一株產酸克雷伯氏菌發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

楊丹丹，張心青，楊傳倫，馬娜娜, 李佳明

(1.黃河三角洲京博化工研究院有限公司，山東 濱州 256500；2.山東京博環(huán)保材料有限公司，山東 濱州 256500)

氮、磷、鉀作為農作物生長發(fā)育所必需的三大營養(yǎng)元素，在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著極其重要的作用。有研究表明，我國有74%的耕地土壤缺磷，而且95%以上的磷以不能被植物直接吸收利用的磷酸鹽形式存在于土壤中[1-2]；約有60%的耕地土壤缺鉀，95%的鉀以礦物鉀形態(tài)存在，不能被植物直接吸收利用，土壤中少量的速效鉀含量還在以很高的速度不斷下降，造成土壤中速效鉀的缺乏[3]。為了維持農業(yè)生產，一般通過施用磷肥、鉀肥來滿足植物對磷、鉀素的需求。每年施用的大量磷肥、鉀肥雖然能夠增加農作物的產量，但卻破壞了土壤結構，且容易造成環(huán)境污染[4-6]。所以，開發(fā)新的高效解磷、解鉀菌株制成的微生物菌肥，釋放土壤中固定的磷、鉀資源，這對發(fā)展生態(tài)農業(yè)具有十分重要的意義。 微生物菌肥作為生物技術發(fā)展的產物和農業(yè)生產中的重要肥源，對作物生長和土壤環(huán)境具有重要的影響[7]。單一功能菌肥包括固氮菌菌肥、解磷菌菌肥、解鉀菌菌肥和硅酸鹽細菌菌肥等[8-10]，其作用機理是通過改善土壤的理化特性，提供作物所需的營養(yǎng)元素，改善植物對營養(yǎng)的吸收[11]。大量研究表明，微生物菌肥施入土壤后能改善土壤結構，增強土壤肥力，可將空氣中的氮轉化為栽培作物可利用的氮，將土壤中難以被利用的磷、鉀元素轉化為易于作物吸收的磷、鉀，促進作物的生長，增強作物的抗病性,提高作物的品質和產量，同時還具有低投入，高產出，無污染的特點，能夠減少氮肥量的施用，并獲得與化學肥料相同的增產比率[12-4]。產酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)就是一株同時具有解磷、解鉀、固氮、耐鹽和促進作物生長的菌株，可制成微生物菌肥，有效改善土壤團粒結構。該菌株從番茄植株根周和根際土壤中經過多重篩選獲得，通過對培養(yǎng)條件、碳源、氮源、無機鹽單因素實驗及響應面實驗培養(yǎng)基優(yōu)化，提高發(fā)酵菌量，并進行30 L罐擴大培養(yǎng)，從而提高發(fā)酵水平，為該菌株的產業(yè)化應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 產酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)：保藏編號為CGMCC No.17360

1.1.2 培養(yǎng)基 ①固體LB斜面培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.4。②液體LB種子培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.4。③初始發(fā)酵培養(yǎng)基(質量分數，%)：豆粕2.0，玉米粉1.0，葡萄糖1.0，尿素0.06，玉米漿干粉0.5，蛋白胨0.05，硫酸鎂0.04，磷酸二氫鉀0.02，氯化鈉0.02，pH 7.0～7.4。

1.1.3 儀器與設備 HS-800D恒溫水槽(太倉市利達實驗設備有限公司)；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)；722型可見分光光度計(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)；精密pH計(上海雷磁儀器廠)；HC-2518R高速冷凍離心機(科大創(chuàng)新有限公司中佳分公司)；超凈工作臺(蘇州凈化公司)；Leica DM IL LED 倒置顯微鏡(徠卡顯微系統(tǒng)貿易有限公司)；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)；30 L發(fā)酵罐(上海百倫生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 種子液制備 取斜面菌種 2 環(huán)接種于種子培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)15 h。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng) 以2%(體積分數) 的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)48 h。

1.2.3 檢測方法 稀釋平板涂布法。

1.2.4 實驗設計 ①不同培養(yǎng)條件對產酸克雷伯氏菌發(fā)酵活菌量的影響：分別進行不同溫度、pH對雷伯氏菌發(fā)酵活菌量的影響實驗。②不同碳源對產酸克雷伯氏菌發(fā)酵菌量的影響：在初始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎上，選擇速效碳源(1.0%的葡萄糖、蔗糖、麥芽糊精)和緩效碳源(1.0%的玉米粉、玉米淀粉、可溶性淀粉)兩兩組合，設計9組實驗配方，搖瓶100/500 mL裝液量，37 ℃，180 r/min，發(fā)酵48 h。③不同氮源對產酸克雷伯氏菌發(fā)酵菌量的影響：在初始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎上，選擇速效氮源(0.05%的尿素、硫酸銨、氯化銨)和緩效氮源(2%的豆粕、玉米漿干粉、黃豆餅粉)兩兩組合，設計9組實驗配方，搖瓶100/500 mL裝液量，37 ℃，180 r/min，發(fā)酵48 h。④不同無機鹽對產酸克雷伯氏菌發(fā)酵活菌量的影響：分別對硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鈉、硫酸錳進行單因素梯度實驗，以優(yōu)化最佳無機鹽含量。⑤Plackett-Burman設計實驗：在初始發(fā)酵培養(yǎng)基及碳源、氮源對產酸克雷伯氏菌發(fā)酵菌量的影響實驗的基礎上，選擇黃豆餅粉、玉米粉、蔗糖、硫酸銨、氯化鈉、硫酸錳、磷酸二氫鉀、硫酸鎂8個因子進行PB設計。⑥最陡爬坡實驗：根據Plackett-Burman實驗分析結果設計最陡爬坡實驗，以實驗值變化的梯度方向為爬坡方向，根據各因素效應值的大小確定變化步長，能快速、經濟地逼近最佳值區(qū)域[15]。⑦中心組合設計：以爬坡設計得出的實驗結果為依據進行Central Composote Design設計，用軟件Design Expert8.0.6 對實驗進行回歸分析并且進行誤差分析并求得最優(yōu)值，得出響應面分析結果，進而確定最佳培養(yǎng)條件，最后依據回歸方程繪制響應面分析圖。⑧30 L發(fā)酵罐擴大實驗：對培養(yǎng)基優(yōu)化的最佳配方進行30 L發(fā)酵罐擴大驗證，培養(yǎng)條件參照搖瓶實驗。

2 結果與分析

2.1 不同培養(yǎng)條件對產酸克雷伯氏菌發(fā)酵活菌量的影響

2.1.1 不同溫度對產酸克雷伯氏菌發(fā)酵活菌量的影響 以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為培養(yǎng)基質，搖瓶裝液量100/500 mL，選擇30、35、37、40 ℃為發(fā)酵溫度，180 r/min發(fā)酵48 h，發(fā)酵結束后，檢測活菌量，結果如圖1所示，產酸克雷伯氏菌活菌量受溫度影響較大，過高和過低均對活菌量有一定影響，溫度為37 ℃時活菌量最高，因此37 ℃為最佳溫度。

圖1 不同溫度對產酸克雷伯氏菌發(fā)酵活菌量的影響Fig.1 Effect of different temperature on the amount of viable Klebsiella oxytoca

2.1.2 不同初始pH對產酸克雷伯氏菌發(fā)酵活菌量的影響 以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為培養(yǎng)基質，選擇初始pH值分別為6.2、6.6、7.0、7.4、7.8進行產酸克雷伯氏菌發(fā)酵條件篩選，搖瓶100/500 mL裝液量，37 ℃，發(fā)酵48 h，檢測活菌量，結果如圖2所示。該菌量在pH值6.2～7.0的范圍內隨著pH值的增加而增加，高于7.4則隨著pH值的增加而減少，故最佳pH值為7.0～7.4。

圖2 不同初始pH值對產酸克雷伯氏菌發(fā)酵活菌量的影響Fig.2 Effect of different initial pH on the amount of viable Klebsiella oxytoca

2.2 不同碳源對產酸克雷伯氏菌發(fā)酵活菌量的影響

如表1所示，初始發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)的產酸克雷伯氏菌的活菌量為1.202×1010cfu/mL，添加1.0%蔗糖+1.0%玉米粉活菌量最高，為1.426×1010cfu/mL；碳源對活菌量影響由高到低依次為速效碳源蔗糖>葡萄糖>麥芽糊精；緩效碳源玉米粉>玉米淀粉>可溶性淀粉，且蔗糖和玉米粉來源廣、價格低，故選擇1.0%蔗糖+1.0%玉米粉作為產酸克雷伯氏菌發(fā)酵的最佳碳源。

表1 不同碳源對產酸克雷伯氏菌發(fā)酵活菌量的影響

2.3 不同氮源對產酸克雷伯氏菌發(fā)酵活菌量的影響

如表2所示，初始發(fā)酵培養(yǎng)基活菌量為1.202×1010cfu/mL，2.0%黃豆餅粉+0.05%硫酸銨活菌量最高，為1.383×1010cfu/mL；氮源對活菌量的影響分別為速效氮源硫酸銨>氯化銨>尿素，緩效氮源黃豆餅粉>豆粕>玉米漿干粉，故選擇2.0%黃豆餅粉+0.05%硫酸銨作為產酸克雷伯氏菌發(fā)酵的最佳氮源。

2.4 不同無機鹽對產酸克雷伯氏菌發(fā)酵活菌量的影響

2.4.1 硫酸鎂對產酸克雷伯氏菌活菌量的影響 將初始發(fā)酵培養(yǎng)基中硫酸鎂的含量分別設置為0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%，發(fā)酵2 d后檢測活菌量如圖3所示，隨著硫酸鎂含量的逐漸增加，活菌量呈現先增加后降低的現象，硫酸鎂為0.06%時，活菌量最高。

表2 不同氮源對產酸克雷伯氏菌發(fā)酵活菌量的影響

圖3 硫酸鎂對產酸克雷伯氏菌發(fā)酵活菌量的影響Fig.3 Effect of magnesium sulfate on the amount of viable Klebsiella oxytoca

2.4.2 磷酸二氫鉀對產酸克雷伯氏菌活菌量的影響 將初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的磷酸二氫鉀含量分別設置為0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%，發(fā)酵2 d，檢測活菌量，如圖4所示，當磷酸二氫鉀含量低于0.02%時，活菌量呈下降趨勢；磷酸二氫鉀含量高于0.02%，活菌量未增加，故磷酸二氫鉀最佳含量為0.02%。

圖4 磷酸二氫鉀對產酸克雷伯氏菌發(fā)酵活菌量的影響Fig.4 Effect of potassium dihydrogen phosphae on the amount of viable Klebsiella oxytoca

2.4.3 氯化鈉對產酸克雷伯氏菌活菌量的影響 將初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的氯化鈉含量設置為0.01%、0.03%、0.05%、0.07%、0.09%，發(fā)酵2 d，結果如圖5，氯化鈉含量在0.01%～0.09%區(qū)間變化時，對活菌量影響較大，活菌量先增加后降低，當氯化鈉含量為0.07%時，活菌量最高。

圖5 氯化鈉對產酸克雷伯氏菌發(fā)酵活菌量的影響Fig.5 Effect of sodium chloride on the amount of viable Klebsiella oxytoca

2.4.4 硫酸錳對產酸克雷伯氏菌活菌量的影響 將初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的硫酸錳含量分別設置為0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%，發(fā)酵2 d，結果如圖6，硫酸錳在0.01%～0.05%變化時，對活菌量影響較大，當硫酸錳含量為0.03%時，活菌量最高。

圖6 硫酸錳對產酸克雷伯氏菌發(fā)酵活菌量的影響Fig.6 Effect of manganese sulfate on the amount of viable Klebsiella oxytoca

2.5 Plackett-Burman設計實驗

Plackett-Burman 設計實驗見表3，每個因素取高低 2個水平。搖瓶100/500 mL裝液量，37 ℃，180 r/min，發(fā)酵48 h，檢測活菌量，檢測結果如表4所示，采用Design Expert8.0.6軟件進行分析得到最佳擬合方程：

活菌量=152.46+9.96A-0.47B+18.32C+0.81D-25.14E+1.63F-3.66 G+1.49H

分析結果可知，此模型的P值為0.0196，證明此模型顯著，具有統(tǒng)計學意義，其決定系數為0.978 7，校正系數為0.922 0，也能說明該模型的合理性。如表5所示，各因子對產酸克雷伯氏菌發(fā)酵水平影響大小依次是E>C>A>G>F>H>D>B,即氯化鈉>蔗糖>黃豆餅粉>磷酸二氫鉀>硫酸錳>硫酸鎂>硫酸銨>玉米粉，對產孢子有顯著影響(P<0.05)的因素為氯化鈉、蔗糖、黃豆餅粉。然后進行響應面分析實驗，其中氯化鈉是負效應，蔗糖、黃豆餅粉是正效應，其他因素的變化對產孢子影響不顯著，根據各因素的影響效應進行最陡爬坡實驗的設計。

表3 Plackett-Burman實驗設計各因素與水平

2.6 最陡爬坡實驗

通過Plackett-Burman實驗分析結果可知，影響產酸克雷伯氏菌發(fā)酵活菌量的重要因子依次是氯化鈉>蔗糖>黃豆餅粉，根據其正負效應進行依次增加或減小設計，氯化鈉是負效應，依次減??；蔗糖、黃豆餅粉是正效應，依次增加，最陡爬坡實驗設計如表6所示，搖瓶100/500 mL裝液量，37 ℃，180 r/min，發(fā)酵48 h，檢測實驗結果可知，隨著氯化鈉含量逐漸減小，蔗糖、黃豆餅粉含量逐漸增大，產酸克雷伯氏菌活菌量呈先增加后減小的變化。當氯化鈉為0.075%，蔗糖為 1.1%，黃豆餅粉為2.2%時，活菌量達到最高，運用中心組合設計進行下一步優(yōu)化。

表4 Plackett-Burman實驗設計及檢測結果

表5 Plackett-Burman實驗分析結果

表6 最陡爬坡實驗設計

2.7 中心組合設計

以Y活菌量為響應值，以A(氯化鈉)、B(蔗糖)、C(黃豆餅粉)為自變量，采用中心組合設計進一步優(yōu)化實驗。實驗因子和水平如表7所示，搖瓶100/500 mL裝液量，37 ℃，180 r/min，發(fā)酵48 h，結果如表8所示。使用Design Expert8.0.6軟件對實驗數據進行方差分析和二次多項回歸擬合，得到多元二次回歸方程：

Y=215.25+5.91A+0.66B-2.63C-0.54AB+1.26AC-0.11BC-3.36A2-7.85B2-13.44C2

回歸分析見表9，結果表明，模型決定系數為0.963 1，矯正決定系數為0.929 9，存在顯著差異，F值為29.01(P<0.000 1)，說明此模型高度顯著，因素A、C對孢子量影響顯著，而B不顯著；AB、AC、BC兩兩交互效應不顯著。

表7 Central Composote Design實驗因子和水平

表8 Central Composote Design實驗設計

表9 Central Composote Design的多元二次模型和變量分析

使用Design Expert8.0.6軟件繪制響應面立體分析圖及其等高線，考察所擬合的相應曲面的形狀響應面立體圖如圖7～9所示。從圖7～9交互影響效應的等高線圖可知，三個等高線圖均略呈橢圓形，說明各因素之間交互作用對活菌量有一定的影響，但不顯著；響應面分析立體圖則反映分別固定黃豆餅粉、蔗糖、氯化鈉，另外兩個因素相互變化的趨勢，三個曲面的頂點即可反映活菌量最高點，所對應的含量即為最佳含量。

由模型可得當氯化鈉0.080%、蔗糖1.10%、黃豆餅粉2.19%時，預測的最大響應值為2.176×1010cfu/mL。為了檢驗模型預測的準確性，需進行重復驗證實驗，搖瓶100/500 mL裝液量，37 ℃，180 r/min，發(fā)酵48 h，實驗進行3次，所得實際的活菌量分別為2.177×1010、2.172×1010、2.180×1010cfu/mL，平均值2.176×1010cfu/mL，比初始發(fā)酵配方活菌量提高81.1%，且該結果與預測值十分接近，可見該模型具有較高的準確性，可預測實際發(fā)酵結果。配方(質量分數)：黃豆餅粉2.19%，玉米粉1.0%，蔗糖1.10%，硫酸銨0.06%，玉米漿干粉0.5%，蛋白胨0.05%，硫酸鎂0.04%，磷酸二氫鉀0.02%，氯化鈉0.080%，硫酸錳0.03%，pH 7.0～7.4。

圖7 B蔗糖(%)-A氯化鈉(%)對活菌量交互影響效應的等高線圖及響應面分析立體圖(C黃豆餅粉2.20%)Fig.7 Contour map and response surface analysis stereogram of interaction effect of A sodium chloride(%)-B sucrose(%) on viable biomass (C soybean cake powder 2.20%)

圖8 A氯化鈉(%)-C黃豆餅粉(%)對活菌量交互影響效應的等高線圖及響應面分析立體圖(B蔗糖1.10%)Fig.8 Contour map of interaction effect of A sodium chloride(%)-C soybean cake powder(%) on viable biomass And response surface analysis stereogram (B sucrose 1.10%)

圖9 B蔗糖(%)-C黃豆餅粉(%)對活菌量交互影響效應的等高線圖及響應面分析立體圖(A氯化鈉0.080%)Fig.9 Contour map and response surface analysis stereogram of interaction effect of B sucrose(%)-C soybean cake powder(%) on viable biomass (A sodium chloride 0.080%)

2.8 30 L發(fā)酵罐驗證

對產酸克雷伯氏菌最終發(fā)酵配方進行30 L發(fā)酵罐驗證，接種量5%(體積分數)，培養(yǎng)溫度37 ℃，初始pH 7.0，發(fā)酵罐罐壓0.05 Mpa，初始轉速200 r/min，初始通氣量10 L/min，轉速最高500 r/min，通氣量最高30 L/min，發(fā)酵過程控制DO≥20 mg/L，發(fā)酵周期12～18 h，根據菌種生長情況放罐，具體為溶氧回升pH回升,驗證3批，活菌量分別為2.250×1010、2.270×1010、2.285×1010cfu/mL，由此可知，放大后工藝穩(wěn)定，發(fā)酵水平高，可進一步發(fā)酵生產。

3 討 論

通過單因素優(yōu)化研究了培養(yǎng)條件、碳源、氮源、無機鹽對產酸克雷伯氏菌活菌量的影響，并利用響應面分析法對影響產酸克雷伯氏菌活菌量的關鍵因子進行了優(yōu)化，得出最佳培養(yǎng)基配方，通過30 L發(fā)酵罐進行擴大培養(yǎng)。結果表明，產酸克雷伯氏菌最佳配方為黃豆餅粉2.19%，玉米粉1.0%，蔗糖1.10%，硫酸銨0.06%，玉米漿干粉0.5%，蛋白胨0.05%，硫酸鎂0.04%，磷酸二氫鉀0.02%，氯化鈉0.080%，硫酸錳0.03%，pH 7.0～7.4，活菌量可穩(wěn)定在2.0×1010cfu/mL以上，能夠滿足生產要求，為產酸克雷伯氏菌微生物菌肥的應用提供技術支持。

產酸克雷伯氏菌為腸桿菌科中一類具有兼性好氧特性的革蘭陰性菌，可用于生產1，3-丙二醇[16]。桂妍雯等[17]對產酸克雷伯氏菌利用甘油生產1，3-丙二醇(1，3-PD)的培養(yǎng)條件進行優(yōu)化；任良棟等[18]通過對 4 種常見的包埋材料固定化產酸克雷伯氏菌發(fā)酵生產 1，3-丙二醇；李莉莉等[19]研究磷酸根對發(fā)酵對的影響。另外，也有部分文獻研究產酸克雷伯氏菌發(fā)酵生產其他代謝產物，白雪蕊等[20]研究產酸克雷伯氏菌發(fā)酵生產產絮凝劑，傅明亮等[21]研究產酸克雷伯氏菌發(fā)酵生產酸性脲酶，崔娜娜等[22]研究該菌發(fā)酵產胞外多糖。本研究中的產酸克雷伯氏菌作為一株同時具有解磷、解鉀、固氮、耐鹽和促進作物生長的菌株，能夠在減少肥料施用量的同時提高作物產量，并可適用于鹽堿地施用。目前有關解磷、解鉀、固氮等微生物菌劑的研究居多[23-25]，但多數是具有單一功能的菌株，而本研究中的產酸克雷伯氏菌則兼具以上多種功能，制成的微生物菌肥，在后期應用于生產，取得了良好的效果。

目前，關于產酸克雷伯氏菌活菌量發(fā)酵的研究尚少，本研究進行一系列的試驗來提高產酸克雷伯氏菌發(fā)酵水平，為微生物菌肥的大規(guī)模生產提供參考。本研究配方中所涉及的原料仍有一定的局限性，在微生物菌肥長期的生產過程中可作進一步的優(yōu)化和調整，達到提高發(fā)酵水平和降低成本的目的。