T16Ainh-A01對耳蝸血管紋毛細血管內皮細胞凋亡及衰老的影響*

馮子奕, 李雪蕊, 陳 龍, 周 穎, 常越辰, 馬克濤, 司軍強, 李 麗

(1. 石河子大學醫(yī)學院生理教研室， 石河子 832002； 2. 武漢市中心醫(yī)院， 武漢 430000； 3. 石河子大學醫(yī)學院教學實驗中心， 石河子 832002； 4. 嘉興學院醫(yī)學院， 嘉興 314000)

老年性耳聾(presbycusis)已成為嚴重影響老年人生活質量的退行性疾病[1]，其中耳蝸血管紋萎縮是影響老年性耳聾的重要因素之一。前期本實驗室研究發(fā)現鈣激活氯離子通道(calcium-activated chloride channels, CaCCs)的主要組成蛋白跨膜蛋白16A(TMEM16A)在豚鼠耳蝸血管紋上廣泛表達[2]。內皮細胞(endothelial cells, ECs)作為組成耳蝸血管紋毛細血管網的重要細胞，對維持耳蝸內電位穩(wěn)態(tài)具有重要意義[3, 4]。本實驗發(fā)現耳蝸血管紋毛細血管ECs上廣泛表達TMEM16A，但其具體功能意義尚不清楚。本文通過觀察耳蝸血管紋毛細血管ECs衰老過程中TMEM16A的變化，給予特異性阻斷劑T16Ainh-A01后觀察ECs凋亡及衰老的改變，從而探討TMEM16A是否參與豚鼠耳蝸血管紋毛細血管ECs的凋亡和衰老過程，為老年性耳聾的防治提供新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

2周齡左右的新生雜色豚鼠，雌雄不拘，體重約在200 g，購自于新疆醫(yī)科大學動物實驗中心(動物實驗設施許可證編號：CXK New 2003-0001),所有實驗均嚴格遵守《石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院動物實驗倫理委員會條例》。

1.2 主要試劑

戊巴比妥鈉(上海生工)；ECM培養(yǎng)基(Sciencell，美國)；胎牛血清、青霉素和鏈霉素(Gibco，美國)；CCK-8(日本同仁)；衰老相關β-半乳糖苷酶測定試劑盒(碧云天)；DMSO (Sigma,美國)；小鼠抗β-actin單抗(Thermo，美國)；Anti-vWF抗體、Anti-Bcl-2抗體、Anti-casepase-3抗體、Anti-Bax抗體、Anti-TMEM16A抗體，驢抗羊IgG二抗；T16Ainh-A01 (Abcam公司，英國)；山羊抗兔二抗，山羊抗小鼠二抗、山羊抗兔IgG/FITC標記二抗(北京中杉金橋，中國)、Annexin V-FITC試劑盒(杭州聯科生物，中國)。

1.3 主要儀器

非接觸式激光共聚焦顯微鏡(LSM510)(Carl Zeiss公司，德國)；凝膠成像儀(UVP公司，美國)；流式細胞儀(BD公司，美國)；倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)；酶標儀(BIO-RAD，美國)；ECL化學發(fā)光儀(美國Protein Simple公司)。

1.4 豚鼠耳蝸血管紋毛細血管ECs培養(yǎng)

選取2周齡重約200 g左右雜色豚鼠，用1%戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉，迅速取出雙側耳蝸并放入裝有無菌D-HANKs液的培養(yǎng)皿中，解剖顯微鏡下用眼科鑷去除聽泡外側壁，取出纏繞在蝸軸的軟組織，分離深褐色血管紋，將其撕碎呈0.15～0.2 mm2大小，并平鋪于含有內皮選擇性ECM培養(yǎng)基的35 mm2的培養(yǎng)皿中，置于5% CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，前兩天不更換液體，培養(yǎng)48 h，細胞沿組織邊緣爬出，每2 d更換1/2培養(yǎng)基，待培養(yǎng)第12日細胞密度達到90%時，細胞按1∶2進行傳代，最后以 1.5×104cells/ml密度接種于60 mm2含ECM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。

1.5 豚鼠耳蝸血管紋毛細血管ECs鑒定

將細胞接種在蓋玻片上進行爬片，棄去培養(yǎng)基，用PBS緩慢洗滌，用4%多聚甲醛固定，PBS洗滌后加入0.2%Triton-100破膜，PBS洗滌后加入5%BSA封閉，加入1∶100抗驢vWF抗體4℃濕盒過夜，PBS洗滌三次后避光加入驢抗羊熒光二抗，37℃溫箱孵育1～2 h，PBS洗滌后加入DAPI，溫箱孵育15 min，封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.6 耳蝸血管紋毛細血管ECs衰老模型的建立

取第1代細胞連續(xù)傳代，構建復制性衰老模型，通過CCK-8及SA-β-gal活性評價第3代、第6代、第9代、第12代、第15代細胞活性及衰老細胞比例來篩選衰老細胞代數。

1.6.1 CCK-8檢測 取第3、6、9、12、15 代的細胞以每孔10 000個細胞接種于96孔板中，待其貼壁加入CCK-8工作液(10 μl/well)，37℃孵育2 h，酶標儀450 nm波長測定OD值來分析細胞活性。

1.6.2 β-半乳糖苷酶染色檢測耳蝸血管紋毛細血管內皮細胞衰老程度 用0.25%胰酶消化各組細胞，以5×103cells/well的密度接種于12孔板中，待其貼壁后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入0.5 ml β-半乳糖苷酶染色固定液，固定15 min，PBS洗滌3次，每次3 min，每孔加入0.5 ml染色液，37℃無CO2溫箱中過夜孵育，普通光學顯微鏡下觀察，通過對陽性藍染的細胞計數來判定衰老程度。

1.7 實驗分組

選取第3代細胞(P3)為年輕組，第12代細胞(P12)為衰老組，其中衰老組再分為DMSO溶劑組及T16Ainh-A01組(給予TMEM16A特異性阻斷劑30 μmol/L T16Ainh-A01干預24 h)。

1.8 流式細胞術檢測耳蝸血管紋毛細血管ECs凋亡率

0.25%胰酶消化收集各組細胞, PBS洗滌2次, 1 000 r/min離心5 min, 棄上清收集5×105cells, 加500 μl 1×結合緩沖液重懸細胞;加入5 μl Annexin V-FITC混勻并室溫避光反應30 min, 加入10 μl PI混勻并室溫避光反應10 min，在1 h內進行流式細胞儀檢測。

1.9 免疫熒光檢測ECs上TMEM16A表達情況

從CO2培養(yǎng)箱取出處理后的細胞, 棄掉培養(yǎng)基;預溫的PBS洗3次, 4%多聚甲醛固定細胞10 min, PBS洗3次; 0.5%BSA 37℃恒溫封閉30 min, 棄封閉液, PBS洗3次；兔抗TMEM16A抗體(1∶100), 置于濕盒內4℃過夜；按1∶50比例暗室中滴加FITC標記的山羊抗兔IgG二抗, 37℃恒溫孵育2 h；DAPI染核15 min，PBS洗3次，抗熒光衰減封片劑封片, 激光共聚焦顯微鏡下觀察并采像。圖像采集后使用Image J 2×軟件進行分析。

1.10 Western blot檢測蛋白表達水平

棄掉處理后的各組細胞的培養(yǎng)基，用預溫的PBS洗3次，每次2 min，加入細胞組織裂解液，將培養(yǎng)皿放置于冰上裂解20 min。細胞刮刀均勻刮落貼壁細胞并收集與EP管中，4℃，12 000 r/min離心15 min，采用BCA法測定蛋白濃度，加上樣緩沖液配平，100℃10 min, 蛋白保存在-20℃。SDS-PAGE分離后，轉印到0.45 μm或0.22 μm的PVDF膜上，封閉液中室溫封閉2 h。分別孵育兔抗TMEM16A抗體 (1∶1 000) 、兔抗Bcl-2抗體 (1∶1 000)、兔抗Bax抗體 (1∶1 000)、兔抗casepase-3抗體 (1∶1 000)、小鼠抗β-actin抗體 (1∶1 000)，4℃過夜，TBST洗膜，分別孵育辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG (1∶5 000)或抗小鼠IgG (1∶25 000)，室溫搖床孵育2 h，TBST洗膜10 min×3次，用化學發(fā)光儀曝光，拍照。

1.11 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 豚鼠耳蝸血管紋毛細血管ECs的培養(yǎng)及鑒定

豚鼠耳蝸血管紋毛細血管ECs培養(yǎng)48 h，細胞沿血管紋組織塊邊緣爬出(圖1A①)，培養(yǎng)12 d，細胞大量增殖(圖1A②)；培養(yǎng)20 d細胞呈緊密排列，融合成片狀單層，鏡下呈典型的鋪路石樣外觀 (圖1A③)。用免疫熒光檢測內皮細胞特異性蛋白Ⅷ因子相關抗原(von Willebrand Factor, vWF)的表達，95%以上的細胞核及胞質呈紅色熒光著色(圖1B，圖1見彩圖頁Ⅰ)。

2.2 耳蝸血管紋毛細血管ECs細胞活力及衰老程度的測定

原代培養(yǎng)的耳蝸血管紋毛細血管ECs通過復制性傳代建立衰老模型。如表1所示，利用CCK-8試劑盒檢測細胞活性，結果顯示與第3代(P3)相比，第12代(P12)ECs細胞活性無明顯變化且無統(tǒng)計學差異，而第15代(P15)ECs細胞活性顯著降低 (P<0.01)；如圖2所示，β-半乳糖苷酶染色顯示，與第3代(P3)相比，第6代(P6)、第9代(P9)及第12代(P12)陽性藍染的細胞逐漸增多(P<0.01)，第15代(P15)衰老細胞光鏡下觀察細胞形態(tài)變大，胞漿中可見空泡及顆粒物，邊界不清且立體感弱。故后續(xù)實驗衰老組選取第12代細胞。

Fig. 2 SA-β-gal staining of cochlear endothelial cells in different passage number (×200)

Tab. 1 Activity of cells in each group was detected by CCK-8 assay and β-galactosidase activity in each group was detected by SA-β-gal staining (%， n=3)

2.3 衰老耳蝸血管紋毛細血管ECs上TMEM16A表達變化

免疫熒光顯示，TMEM16A表達于原代培養(yǎng)的耳蝸毛細血管ECs且主要表達于胞質，衰老組(P12)ECs上TMEM16A熒光強度(1.88±0.24)較年輕組(P3)(1.00±0.12)明顯增強(P<0.01)。Western blot結果顯示，衰老組(P12)ECs上TMEM16A蛋白表達(1.21±0.10)較年輕組(P3)(0.93±0.04)增強(P<0.05，圖3，見彩圖頁Ⅰ)。

2.4 TMEM16A特異性阻斷劑T16Ainh-A01對耳蝸血管紋毛細血管ECs凋亡的影響

2.4.1 T16Ainh-A01對凋亡率的影響 如表2所示，Annexin V-FITC/PI雙染色結果顯示，與衰老組(P12)ECs相比，給予30 μmol/L T16Ainh-A01干預24 h后，細胞早期凋亡率下降(P<0.05)，晚期凋亡率明顯下降(P<0.01)。

Tab. 2 The apoptosis rate of cochlear endothelial cells in each group detected by flow cytometry n=3)

2.4.2 T16Ainh-A01對凋亡蛋白表達的影響 如圖4所示，Western blot結果顯示，與衰老組(P12)ECs相比，給予T16Ainh-A01干預后ECs凋亡蛋白Bax、cleaved casepase-3的表達明顯下降(P<0.01), Bcl-2的蛋白表達增加(P<0.05)。

2.5 TMEM16A特異性阻斷劑T16Ainh-A01對耳蝸血管紋毛細血管ECs衰老的影響

如圖5所示，SA-β-gal染色結果顯示，與衰老組(P12)ECs相比，給予T16Ainh-A01干預后耳蝸血管紋毛細血管ECs藍染率明顯降低(P<0.01)。

Fig. 4 Immunoblotting bands of cleaved casepase-3, Bax, Bcl-2 protein(n=3)

Tab. 3 The expressions of cleaved casepase-3, Bax, Bcl-2 protein in each n=3)

Fig. 5 SA-β-gal staining of cochlear endothelial cells n=3)

3 討論

血管紋性老年聾(stria vascularis hearing loss，SVHL)是老年性耳聾的重要組成部分，以血管紋萎縮為主要特征[5]。耳蝸血管紋內皮細胞(ECs)作為血迷路屏障(blood-labyrinth barrier, BLB)的重要組成，對維持耳蝸內電位穩(wěn)態(tài)及調節(jié)BLB通透性具有重要意義[3, 4]。目前對血管紋毛細血管ECs的研究主要集中于形態(tài)學改變[6]，對其機制及調控方面研究甚少。血管ECs衰老主要通過端粒依賴性復制性衰老和應激誘發(fā)的早衰兩種機制,前者隨培養(yǎng)增殖，細胞分裂能力減退、消失甚至凋亡；后者是由H2O2、氧化酶等藥物制造細胞氧化損傷的非生理性的衰老[7, 8]。我們采用連續(xù)傳代模型更自然模擬ECs衰老過程，選取第12代細胞作為衰老組進行后續(xù)研究。

TMEM16A作為鈣激活氯通道(calcium-activated chloride channels, CaCCs)主要組成蛋白，在許多生物活動中都發(fā)揮重要作用[9]。在耳蝸中已有研究表明TMEM16A存在于分離的耳蝸邊緣細胞[10]和分離的Corti器漢森細胞(Hensen cell)上[11]，參與調節(jié)耳蝸內淋巴容積、Cl-的轉運及分泌[12]。本課題組前期研究發(fā)現豚鼠耳蝸血管紋也表達TMEM16A[2]，本實驗研究發(fā)現，耳蝸血管紋毛細血管ECs表達TMEM16A，但TMEM16A在耳蝸血管紋毛細血管ECs的功能意義尚不清楚。

TMEM16A表達及功能因表達部位不同而存在差異，早期研究TMEM16A在腫瘤增殖[13]、肺動脈平滑肌細胞增殖[14]及調節(jié)血管張力[15]上發(fā)揮重要作用。近期有學者發(fā)現上調TMEM16A可以誘導肺內皮細胞凋亡[16]，TMEM16A過表達可通過線粒體途徑促進腦基底平滑肌細胞凋亡[17]，這說明TMEM16A與細胞凋亡密切相關。另有文獻報道，激活TMEM16A可導致細胞內大量Cl-外流，細胞膜去極化，同時Ca2+從內質網中釋放到細胞質中，Ca2+濃度升高又可激活CaCCs，細胞內大量的Ca2+可導致細胞的衰老或死亡[18]，提示TMEM16A的激活可以間接導致細胞的衰老。老年性耳聾可引起耳蝸細胞變性、細胞自噬及凋亡增加[19]，TMEM16A與細胞凋亡和衰老密切相關，但TMEM16A是否在耳蝸中調節(jié)ECs凋亡及衰老目前尚不清楚。本研究發(fā)現，衰老組ECs上TMEM16A蛋白表達水平較年輕組明顯升高，給予TMEM16A特異性阻斷劑T16Ainh-01后，衰老組ECs凋亡率明顯下降，凋亡蛋白Bax、cleaved casepase-3的表達明顯減少，同時還能降低細胞SA-β-gal衰老細胞藍染率，提示TMEM16A可能參與耳蝸血管紋ECs的凋亡及衰老過程。

細胞凋亡是生物進化過程中普遍存在的細胞死亡方式，研究表明年齡相關性聽力功能衰退時耳蝸中細胞發(fā)生凋亡，這是導致聽力下降的重要原因[20]，耳蝸中細胞凋亡率間接反應老年人聽力衰退程度。本研究結果顯示衰老組細胞凋亡率增高，給予TMEM16A特異性阻斷劑T16Ainh-01后衰老組ECs的凋亡率明顯降低，減少ECs的凋亡，可以促進內皮細胞的增殖及損傷修復，從而改變衰老引起的耳蝸缺血缺氧損傷。由此推斷，T16Ainh-01可能通過抑制衰老耳蝸血管紋毛細血管ECs凋亡，起到延緩聽力減退的效果。

綜上所述，TMEM16A可能作為耳蝸血管紋毛細血管ECs凋亡的調節(jié)分子，通過促進ECs的凋亡進而影響耳蝸血管紋衰老過程，但具體機制仍有待研究。