罌粟籽滅活效果測(cè)定方法的建立

尤 佳， 文朝慧， 強(qiáng)曉婷， 朱建寧

(1.蘭州海關(guān)技術(shù)中心， 蘭州 730010；2.甘肅省藥品監(jiān)督管理局藥品和醫(yī)療器械不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)中心， 蘭州 730070;3.甘肅省藥品監(jiān)督管理局審評(píng)認(rèn)證中心， 蘭州 730070)

我國(guó)對(duì)罌粟種植實(shí)行嚴(yán)格管制，除藥用科研外，一律禁植。國(guó)家衛(wèi)計(jì)生函[2013]113號(hào)文件[1]規(guī)定，罌粟種子不可作為香料和調(diào)味品使用。然而在西方很多國(guó)家，罌粟籽是傳統(tǒng)調(diào)味品，歐美主要用于各種糕點(diǎn)，在印度，罌粟籽制成粉加入飲料中。甘肅農(nóng)墾集團(tuán)有限公司是我國(guó)藥用罌粟的唯一種植、加工、調(diào)撥單位，該公司把滅活罌粟籽的消費(fèi)群體對(duì)準(zhǔn)國(guó)際市場(chǎng)，近十年來將大批次滅活罌粟籽出口印度、美國(guó)、加拿大、英國(guó)、德國(guó)、荷蘭、羅馬尼亞等國(guó)家，2018年達(dá)到出口巔峰，出口滅活罌粟籽6 614 t，共148批次，貨值1 360.8萬美元。2002年，海關(guān)總署辦公廳聯(lián)合質(zhì)檢總局發(fā)布《海關(guān)總署辦公廳、國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局辦公廳關(guān)于大麻籽、罌粟籽進(jìn)出口應(yīng)證問題的通知》[2]中強(qiáng)調(diào)對(duì)以貿(mào)易方式申報(bào)進(jìn)出口的大麻籽(商品編碼：12079999)和罌粟籽(商品編碼：12079100)，海關(guān)應(yīng)憑檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)注明的“已經(jīng)檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)滅活處理”或“經(jīng)檢驗(yàn)鑒定發(fā)芽率為0%”的《入/出境貨物通關(guān)單》辦理進(jìn)出口驗(yàn)放手續(xù)。檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)直接滅活處理的，注明“已經(jīng)檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)滅活處理”，檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)做發(fā)芽試驗(yàn)的，注明“經(jīng)檢驗(yàn)鑒定發(fā)芽率為**%”(**按實(shí)際檢驗(yàn)結(jié)果填寫)。然而現(xiàn)有涉及發(fā)芽方法的標(biāo)準(zhǔn)只針對(duì)普通常規(guī)作物種子，發(fā)芽計(jì)數(shù)方法對(duì)罌粟籽等涉毒種子不適用，而且國(guó)內(nèi)外暫無涉毒種子滅活效果鑒定方法的研究。基于此，本實(shí)驗(yàn)研究罌粟籽滅活效果測(cè)定及評(píng)價(jià)方法，為制定相關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)提供技術(shù)支撐。

圖1 20 ℃培養(yǎng)第5天Fig.1 The 5th day of culture at 20 ℃

1 材料與方法

1.1 材 料

未滅活罌粟籽(PapaversomniferumL.)、滅活罌粟籽均由甘肅農(nóng)墾集團(tuán)有限公司提供，其中未滅活罌粟籽材料已在蘭州新區(qū)公安局報(bào)備。

1.2 最適發(fā)芽條件篩選

選取均勻、飽滿、一致的種子，每個(gè)處理4次重復(fù)， 每個(gè)重復(fù)100粒種子。用紙上發(fā)芽方法，選取TP發(fā)芽床，置于培養(yǎng)箱中且保持濾紙潮濕。設(shè)置3個(gè)恒溫(A1：20 ℃、A2：25 ℃、A3：30 ℃)和2個(gè)變溫(B1：15 ℃ 16 h/25 ℃ 8 h，20 ℃ 16 h/30 ℃ 8 h)處理。每天光照8 h，黑暗16 h。種子移入培養(yǎng)箱后第3天開始記錄，每24 h記錄一次，變溫處理下每天高溫條件下光照8 h，低溫條件下黑暗16 h。在發(fā)芽期間每日對(duì)發(fā)芽的種子進(jìn)行觀察，記錄發(fā)芽數(shù)量。待發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)束后，觀察記錄正常種苗、不正常種苗、新鮮未發(fā)芽、死種子的數(shù)量。并參照農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程(GB/T 3543—1995)[3]、草種子檢驗(yàn)規(guī)程(GB/T 2930.7—2017)[4]計(jì)算種子發(fā)芽率，根據(jù)種子在最適發(fā)芽條件下的發(fā)芽時(shí)間確定計(jì)數(shù)時(shí)間，以種子發(fā)芽率超過50%的天數(shù)為初次計(jì)數(shù)時(shí)間，以種子達(dá)到最大發(fā)芽率的天數(shù)為末次計(jì)數(shù)時(shí)間。發(fā)芽率(%)=( 發(fā)芽終期全部正常種苗數(shù)/供試種子數(shù))×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0軟件對(duì)發(fā)芽率進(jìn)行差異顯著性統(tǒng)計(jì)分析，分析采用Duncan法，p<0.05，Excel軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 罌粟籽最適發(fā)芽溫度

發(fā)芽測(cè)定結(jié)果(表1)顯示，罌粟籽在20 ℃條件下發(fā)芽率最高(圖1)，達(dá)94%，隨著溫度升高，發(fā)芽率逐漸降低(圖2)，到30 ℃時(shí)發(fā)芽率為0%(圖3)，B1變溫發(fā)芽率為86%(圖4)，B2變溫發(fā)芽率為10%(圖5)，均低于20 ℃恒溫條件下。因此，判定罌粟籽最適發(fā)芽溫度為20 ℃。

表1 不同溫度處理對(duì)罌粟籽發(fā)芽的影響Table 1 Effects of different temperature treatments on seed germination percentage of poppy seeds

2.2 罌粟籽發(fā)芽計(jì)數(shù)時(shí)間

根據(jù)罌粟籽發(fā)芽率計(jì)數(shù)規(guī)律，初次計(jì)數(shù)時(shí)間確定為第5天，末次計(jì)數(shù)時(shí)間確定為第7天。

2.3 罌粟籽滅活效果測(cè)定方法

根據(jù)罌粟籽的最適發(fā)芽溫度(20 ℃)及初次和末次計(jì)數(shù)時(shí)間，建立了罌粟籽滅活效果測(cè)定方法：

1) 送驗(yàn)樣品充分混合均勻，隨機(jī)數(shù)取250粒種子，以感量為0.000 1 g的分析天平稱重并記錄數(shù)據(jù)，從樣品袋中隨機(jī)選取不同點(diǎn)，以剛稱重?cái)?shù)據(jù)10倍的重量稱取4個(gè)重復(fù)?；蛘呤褂脭?shù)粒儀，隨機(jī)數(shù)10 000粒種子，以2 500粒為一個(gè)重復(fù)。

圖2 25 ℃培養(yǎng)第5天Fig.2 The 5th day of culture at 25°C

圖3 30 ℃培養(yǎng)第5天Fig.3 The 5th day of culture at 30 ℃

2) 將一層或多層發(fā)芽紙平鋪在透明的發(fā)芽盒內(nèi)，倒入適量無菌蒸餾水濕潤(rùn)發(fā)芽紙，發(fā)芽期間發(fā)芽床應(yīng)始終保持濕潤(rùn)。將種子均勻撒在濕潤(rùn)的發(fā)芽床上，每粒種子間應(yīng)保持適當(dāng)?shù)木嚯x，以盡量減少相鄰種子間的影響，蓋上盒蓋，貼上標(biāo)簽。

3) 發(fā)芽盒置于20 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，每天給予8 h光照。期間要經(jīng)常檢查溫度、水分和通氣狀況。如有感染的種子應(yīng)取出沖洗，嚴(yán)重感染的應(yīng)更換發(fā)芽床。

4) 培養(yǎng)第5天進(jìn)行第一次鑒定計(jì)數(shù)，第7天進(jìn)行末次鑒定計(jì)數(shù)。

5) 每粒種子或幼苗的鑒定都必須按照GB/T 3543.4附錄A規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。在計(jì)數(shù)過程中，發(fā)育良好幼苗應(yīng)從發(fā)芽床中揀出，對(duì)可疑、損傷、畸形或不均衡的幼苗，觀察至末次鑒定計(jì)數(shù)。嚴(yán)重腐爛的幼苗或種子應(yīng)從發(fā)芽床中除去，并隨時(shí)增加計(jì)數(shù)。

2.4 罌粟籽滅活效果評(píng)價(jià)

4個(gè)重復(fù)中沒有種子正常發(fā)芽，所有種子為死種子，判定發(fā)芽率=0%，滅活效果合格；

4個(gè)重復(fù)中，≥1粒種子正常發(fā)芽，即判定發(fā)芽率≠0%，滅活效果不合格。

3 討 論

3.1 滅活效果測(cè)定及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

罌粟籽因其特殊性，國(guó)內(nèi)外鮮見其檢驗(yàn)方法的報(bào)道，現(xiàn)有相關(guān)種子品質(zhì)檢驗(yàn)方面的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)有農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程(GB/T 3543-1995)、草種子檢驗(yàn)規(guī)程(GB/T 2930.7-2017)、林木種子檢驗(yàn)規(guī)程(GB/T 2772-1999)[5]，但這三個(gè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)僅涉及常規(guī)普通植物種子，適用范圍不包括罌粟種子。尤其重要的一點(diǎn)，這三個(gè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)發(fā)芽率結(jié)果計(jì)算和表示中寫道：“正常幼苗、不正常幼苗和未發(fā)芽種子百分率的總和必須為100%，平均百分率修約到最近似的整數(shù)，修約0.5進(jìn)入最大值中?！边@意味著當(dāng)遇見小于0.5%的發(fā)芽率，結(jié)果會(huì)近似為0，這對(duì)于常規(guī)需要正常發(fā)芽的植物種子來說是合適的，但并不適合判定罌粟籽的滅活效果。原因有二：第一，罌粟籽種子非常小，長(zhǎng)約1 mm，寬0.8 mm，千粒重僅為0.362 g，每批出口量至少為50 t。滅活罌粟籽和普通種子相反，發(fā)芽率為0，死種子為100%才算結(jié)果合格，按原有標(biāo)準(zhǔn)一個(gè)發(fā)芽試驗(yàn)需4次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)以100粒計(jì)，每批罌粟籽樣品只需要檢測(cè)400粒樣品即可，但是400粒罌粟種子樣本極少，大約0.142 g，只用這400粒種子的發(fā)芽情況判斷該批次罌粟籽滅活效率是否達(dá)標(biāo)非常不準(zhǔn)確。第二,在實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算中遇到發(fā)芽率大于0.5%的數(shù)值,可按原標(biāo)準(zhǔn)近似為1%,但是實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常出現(xiàn)值大于0%小于0.5%的計(jì)數(shù)。例如發(fā)芽率為0.25%時(shí)，10 000粒種子(重量只有3.62 g)中就會(huì)有25粒正常發(fā)芽長(zhǎng)成健康植株，當(dāng)有10 t貨物時(shí)，即使是0.25%的發(fā)芽率，能長(zhǎng)成健康植株的種子大約為69 060 773粒。然而國(guó)內(nèi)現(xiàn)有所有種子品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中因?yàn)槲磳缁罾浰谧蚜腥肟紤]，計(jì)算都會(huì)將0.25%近似為0%。因此涉毒類種子的滅活效果測(cè)定方法和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)不應(yīng)該參照普通作物種子發(fā)芽方法，對(duì)于涉毒類種子測(cè)定滅活效果時(shí)，試驗(yàn)樣品量要足夠，當(dāng)≥1粒種子正常發(fā)芽，即可判定發(fā)芽率≠0%，滅活效果不合格。

圖4 15 ℃ 16 h，25 ℃ 8 h培養(yǎng)第5天Fig.4 The 5th day of culture at 15 ℃ for 16 hours and 25 ℃ for 8 hours

圖5 20 ℃ 16 h，30 ℃ 8 h培養(yǎng)第5天Fig.5 The 5th day of culture at 20 ℃ for 16 hours and 30 ℃ for 8 hours

3.2 滅活方法

常見種子滅活方法有：高溫蒸煮、化學(xué)試劑處理、60Co輻照、高能電子加速器輻照。滅活處理后的罌粟籽出口用于食品加工，需要考慮食用安全性，因此輻照處理是常用手段。但是輻照處理需反復(fù)操作才能保證滅活效果達(dá)標(biāo)，人力財(cái)力消耗大，高溫蒸煮后再烘干可以保證滅活效果達(dá)標(biāo)，步驟稍微繁瑣，但是成本低廉效果好。

3.3 種子生活力測(cè)定與發(fā)芽率測(cè)定比較

在一般情況下，種子活力測(cè)定和發(fā)芽率測(cè)定的結(jié)果差異不大，而且活力測(cè)定時(shí)間短，但是針對(duì)罌粟籽的滅活效果，本研究未采用生活力測(cè)定來判斷罌粟籽的滅活效果是否達(dá)標(biāo)，原因有二：第一，種子生活力是指種子發(fā)芽的潛在能力或胚具有的生命力，它反映的是種子發(fā)芽率和休眠種子百分率的總和。所以種子生活力測(cè)定能提供給種子使用者和生產(chǎn)者重要的質(zhì)量信息，是種子發(fā)芽和出苗率、幼苗生長(zhǎng)的潛勢(shì)、植株抗逆能力和生產(chǎn)潛力的總和，是種子品質(zhì)的重要指標(biāo)。

一般情況下，高活力的種子在適宜的條件下一定能發(fā)芽，而且發(fā)芽快，出苗整齊，也一定有高的生活力，能發(fā)芽的種子都是具有生活力的種子。但有生活力的種子不一定能發(fā)芽。正常罌粟種子經(jīng)高能電子加速器等機(jī)器輻照后，生活力并未完全喪失，但是做發(fā)芽實(shí)驗(yàn)時(shí)，輻照后的種子只冒出一點(diǎn)點(diǎn)胚芽就停止生長(zhǎng)，最后按不正常幼苗來算結(jié)果。第二，種子生活力測(cè)定方法有氯化三苯四氮唑法(TTC法)[6]、溴麝香草酚藍(lán)法(BTB法)[7]、紅墨水染色法[8]、紙上熒光法[9-10]，這些方法通過種子染色情況來判斷種子是否具有活力，但是罌粟籽非常小，染色后肉眼觀察非常困難，需要借助體式顯微鏡下逐一判斷，耗時(shí)長(zhǎng)且易誤判。因此，用發(fā)芽率來判斷種子滅活效果是否達(dá)標(biāo)是最直觀和準(zhǔn)確的。

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