不同蜜環(huán)菌菌株對紅天麻農藝性狀、產量及質量的影響

王 永，王彩云，侯 俊，成忠均，周茂嫦，鄒 濤，徐慶祝，阮培均*

(1. 畢節(jié)市中藥研究所，貴州 畢節(jié) 551700; 2. 大方縣扶貧開發(fā)辦公室，貴州 畢節(jié) 551700)

蜜環(huán)菌(Armillariamellea)隸屬擔子菌門(Basidiomycota)、傘菌目(Agaricales)、泡頭菌科(Physalacriaceae)、蜜環(huán)菌屬(Armillaria)[1]，具有強筋壯骨、增智健腦、祛風活筋、降尿酸、延緩衰老以及明目的功效，其發(fā)酵產物對肢麻、抗菌、消炎、失眠以及耳鳴等癥有較好的療效[2-4]，主要分布于四川、吉林、山西、甘肅、湖北、遼寧、黑龍江、福建、貴州、云南等地，是天麻的共生菌，為天麻的生長發(fā)育提供養(yǎng)分。由于不同的天麻對蜜環(huán)菌菌株的適應能力存在差異，且不同蜜環(huán)菌菌株形成菌索的能力以及菌索侵染天麻皮層組織的能力也不同，因而生產上采用不同的蜜環(huán)菌菌株極有可能影響天麻的產量和質量。另外，由于我國蜜環(huán)菌的基礎研究薄弱，對天麻共生蜜環(huán)菌的選育不夠系統(tǒng)，導致天麻品種退化，產量不穩(wěn)，病害逐年加重[5]。因此培育優(yōu)良的蜜環(huán)菌菌株對提高天麻的產量和質量有重要意義。天麻(GastrodiaelataBlume)是一種藥食同源的蘭科多年生草本植物，富含多糖、酚類、甾醇和有機酸等多種化學成分，具有抗驚厥、降壓、延緩衰老、抗炎、鎮(zhèn)痛、保護神經細胞、增強免疫能力等功效[6-10]，也是臨床常用的中藥，根據莖稈顏色可分為黃天麻(GastrodiaelataBl. f. Flavida S. Chow)、綠天麻(GastrodiaelataBl. f. Viridis Makino)、紅天麻(GastrodiaelataBl. f.elata)和烏天麻(GastrodiaelataBl. f. Glauca S. Chow)等變型[11]，其中紅天麻的產量高于黃天麻、綠天麻和烏天麻。由于天麻具有獨特的藥用價值[12]，我國自20世紀70年代以來相繼開展了天麻的相關研究，但主要集中于化學成分、種植生產、遺傳多樣性、指紋圖譜、藥理研究等方面[13-15]。農藝性狀可以代表作物品質特征的相關性狀，具有直接、便于觀察以及與作物的生產直接關聯(lián)等特點，也是藥用植物品質評價的重要措施之一[16]。天麻地下塊莖的產量、質量是由多個相關因素決定的，各農藝性狀對產量、質量的影響有主次之分，且各個性狀之間存在著不同程度的相關性[17]，在實際工作中，弄清各農藝性狀對產量、質量影響的主次關系，可以為天麻栽培、品種選育和質量控制提供科學依據，但近幾年有關蜜環(huán)菌對天麻產量、質量、農藝性狀綜合比較分析的研究報道較少[18-19]。本研究收集貴州主產區(qū)的野生蜜環(huán)菌資源，經分離純化后篩選出5個優(yōu)良蜜環(huán)菌菌株，并與紅天麻進行仿野生栽培試驗，研究各蜜環(huán)菌栽培種對青岡菌材的侵染情況以及對紅天麻產量、農藝性狀、有效成分含量的影響，以期篩選出適宜黔西北地區(qū)天麻生長的優(yōu)良野生蜜環(huán)菌菌種。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試蜜環(huán)菌 2015年3月至11月采集貴州省天麻主產區(qū)的野生蜜環(huán)菌菌株，通過分離和純化，并與陜西西鄉(xiāng)食用菌研究所提供的A9菌株進行比較。篩選出5株優(yōu)良的野生蜜環(huán)菌菌株，編號為MHJ-1、MHJ-3、MHJ-6、MHJ-7、MHJ-8。各蜜環(huán)菌采樣點詳情見表1[20]。

表1 野生蜜環(huán)菌菌株采樣點詳情

1.1.2 供試材料 供試天麻由貴州省畢節(jié)市大方縣九龍?zhí)炻殚_發(fā)有限公司提供，經貴州省畢節(jié)市中藥研究所阮培均研究員鑒定為蘭科天麻屬植物紅天麻(G.elataBl. f.elata)。選擇無損傷、大小均勻、無病蟲害的白麻作試驗用種。

1.1.3 主要試劑 天麻素(批號：110807-201608)、對羥基苯甲醇(批號：111970-201702)對照品購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純(迪馬科技有限公司)，水為娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

1.1.4 儀器及色譜條件 Agilent 1260高效液相色譜儀；色譜柱：Zorbax SB-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：0.05%(質量分數) H3PO4∶乙腈=97∶3，流量：1 mL/min，檢測波長220 nm，柱溫35 ℃，天麻素峰保留時間5.17 min，對羥基苯甲醇峰保留時間8.75 min。

1.2 方法

1.2.1 蜜環(huán)菌栽培種培養(yǎng) 配方(質量分數，%)：鋸木段50，木屑20，玉米面7，麩皮20，白糖2，石膏1，加水至含水量為70～80，裝入菌袋，塞上棉塞，121 ℃滅菌45～60 min。培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度24～26 ℃，光照時間10～12 h/d，光照強度1 500～2 000 lx。

1.2.2 菌材培養(yǎng) 參照文獻[21]的方法，在挖好的各小區(qū)(0.5 m2)內培養(yǎng)菌材。選擇長40～50 cm、直徑6.0～7.0 cm的青岡木段，于兩側每隔5.0～7.0 cm砍一個深至木質部的魚鱗口；先將各小區(qū)底部土壤挖松整平，撒上一層濕樹葉，樹葉上平鋪一層青岡木段并在各木段間接種蜜環(huán)菌栽培種，用細沙土填充木段間隙，以蓋過木段為宜。按如上操作放入第二層青岡木段，然后覆土至與地平齊，最后蓋上一層新鮮樹葉或秸稈以保濕發(fā)菌。每個小區(qū)用2袋(聚乙烯塑料袋規(guī)格為28 cm×14 cm)蜜環(huán)菌栽培種。

1.2.3 天麻仿野生栽培試驗 試驗于2016年3月至11月在大方縣九龍?zhí)炻殚_發(fā)有限公司天麻繁育基地(2 212.8 m，104.3°E，26.87°N)進行。每個小區(qū)面積為0.5 m2，天麻平均接種量300 g，每個蜜環(huán)菌供試菌株作為1個處理，每個處理用1袋蜜環(huán)菌栽培種，隨機區(qū)組排列，重復3次。以陜西西鄉(xiāng)食用菌研究所提供的A9菌株為試驗對照。8個月后收獲，統(tǒng)計產量。

1.2.4 農藝性狀調查 天麻為無綠葉、無根的異養(yǎng)型多年生草本植物，主要生長在地下，地下塊莖在繁殖季節(jié)提供養(yǎng)分抽薹、開花、結實后腐爛消亡，完成世代更替，因此本研究對紅天麻地下塊莖產量以及相關農藝性狀指標的調查僅選取地下塊莖部位。具體性狀指標為塊莖厚度、長度、寬度、長寬比、點狀橫環(huán)紋環(huán)數、環(huán)間距、肚臍眼直徑、箭芽長度。

1.2.5 天麻蒸制 取新鮮天麻，按25～50 g、50～100 g、100～150 g、大于150 g四個等級分檔后，洗去表面臟物及泥土，放于蒸籠中蒸制不同時間。以單個天麻重量計，25～50 g大火蒸10 min，50～100 g大火蒸15 min，100～150 g大火蒸20 min，大于150 g大火蒸30 min，蒸制結束后置于干燥箱中55 ℃恒溫干燥至含水量15%以下(期間取出發(fā)汗2次)，取出稱重，計算藥材折干率。

1.2.6 天麻有效成分含量測定 按中國藥典2015版[22]天麻炮制項下的要求進行天麻樣品處理、有效成分含量測定。

1.2.7 數據統(tǒng)計與分析 使用excel2007、spss20.0、origin8.0進行試驗數據統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 不同蜜環(huán)菌菌株栽培種生長以及菌材培養(yǎng)情況比較

觀察記錄各蜜環(huán)菌栽培種的生長情況以及對青岡菌材的培養(yǎng)情況(表2)。由表2可知，蜜環(huán)菌MHJ-1栽培種的生長速度最快、滿袋時間最短，且菌索粗壯、潔白，與菌材共培養(yǎng)4個月后，菌材表面4/5布滿菌索，菌索入侵菌材木質部深達5.2 cm，培養(yǎng)效果最好。與對照菌株A9相比，MHJ-1、MHJ-3、MHJ-6、MHJ-7及MHJ-8這6株菌株從生長情況及滿袋天數分析，均為比較優(yōu)良的菌株。尤其是菌株MHJ-1在菌袋中的菌索直徑達4～5 mm，培養(yǎng)22 d后菌索已長滿袋壁，看不清內部樹枝；其次為菌株MHJ-3、MHJ-6。但各菌株是否有利于天麻生長主要取決于田間試驗結果。

表2 不同蜜環(huán)菌菌株栽培種生長及對青岡菌材的培養(yǎng)效果

2.2 不同蜜環(huán)菌處理對紅天麻農藝性狀的影響

紅天麻的環(huán)間距、箭芽長度、點狀橫環(huán)紋環(huán)數在6個不同蜜環(huán)菌處理間差異不顯著，可作為品質控制的性狀指標，其他農藝性狀存在一定差異。其中，菌株MHJ-1栽培的天麻塊莖長度、寬度、長寬比、肚臍眼直徑均值均最大，但與對照菌株A9差異不顯著；菌株A9培養(yǎng)的天麻塊莖厚度均值最大，為46.69 mm，塊莖長度、寬度、長寬比、肚臍眼直徑均值僅次于菌株MHJ-1。菌株MHJ-8栽培的天麻塊莖長度、寬度、長寬比、厚度、肚臍眼直徑均值最小，其中塊莖長度、寬度、厚度、肚臍眼直徑極顯著低于對照菌株。在塊莖長度、厚度、長寬比三個農藝性狀方面，菌株MHJ-1、A9明顯優(yōu)于菌株MHJ-3、MHJ-6、MHJ-7、MHJ-8，詳情見表3。

表3 不同蜜環(huán)菌菌株處理的紅天麻的主要農藝性狀比較

2.3 不同蜜環(huán)菌菌株處理對紅天麻產量的影響

從表4可以看出，在紅天麻的仿野生栽培試驗中，菌株MHJ-1的伴栽效果最佳，鮮品平均產量達8.78 kg/m2，與對照菌株A9存在顯著差異；干品平均產量為2.57 kg/m2，與對照菌株A9差異不顯著，與其余菌株差異極顯著；折干率僅次于對照菌株A9。菌株MHJ-3、MHJ-6、MHJ-7、MHJ-8伴栽的天麻干品產量極顯著低于菌株MHJ-1及菌株A9，其中菌株MHJ-8的伴栽效果最差，鮮品平均產量、折干率、干品產量均最低。從伴栽紅天麻的鮮品產量、折干率、干品產量三個方面考慮，菌株MHJ-1優(yōu)于其他菌株。

表4 不同蜜環(huán)菌菌株處理的紅天麻的產量分析

2.4 不同蜜環(huán)菌菌株對各級紅天麻質量及比例的影響

將收獲后的鮮天麻按白麻、箭麻、不同等級稱重得表5、表6。由表5、表6可以看出：菌株MHJ-1培養(yǎng)的菌材伴栽天麻箭麻產量最高，達7.76 kg/m2，與對照菌株A9間差異不顯著，所占比例僅低于A9菌株0.01%；其一級、三級麻所占比例最大。菌株A9伴栽的天麻鮮品箭麻質量為7.38 kg/m2，顯著高于菌株MHJ-3、MHJ-6，極顯著高于菌株MHJ-7、MHJ-8伴栽的天麻；箭麻所占比例最大，與菌株MHJ-1、MHJ-3差異不顯著，但極顯著高于菌株MHJ-6、MHJ-7、MHJ-8的箭麻占比。菌株MHJ-6伴栽的天麻鮮品箭麻質量為6.24 kg/m2，所占比例為83.96%；其中，二級天麻所占比例最大，為31.80%。菌株MHJ-8伴栽的天麻中，四級天麻及白麻所占比例最大，分別為23.30%、19.47%。

表5 不同蜜環(huán)菌菌株對紅天麻大小及比例的影響

表6 不同蜜環(huán)菌菌株對各級紅天麻所占比例的影響

天麻根據塊莖的質量劃分等級銷售，本研究將收獲的天麻分為箭麻和白麻(塊莖質量<25 g)，又根據天麻塊莖大小將箭麻分為四個等級，其中一級天麻塊莖質量大于150 g，二級天麻塊莖質量150～100 g，三級天麻塊莖質量100～50 g，四級天麻塊莖質量50～25 g。2017年底，鮮品紅天麻“一級”價格80元/kg，“二級”60元/kg，“三級”45元/kg，“四級”30元/kg，白麻60元/kg。按紅天麻各等級比例以及不同等級價格，計算每平方米產值(表5)。由表5可知，菌株MHJ-1、A9、MHJ-3、MHJ-6、MHJ-7、MHJ-8伴栽的天麻每平方米產值分別為464.10、445.57、400.28、395.37、351.35、333.28元。菌株MHJ-1培養(yǎng)的天麻每平方米產值與菌株A9無顯著差異；但菌株MHJ-6、MHJ-7、MHJ-8培養(yǎng)的天麻產值極顯著低于菌株A9，菌株MHJ-3伴栽的天麻產值顯著低于對照菌株A9。就天麻產值而言，菌株MHJ-1優(yōu)于其他菌株。

2.5 不同蜜環(huán)菌菌株對紅天麻質量的影響

根據2015版國家藥典規(guī)定，天麻干燥塊莖醇溶性浸出物含量不得少于15.0%，總灰分含量不得超過4.5%，水分含量不得超過15.0%，對羥基苯甲醇(C7H8O2)和天麻素(C13H18O7)的總含量不得低于0.25%。從表7可以看出，菌株MHJ-1、A9、MHJ-3、MHJ-6、MHJ-7、MHJ-8培養(yǎng)的天麻塊莖醇溶性浸出物含量均大于15.0%，總灰分含量均小于4.5%，水分含量均小于15.0%，對羥基苯甲醇與天麻素總含量均高于0.25%，符合國家藥典要求。

表7 不同蜜環(huán)菌菌株對紅天麻主要成分含量的影響

從表7可以看出，菌株MHJ-1伴栽的天麻醇溶性浸出物含量最高，為29.24%，高出國家藥典標準要求的14.24%，極顯著高于其他菌株培養(yǎng)的紅天麻醇溶性浸出物含量；水分含量最低，為9.84%，極顯著低于其他處理。對照菌株A9的灰分含量最低，為1.83%，極顯著低于其他菌株。菌株MHJ-1天麻素峰面積最大(圖1)，天麻素含量最高，達0.946%，與對照菌株A9差異極顯著；對羥基苯甲醇含量為0.193%，極顯著低于對照菌株A9，但僅次于菌株A9；天麻素與對羥基苯甲醇總含量最高，為1.140%，是國家藥典標準要求的4.56倍，極顯著高于對照菌株。菌株A9伴栽的紅天麻對羥基苯甲醇峰面積最大(圖1)，含量高達0.250%，與其他處理差異極顯著。菌株MHJ-8伴栽的天麻醇溶性浸出物含量最低，為19.83%；天麻素含量、對羥基苯甲醇含量、天麻素與對羥基苯甲醇總含量均最低，分別為0.318%、0.143%、0.461%。根據紅天麻的醇溶性浸出物含量、天麻素與對羥基苯甲醇總含量，菌株MHJ-1伴栽的天麻質量最好。

圖1 不同蜜環(huán)菌伴栽的紅天麻的天麻素、對羥基苯甲醇檢測圖譜(高效液相色譜法)Fig.1 The fingerprints of gastrodin and 4-Hydroxybenzyl alcohol in G. elata Bl. f. elata between different A. mellea strains employed to high performance liquid chromatography (HPLC)

3 討 論

天麻仿野生栽培試驗結果表明，不同的蜜環(huán)菌菌株伴栽紅天麻，會對其農藝性狀有不同的影響。菌株MHJ-1培養(yǎng)的天麻塊莖長度、寬度、肚臍眼直徑、長寬比均值均高于對照菌株A9，但未表現(xiàn)出差異性。紅天麻主要農藝性狀的比較分析顯示，點狀橫紋環(huán)數、箭芽長、環(huán)間距在幾個蜜環(huán)菌菌株間沒有差異；塊莖長度、寬度、長寬比、肚臍眼直徑、厚度差異不顯著，屬于較穩(wěn)定的性狀，這與王麗等[17]的研究結果相符。

從天麻仿野生栽培試驗結果可以看出，不同確蜜環(huán)菌菌株會顯著影響天麻的產量以及各級天麻質量、比例。生物學特性優(yōu)良的菌株MHJ-1和A9菌索粗壯、生長速度快、滿袋時間短、菌索分支多，對青岡菌材的侵染效果好，伴栽紅天麻的效果也最佳。這與王秋穎等[18]、陳明義等[19]、孫士青等[5，23]的研究結果基本相符，即天麻產量與蜜環(huán)菌菌株的生長速度正相關。菌株MHJ-1伴栽的天麻采收后的鮮品產量是播種前的14.63倍，其伴栽效果優(yōu)于對照，且存在顯著差異；一級麻、三級麻所占比例最大，分別為13.01%、29.85%，但與對照菌株A9差異不顯著。菌株MHJ-1培養(yǎng)的天麻每平方米產值為464.10元，極顯著高于菌株MHJ-7、MHJ-8，顯著高于菌株MHJ-3、MHJ-6，高出對照菌株A9 18.53元/m2，但產值無顯著差異性。

從天麻仿野生栽培試驗結果可看出，不同蜜環(huán)菌菌株伴栽的紅天麻有效成分含量不同。菌株MHJ-1伴栽的天麻醇溶性浸出物含量、天麻素含量、對羥基苯甲醇與天麻素總含量均最高，且與其他菌株差異極顯著。以對羥基苯甲醇、天麻素總含量和醇溶性浸出物含量為指標，菌株MHJ-1伴栽的紅天麻質量最好。

綜上所述，天麻的農藝性狀、產量以及質量與蜜環(huán)菌菌株的生長速度及長勢呈正相關，即生長速度快、滿袋時間短、菌索分枝多、粗壯潔白、長勢旺盛的蜜環(huán)菌菌株有利于青岡菌材的培養(yǎng)，使用該菌及菌材培養(yǎng)的紅天麻不僅對羥基苯甲醇與天麻素總含量、醇溶性浸出物含量高，品質好，而且產量高，產值高。本研究中菌株MHJ-1對天麻產量、質量的影響優(yōu)于菌株A9的原因，可能是菌株MHJ-1為野生蜜環(huán)菌子實體分離純化而得，且從未用于天麻栽培，這與王曉玲等[24]的研究結果相符。

在開展藥用植物品種選育以及品質評價時，不僅要考慮產量、產值，還要考慮藥效。雷有成等[25]報道，不同等級天麻的天麻素含量不同，天麻素含量是衡量天麻等級的一個指標。在下一步的系統(tǒng)選育及質量控制中，將深入研究不同的蜜環(huán)菌菌株與天麻其他化學成分之間的相關性，建立多指標評價體系，從而系統(tǒng)評價不同的蜜環(huán)菌菌株對天麻產量、質量的影響。