃低溫孵育，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μl CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，采用酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度值，計算細(xì)胞相對存活率。公式為：細(xì)胞相對存活率=(OD實驗組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)×100%。

選出對A549細(xì)胞存活率影響顯著的溫度和Nano-SiO2劑量的基礎(chǔ)上，進(jìn)行2×2析因設(shè)計實驗，分為4組：37℃對照組；Nano-SiO2染毒組；低溫暴露組；Nano-SiO2和低溫復(fù)合組。將A549細(xì)胞按每孔5×103cells/ml接種于96孔板中，在不同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)48 h后，通過倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，參照上述方法檢測細(xì)胞相對存活率。

1.4.3 LDH的測定 A549細(xì)胞接種于6孔板培養(yǎng)過夜后，吸棄各孔的培養(yǎng)液，Nano-SiO2染毒組、Nano-SiO2和31℃復(fù)合組加入100 μg/ml的Nano-SiO2染毒培養(yǎng)液，對照孔和31℃低溫組加入等體積的正常培養(yǎng)液，實驗均設(shè)置 3個復(fù)孔。按照不同條件繼續(xù)培養(yǎng) 48 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，3 000 r /min 離心10 min，取上清液，采用比色法檢測LDH活性，操作按試劑盒說明進(jìn)行。

1.4.4 IL-6、IL-8細(xì)胞炎性因子的測定 A549細(xì)胞在不同的條件下培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，利用ELISA法測定白細(xì)胞介素6(IL-6)和白細(xì)胞介素8(IL-8)含量，實驗具體步驟嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行。

1.4.5 qRT-PCR檢測IL-6和IL-8基因表達(dá)水平 A549細(xì)胞在不同條件下培養(yǎng)48 h后，離心收集細(xì)胞，使用Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，反應(yīng)體系如下：30 μl反應(yīng)體系中RNA 3 μl，5×Prime Mix 6 μl，補(bǔ)足RNAnase free water至30 μl。置于PCR儀按如下程序反應(yīng)：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃ 5 min。將上述所得cDNA進(jìn)一步行qRT-PCR檢測，反應(yīng)體系：20 μl反應(yīng)體系中，cDNA 1 μl，SYBR Ex Taq Ⅱ 10 μl，Dye 0.4 μl，上、下游引物各0.4 μl，RNAnase free water 7.8 μl。qRT-PCR反應(yīng)條件：94℃ 30 s →60℃ 31 s→72℃ 30 s，共40個循環(huán)(引物序列見表1。根據(jù)內(nèi)參Ct值，利用2-ΔΔCt法計算各目的基因的相對表達(dá)量。

Tab. 1 qRT-RCR primer sequences

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 不同低溫和不同劑量Nano-SiO2對A549細(xì)胞相對存活率的影響

結(jié)果表明，與37℃對照組相比，35℃、33℃和31℃組細(xì)胞相對存活率分別為 (87.414.67)%、(77.133.66)%、 (60.022.54)%，隨溫度的降低細(xì)胞相對存活率隨之降低(P<0.05，圖1A)，其中以31℃組細(xì)胞相對存活率降低最為顯著。與對照組相比，10 μg/ml Nano-SiO2、50 μg/ml Nano-SiO2、50 μg/ml Nano-SiO2和100 μg/ml Nano-SiO2劑量組A549細(xì)胞相對存活率分別為(95.241.85) %，(94.635.20)%，(83.622.23)%，(75.661.02)%，隨著染毒劑量的增加細(xì)胞相對存活率隨之降低(P<0.05，圖1B)，其中以100 μg/ml Nano-SiO2組細(xì)胞相對存活率降低最為顯著。

根據(jù)單因素結(jié)果分析，100 μg/ml Nano-SiO2和31℃低溫對A549細(xì)胞存活率影響顯著，按照2×2析因設(shè)計實驗，分為4組：對照組(不施加Nano-SiO2，常溫37℃)；單一Nano-SiO2染毒組(100 μg/ml)；單一低溫組(31℃)；100 μg/ml Nano-SiO2和31℃低溫復(fù)合組。

Fig. 1 Effects of different factors exposure on relative cell survival rate of A549 cells (n=6)

2.2 Nano-SiO2復(fù)合低溫對A549細(xì)胞相對存活率的影響

結(jié)果表明，與對照組比較， 31℃冷暴露組、100 μg/ml Nano-SiO2及復(fù)合組細(xì)胞相對存活率分別為(76.351.89)%、(60.022.54)%、(47.762.73)%， 均顯著降低(P<0.01)；冷暴露組相比染毒組細(xì)胞相對存活率顯著降低(P<0.01)；與31℃冷暴露組和100 μg/ml Nano-SiO2染毒組比較，二因素復(fù)合組細(xì)胞相對存活率降低更為顯著(P<0.01)，且統(tǒng)計分析具有協(xié)同作用(表2)。

Tab. 2 Effects of different exposure conditions on activity of A549 cells n=6)

2.3 Nano-SiO2復(fù)合低溫對A549細(xì)胞LDH活性的影響

結(jié)果表明，對照組、31℃冷暴露組、100 μg/ml Nano-SiO2及復(fù)合組細(xì)胞培養(yǎng)液中 LDH 活性分別為(198.939.42)U/L、(316.6114.01)U/L、 (350.5511.91)U/L、(483.1711.29)U/L。與對照組相比，各條件下細(xì)胞培養(yǎng)上清液中 LDH 活力均顯著升高(P<0.01)；冷暴露組相比染毒組LDH活力顯著升高(P<0.01)；與31℃冷暴露組和100 μg/ml Nano-SiO2染毒組比較，二因素復(fù)合組LDH顯著升高(P<0.01)，且統(tǒng)計分析具有協(xié)同作用(表3)。

Tab. 3 Effects of different exposure conditions on LDH content in A549 cell culture solution n=3)

2.4 Nano-SiO2復(fù)合低溫對A549細(xì)胞IL-6和IL-8質(zhì)量濃度的影響

結(jié)果表明，與對照組相比，低溫組及復(fù)合組IL-6水平顯著升高(P<0.01)，染毒組IL-6水平有升高的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；冷暴露組相比染毒組IL-6水平顯著升高(P<0.01)。IL-8水平在低溫組、Nano-SiO2染毒組和復(fù)合組均顯著高于對照組(P<0.01)；染毒組相比冷暴露組IL-8水平顯著升高(P<0.01)。與31℃冷暴露組和100 μg/ml Nano-SiO2染毒組比較， 二因素復(fù)合組IL-6、IL-8水平均顯著升高(P<0.01)，且統(tǒng)計分析具有協(xié)同作用(表4)。

Tab. 4 Effects of different exposure conditions on IL-6 and IL-8 levels in A549 cell culture medium (pg/ml, n=3)

2.5 Nano-SiO2復(fù)合低溫對A549細(xì)胞IL-6和IL-8 mRNA表達(dá)的影響

結(jié)果表明，與對照組相比，31℃低溫組及復(fù)合組IL-6 mRNA水平明顯升高(P<0.05)，而單一100 μg/ml Nano-SiO2染毒組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)。與染毒組相比，冷暴露組IL-6水平顯著降低(P<0.01)。復(fù)合組IL-8 mRNA水平顯著高于對照組(P<0.01)，而單一Nano- SiO2染毒組及31℃低溫暴露組IL-8 mRNA有升高的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與31℃冷暴露組和100 μg/ml Nano-SiO2染毒組比較，二因素復(fù)合組IL-6、IL-8 mRNA表達(dá)均顯著升高(P<0.01)，且統(tǒng)計分析具有協(xié)同作用(表5)。

Tab. 5 Effects of different exposure conditions on IL-6 and IL-8 mRNA levels in A549 cells n=3)

3 討論

流行病學(xué)認(rèn)為，大氣顆粒物和低溫刺激都可能誘發(fā)呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)生和死亡的幾率增加，并且兩者同時存在時的影響更為顯著[9]。但是考察顆粒物與寒冷復(fù)合作用對機(jī)體影響的研究極少，以往通過采用廣義相加模型等方法證實顆粒物和氣溫對呼吸系統(tǒng)的影響存在交互協(xié)同作用[10, 11]。

納米SiO2顆粒在空氣顆粒物成分中所占比例很大， 因此本研究以人肺腺癌A549細(xì)胞作為研究對象，觀察Nano-SiO2復(fù)合寒冷暴露對A549細(xì)胞毒性及其炎性因子分泌的影響，結(jié)果表明Nano-SiO2染毒可明顯抑制A549細(xì)胞活性，且隨染毒劑量的增加而增加；當(dāng)給予低溫刺激后，A549細(xì)胞活性也受到影響，其中低溫組(31℃)細(xì)胞活性抑制較為顯著。而當(dāng)100 μg/ml Nano-SiO2和31℃低溫復(fù)合作用A549后，對細(xì)胞活性的抑制具有協(xié)同作用，其中復(fù)合組細(xì)胞活性抑制最為明顯。由此可見，低溫刺激可增加Nano-SiO2顆粒對呼吸系統(tǒng)的影響。

據(jù)報道，毒性物質(zhì)或外界刺激作用細(xì)胞的常見早期反應(yīng)是細(xì)胞膜通透性的改變。故胞漿中的LDH釋放到細(xì)胞外的水平可作為細(xì)胞膜受損的標(biāo)志之一[12, 13]。在本研究中，同樣觀察到隨著100 μg/ml Nano-SiO2染毒及31℃低溫暴露，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH活性呈增加趨勢，且在復(fù)合作用時細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH的增加最為明顯。結(jié)果表明Nano-SiO2復(fù)合寒冷可加重細(xì)胞損傷。

已有研究認(rèn)為，PM2.5暴露可造成肺泡巨噬細(xì)胞毒性，誘導(dǎo)炎癥因子表達(dá)增加，從而促進(jìn)呼吸道炎癥的發(fā)生[14-16]。IL-6和IL-8是一類多向性促炎癥因子，具有增強(qiáng)多種炎癥介質(zhì)、促進(jìn)炎性細(xì)胞聚集的作用，亦是反映機(jī)體急性炎癥損傷的重要指標(biāo)，且IL-6和肺表面活性蛋白A是免疫防御功能的物質(zhì)基礎(chǔ)[17]。而極端低溫會引起氣道結(jié)構(gòu)和功能改變，易于滋生細(xì)菌，破壞肺部免疫防御系統(tǒng)，進(jìn)而加重 PM2.5 的毒性作用，本課題組另一項研究通過氣管內(nèi)滴注Nano-SiO2和零下10℃復(fù)合暴露來評估全身炎癥反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)復(fù)合暴露可以上調(diào)促炎性細(xì)胞因子，并影響白/棕色脂肪組織的可塑性[18]。

本研究中觀察到，無論細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IL-6和IL-8的水平還是A549細(xì)胞中IL-6和IL-8 mRNA表達(dá)量，100 μg/ml Nano-SiO2和31℃低溫復(fù)合組顯著高于其他各組。表明Nano-SiO2和低溫復(fù)合暴露可加重肺泡巨噬細(xì)胞毒性，增加炎癥因子表達(dá)，促進(jìn)及加重呼吸道炎癥。

有關(guān)Nano-SiO2和低溫刺激抑制細(xì)胞活性及促進(jìn)細(xì)胞炎性因子增加的可能機(jī)制為外界刺激作用于A549細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞炎性因子如IL-6和IL-8反應(yīng)性增加，以及大量超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)的生成，并參與脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，大量的過氧化物與自由基攻擊細(xì)胞膜并導(dǎo)致細(xì)胞膜破壞，細(xì)胞內(nèi)大量LDH滲出，抑制細(xì)胞增殖，降低細(xì)胞活性，嚴(yán)重時導(dǎo)致細(xì)胞死亡[19]。而其具體作用機(jī)制將在后續(xù)研究中進(jìn)一步探討。

綜上所述，本研究著眼于Nano-SiO2顆粒染毒與寒冷暴露的復(fù)合作用進(jìn)行的初步研究，研究結(jié)果顯示，低溫及Nano-SiO2顆粒染毒均可降低A549細(xì)胞活力和升高炎性因子分泌，且Nano-SiO2和低溫復(fù)合暴露對細(xì)胞活性損傷嚴(yán)重及細(xì)胞炎性因子IL-6和IL-8的表達(dá)水平升高的影響最為顯著，二因素具有交互協(xié)同作用，這一結(jié)果可為冬季霧霾天氣對健康的潛在危害提供理論基礎(chǔ)，以及對制定預(yù)防措施有指導(dǎo)意義。