Apelin-13對LPS誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞屏障損傷的干預作用*

林道朋， 陳 莎， 陸溧玲， 王 玉， 呂芳芳， 施林微， 孔曉霞， 單小鷗， 張海鄰△

((1. 溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院， 浙江 溫州 325035； 2. 鄂東醫(yī)療集團黃石市中心醫(yī)院(湖北理工學院附屬醫(yī)院病理科)， 湖北 黃石 435000； 3. 溫州醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院低氧研究所， 浙江 溫州 325035)

血管內(nèi)皮細胞位于血管壁內(nèi)側，形成半選擇性的通透屏障，調(diào)節(jié)血漿蛋白、溶質、液體和炎癥細胞的轉運[1]。血管內(nèi)皮細胞損傷引起的內(nèi)皮屏障破壞，內(nèi)皮通透性增加是許多急慢性炎癥性疾病發(fā)病機制中必不可少的組成成分，包括急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征、動脈粥樣硬化[2, 3]等。因此保護內(nèi)皮細胞、維持細胞屏障在屏障功能受損相關疾病中具有重要的作用。

Apelin-13是一種新近發(fā)現(xiàn)的生物活性肽，是G蛋白耦聯(lián)受體-血管緊張素受體AT-1相關蛋白(putative receptor protein related to the angiotensin recetor AT-1, APJ)的內(nèi)源性配體[4]。Apelin-13 具有抗炎[5]、保護內(nèi)皮細胞[6]、改善肺動脈高壓[7, 8]等功能。同時有報道指出，Apelin-13能調(diào)節(jié)血管再生[9]以及保護血腦屏障[10]。然而，Apelin-13保護內(nèi)皮細胞屏障的具體機制還尚未闡明。因此，本研究應用人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，通過給予脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)復制內(nèi)皮細胞屏障功能受損模型，觀察Apelin-13對其保護及其具體機制，為內(nèi)皮屏障功能受損及血管炎癥相關疾病的防治提供新的思路和潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

HUVECs購自中國科學院上海細胞庫；Endothelial Cell Medium(ECM)培養(yǎng)基購自ScienCell公司；LPS和Apelin-13購自美國Sigma公司；VE-cadherin抗體、NF-κBp65抗體、F-actin抗體及GAPDH抗體購自Abcam公司；BCA蛋白濃度試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；CCK8試劑盒購自日本DOJINDO公司。

1.2 HUVECs培養(yǎng)

配制完全培養(yǎng)基(5%的胎牛血清，1%生長因子，1%青霉素、鏈霉素雙抗，93%基礎ECM培養(yǎng)基)。HUVECs細胞在37℃，5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待90%融合狀態(tài)傳代及后續(xù)細胞活力、細胞蛋白表達檢測。

1.3 實驗分組及模型制備

細胞隨機分成Control組、LPS組、Apelin-13+LPS組、Apelin-13組。LPS溶于無菌生理鹽水，應用培養(yǎng)基稀釋濃度為5 μg/ml，時間作用24 h，復制屏障功能受損模型。Apelin-13溶于無菌生理鹽水，經(jīng)培養(yǎng)基稀釋，濃度為1 μmol/L。Apelin-13提前30 min給予，再給予LPS作用24 h，確定Apelin的保護作用。

1.4 CCK8檢測細胞活力

選擇對數(shù)期生長細胞，以1×104cells/well的密度鋪于96孔板中(5復孔)，置于細胞培養(yǎng)箱中過夜，予以LPS(0.01 μg/ml、0.1 μg/ml、1 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml)及Apelin-13(0.1 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L)處理24 h，進行藥物濃度篩選。給藥結束后用無菌PBS洗滌孔板2～3次，傾去多余液體，每孔板中加入100 μl基礎培養(yǎng)基，再加入10 μl CCK8溶液，置于37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育2～4 h。多功能酶標儀在波長450 nm處測定各組OD值。實驗重復4次。

1.5 Western blot檢測蛋白表達

無菌4℃預冷的PBS洗滌細胞三次，每次5 min。RIPA蛋白裂解液(RIPA緩沖液與蛋白酶抑制劑PMSF按100∶1比例配制)，以100 μl/well加入6孔板中。用蛋白刮刀刮取細胞中的蛋白質，收集于EP管中，12 000 r/min，4℃，10 min離心，吸取上清，棄沉淀。BCA試劑盒測定蛋白濃度。各管加入4×Loading Buffer，置于100℃，水浴10 min。SDS-PAGE電泳分離蛋白，濕轉法轉移蛋白至PVDF膜上。脫脂牛奶封閉1.5 h，TBST洗滌3次，每次5 min。分別加入特異性抗VE-cadherin、抗F-actin抗體及抗內(nèi)參GAPDH抗體，4℃過夜。次日，TBST洗滌3次，每次5 min。加入髓過氧化物酶標記的相應二抗，室溫搖床孵育1 h，TBST洗滌3次，每次5 min。曝光液按照A液∶B液=1∶1配制，均勻滴在膜上，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)拍照。應用Image J圖像處理軟件分析相應條帶灰度值，計算各組目的蛋白相對表達量。

1.6 免疫熒光檢測蛋白表達

在6孔板內(nèi)放入無菌清潔蓋玻片，接種1×105cells/well，貼壁后給予藥物處理。PBS洗三次，每次5 min。滴加4%多聚甲醛，于冰上固定40 min。棄去多聚甲醛，在空氣中完全干燥，PBS洗3次，每次2 min。固定蓋玻片四角，0.1%Triton打孔20 min，PBS洗3次，每次2 min。用于封閉的5%BSA滴加于載玻片上，靜置30 min。1%BSA配制的一抗4℃孵育過夜。室溫下復溫30 min，PBS洗3次，每次2 min。1%BSA配制的二抗室溫避光孵育2 h，PBS洗3次，每次2 min。DAPI避光染細胞核5 min，PBS洗3次，每次5 min?？篃晒忖鐒┓馄瑹晒怙@微鏡拍片。實驗重復3次。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 Apelin-13對LPS誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞活力的影響

CCK8檢測細胞活力結果顯示：與正常對照組相比，不同濃度(1、5、10 μg/ml)LPS作用于細胞24 h，細胞活力明顯下降，具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而LPS在濃度0.01和0.1 μg/ml對細胞活力無明顯影響。本實驗選擇5 μg/ml LPS做后續(xù)實驗(表1)。而與LPS組相比，不同濃度(0.1 μmol/L、0.5 μmol/L和1 μmol/L)Apelin-13對LPS誘導的細胞活力降低均具有改善作用(P<0.01)，本實驗選擇效果最顯著的藥物濃度為1 μmol/L Apelin-13做后續(xù)實驗。與正常對照組相比，單獨使用Apelin-13，不同濃度Apelin-13對細胞活力無明顯影響(表2)。

Tab. 1 Cell viability in different concentrations of LPS for 24 h(OD, n=4)

Tab. 2 Effects of Apelin-13 on viability of HUVECs induced by LPS(OD, n=4)

2.2 Apelin-13對LPS誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞屏障功能損傷相關蛋白影響

Western blot檢測各組VE-cadherin、F-actin蛋白的表達，結果顯示：與對照組相比，LPS組的黏附連接蛋白VE-cadherin的表達量下降(P<0.01)，構成應力纖維的F-actin表達量上升(P<0.05)，而Apelin-13干預后，顯著改善LPS誘導的蛋白VE-cadherin(P<0.05)和F-actin(P<0.01)的表達改變(圖1，表3)。

Fig. 1 Protein expressions of VE-cadherin and F-actin measured by Western blot

Tab. 3 Relative expression levels of VE-cadherin and F-actin in HUVECs n=3)

2.3 Apelin-13對LPS誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞屏障功能損傷相關蛋白表達的影響

免疫熒光檢測結果顯示：與正常對照組相比，LPS組細胞膜表面VE-cadherin表達減少，細胞間連接連續(xù)性中斷，且F-actin聚集增多，應力纖維形成增加(箭頭)，排列紊亂，細胞間隙增大(三角形)。與LPS組相比，Apelin-13干預后，改善LPS誘導的細胞間VE-cadherin連續(xù)性受損(箭頭)，減輕F-actin聚集，緩解細胞間隙增大。單獨給予Apelin-13處理，與對照組無明顯差異(圖2)。

Fig. 2 Protein expressions of F-actin and VE-cadherin were measured by immunofluorescence

2.4 Apelin-13對LPS誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞NF-κB入核影響

免疫熒光檢測各組細胞中NF-κB p65入核情況，結果顯示：與正常對照組相比，LPS顯著增加NF-κB p65的入核；而與LPS組相比，給予Apelin-13后，明顯減輕LPS對NF-κB p65的入核作用；單獨給予Apelin-13與正常對照組無明顯差異(圖3)。

Fig. 3 Apelin-13 attenuated the nuclear translocation of NF-κB induced by LPS in HUVECs

3 討論

血管內(nèi)皮細胞構成內(nèi)皮屏障，發(fā)揮重要作用，如調(diào)節(jié)血管張力，防止炎性細胞、血細胞滲出等，是維持組織、器官功能的要素之一[11]。血管內(nèi)皮細胞功能失調(diào)導致的屏障功能受損是多種疾病病理特點[12,13]。因此，尋找保護內(nèi)皮細胞及維持其屏障功能的藥物對疾病的治療具有重要意義。

Apelin是一種新近發(fā)現(xiàn)的生物活性肽，在心、肺、腦、腎等組織均有表達，主要以Apelin-13和Apelin-36兩種形式存在[4]。有研究表明，Apelin-13在多種疾病中具有保護作用，可明顯改善油酸及LPS誘導的大鼠急性肺損傷[14, 15]。同時可通過抑制肺血管平滑肌增殖，改善肺動脈高壓[16]。但其對內(nèi)皮屏障功能的作用及機制還尚不明確。本實驗通過LPS誘導HUVECs損傷及屏障功能受損，檢測Apelin-13的保護作用。首先通過CCK8法檢測細胞生存率，結果表明，給予Apelin-13干預明顯減輕細胞損傷，增加細胞存活率。在細胞水平上，Apelin-13對LPS損傷的HUVECs具有保護作用。

細胞間連接中的黏附連接在維持細胞內(nèi)皮屏障功能起著關鍵的作用[17]。VE-cadherin胞內(nèi)段特定結構域通過連環(huán)蛋白Catenin與細胞骨架蛋白F-actin相連，構成粘附連接。當內(nèi)皮細胞受損時，發(fā)生黏附連接結構受損，內(nèi)皮通透性增加[18]。本研究Western blot結果表明， LPS作用于HUVECs內(nèi)皮細胞，VE-cadherin總蛋白表達量下降，骨架蛋白F-actin的表達量上調(diào)。免疫熒光結果進一步證明，細胞間VE-cadherin蛋白表達下降，連接連續(xù)性中斷，細胞內(nèi)應力纖維形成增多，排列紊亂，黏附連接破壞，細胞間隙變大。Apelin-13明顯改善細胞間VE-cadherin連續(xù)性中斷及細胞F-actin骨架的破壞。因此，Apelin-13的屏障保護作用可能與調(diào)節(jié)VE-cadherin等內(nèi)皮細胞間連接相關蛋白有關。

有研究表明，過度激活的炎癥反應導致肺微血管內(nèi)皮細胞屏障功能受損在急性肺損傷中發(fā)揮著舉足輕重的作用[19]。伽馬射線可以通過MAPK/NF-κB途徑破壞HUVECs細胞連接，導致VE-cadherin，ZO-1蛋白降低，通透性增加[20]，暗示炎癥反應可能是導致內(nèi)皮屏障功能受損的重要因素之一。本研究通過免疫熒光檢測NF-κB p65入核，結果顯示，Apelin-13減弱LPS促進NF-κB p65入核作用，說明Apelin-13抑制LPS誘導的內(nèi)皮細胞炎癥。據(jù)此，我們推測Apelin-13對內(nèi)皮黏附連接的保護作用可能與抑制NF-κB入核有關，但具體作用機制仍需進一步研究證明。

綜上所述，我們推測，在LPS誘導的HUVECs細胞損傷及屏障功能受損中，炎癥反應是損傷內(nèi)皮屏障功能的重要因素。應用Apelin-13可以改善LPS誘導的HUVECs屏障的損傷，其保護作用可能與抑制炎癥相關。這為內(nèi)皮屏障受損相關疾病的治療和新藥開發(fā)提供新的理論依據(jù)。