羊痘病毒研究綜述

黃學(xué)圣，陳軼霞，趙詩佳，宴銘英，龔璟暉

（西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

羊痘病是養(yǎng)羊業(yè)中較為常見的疾病，該病流行范圍廣，每年各地區(qū)時(shí)有發(fā)生，以春、秋兩季流行最為多見。羊痘病毒是導(dǎo)致羊群出現(xiàn)羊痘病的病因，羊痘病毒會(huì)導(dǎo)致綿羊感染出現(xiàn)綿羊痘（Variola caprina；Sheep pox；SPV），山羊感染出現(xiàn)山羊痘（Variola caprina； Goat pox；GPV），是一種感染性很強(qiáng)的急性傳染病，可通過接觸進(jìn)行病毒的傳播。羊群感染該疾病時(shí)，皮膚、黏膜處會(huì)出現(xiàn)大量的丘疹、結(jié)痂、水皰，嚴(yán)重威脅羊群的生長發(fā)育[1]。動(dòng)物痘病中羊痘病毒是危害最大也是最危險(xiǎn)的一種，感染羊痘病毒的羊群將會(huì)給當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。不同的菌株在感染羊群后所表現(xiàn)出的毒力不同，有的毒株致死率為10%～58%或達(dá)到75%～100%。在易感的羊群中，可以導(dǎo)致剛出生不久的小羊的病死率高達(dá)100%，而在妊娠中的母羊則極易發(fā)生流產(chǎn)[3]。

1 病原分類及形態(tài)特征

1.1 病原的分類

羊痘病毒屬于痘病毒科，脊索動(dòng)物痘病毒亞科，羊痘病毒屬。其中包含兩種具體的病毒，一是綿羊痘病毒，簡(jiǎn)稱為SPPV，二是山羊痘病毒，簡(jiǎn)稱為GTPV。分析羊痘病毒的遺傳物質(zhì)，能夠得到的結(jié)果是，DNA為該病毒的遺傳物質(zhì)，并且是線性雙股的，特別之處在于，在具有相同類型的病毒中，可以在細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制，而且在結(jié)構(gòu)上有囊膜，長度在150 kb左右[4]。

1.2 形態(tài)特征

使用電子顯微鏡，可以看到羊痘病毒的具體形態(tài)，在病毒發(fā)展的初期階段，大多是卵圓形的，大小一般在 250～350 nm；成熟后的羊痘病毒在電子顯微鏡下觀察，也多呈現(xiàn)為卵圓形，大小約為（150～180）nm×（150～180）nm[5]。當(dāng)病毒已經(jīng)進(jìn)入到宿主細(xì)胞中時(shí)，宿主細(xì)胞也一般是橢圓形的，且會(huì)產(chǎn)生胞漿包涵體。觀察外層的病毒粒子的結(jié)構(gòu)可以發(fā)現(xiàn)，其外層是管狀形的，在其脂蛋白膜外面，有兩個(gè)啞鈴形狀的核酸芯髓[6]。該病毒的核酸是由雙股DNA組成的，分子質(zhì)量在（130×106）ku～（240×106）ku左右。

1.3 傳播途徑

羊痘病毒傳染性強(qiáng)，無論是哪種年齡階段以及品種的羊都是該病毒的寄主。羊群一般都為集中飼養(yǎng)，羊舍擁擠，感染的羊與健康的羊接觸密切，導(dǎo)致該病傳播率高，爆發(fā)迅速。羊痘病毒在痂皮內(nèi)也可存活很久，不慎接觸的羊也會(huì)感染該病毒。但該病主要由呼吸道感染傳播，或由近距離接觸感染動(dòng)物、或間接傳染。病毒可通過體液、皮膚及黏膜傷口進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，蚊蟲叮咬也會(huì)導(dǎo)致該病毒傳播[7]。

2 臨床癥狀

羊在感染羊痘病毒后有一段時(shí)間的潛伏期，一般情況下潛伏的時(shí)間為6～8 d，山羊痘病的感染潛伏期為5～10 d。羊感染病毒后最先表現(xiàn)為精神萎靡，呼吸不暢，食欲不振，呼吸短促等，伴有流涕、結(jié)膜充血、眼瞼腫脹、體溫升高等癥狀[8]。羊的皮膚黏膜上出現(xiàn)痘疹是羊痘病臨床上最典型的病變癥狀。受到該病毒感染的羊，一般會(huì)在鼻子、眼睛、尾根和乳房等部位出現(xiàn)痘疹。痘疹初始為紅斑，隨后迅速形成直徑3～5 mm的硬圓丘疹。丘疹經(jīng)5 d左右會(huì)形成水泡，水泡經(jīng)過2～4 d變成膿包，膿包持續(xù)2 d左右會(huì)干燥結(jié)痂脫落。

3 病原分子的生物學(xué)特性

SPPV與GPPV同屬的病毒的基因都是在150 kb左右，具有很高的同源性，并且，對(duì)于二者的核苷酸進(jìn)行研究之后就會(huì)發(fā)現(xiàn)，大約96%的序列都是一致。在CPV基因組中，在其中間含中間編碼區(qū)，與其他痘病毒的結(jié)構(gòu)是一致的，并且還具有反向末端重復(fù)序列（Inverted terminal repeat，ITR），且兩端的序列是相同的。在GTPV和SPPV基因組中，可以發(fā)現(xiàn)二者都存在147個(gè)開放閱讀框（ORF），可以進(jìn)行編碼的蛋白的數(shù)目很廣泛，一般是可以對(duì)53～2 027個(gè)氨基酸進(jìn)行編碼，編碼密度為93%。對(duì)于這類的病毒的基因組中間的區(qū)域（ORFs024～123）與編碼病毒復(fù)制所需蛋白質(zhì)的其他痘病毒進(jìn)行比對(duì)之后，發(fā)現(xiàn)它們具有同源的保守序列。其在病毒的復(fù)制中主要是擔(dān)任病毒的轉(zhuǎn)錄、DNA 的復(fù)制與修復(fù)RNA的作用，此外，也可以進(jìn)行成熟病毒粒子的胞內(nèi)組裝。在該基因序列的兩端，一端是ORFs001～023，另一端是ORFs124～147，包括一個(gè)有8個(gè)基因的基因家族，以及與逃避宿主的免疫識(shí)別和反應(yīng)的一些基因，主要是在編碼表皮生長因子樣蛋白（EGF-like protein）、絲氨酸蛋白酶抑制劑（serpin）、胞質(zhì)分裂絲蛋白、PKR 阻遏蛋白、白細(xì)胞介素-10（IL-10）等起作用，并且，該基因序列還可以對(duì)宿主進(jìn)行一定的選擇且有一定的致病性，這些是痘病毒所特有的。在該病毒基因組的尾端，存在一個(gè)類似發(fā)夾的環(huán)形結(jié)構(gòu)，經(jīng)過測(cè)定，其大約有75%的（A+T），發(fā)夾結(jié)構(gòu)以及末端重復(fù)序列至少有200 bp[9]。雖然，GTPV與SPPV具有很高的同源性，但是在基因組末端的某些毒力基因和宿主嗜性功能基因上存在一定程度的序列差異。這些差異主要存在于基因組兩端和推測(cè)具有毒力和宿主范圍功能的基因當(dāng)中。如對(duì)于二者的末端的 ITRs就存在很大的差異，GTPV為2 198 bp，SPPV為2 213～2 349 bp；二者的串聯(lián)重復(fù)序列也有一定的差異，在距離末端（ORF001和ORF147）的區(qū)域最近的地方，SPPV有46 bp的ORFs，但GTPV卻并不表達(dá)這一末端重復(fù)序列。

4 診斷方法

根據(jù)臨床表現(xiàn)特征和流行病學(xué)癥狀觀察，就可以判斷羊是否感染上該類病毒。但若有非典型病例出現(xiàn)，則需要在實(shí)驗(yàn)室中用分子學(xué)或血清學(xué)等方法才能確診。羊痘病毒的診斷方法常用的有ELISA方法、PCR鑒定法、電鏡觀察法、血凝試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞中和試驗(yàn)。

利用PCR序列擴(kuò)增的方式可以很快地得到大量從活組織中取出的SPPV的DNA片段。Ireland D C[10]利用SPPV基因組的融合蛋白和P32蛋白設(shè)計(jì)出特定的引物，能特異性擴(kuò)增出SPPV，然后，基于限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和DraⅠ特殊的識(shí)別位點(diǎn)，從而來對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證分析。Balinsky等建立了實(shí)時(shí)PCR方法，該方法只需2 h就能從血清層、鼻拭子、口腔拭子和皮膚病灶處檢測(cè)出病毒[11]。

另外，臨床有的還使用血清學(xué)的診斷方法，比如說，間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)、ELISA、瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)（AGID）等。但是使用該方式時(shí)需要注意抗體交叉反應(yīng)的問題。由于副痘病毒和羊痘病毒的血清型極為類似，從而會(huì)導(dǎo)致對(duì)來自牛、綿羊、山羊病毒毒株的混淆。最近，在Western Blot免疫印跡實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)羊痘病毒的P32抗原和待檢血清進(jìn)行檢驗(yàn)，效果較好。Carn V M等[12]在克隆P32基因之后，并將該基因移植在大腸埃希菌中，最終將該基因以融合蛋白的形式進(jìn)行表達(dá)，此后，基于上述產(chǎn)生的重組抗原，成功建立起新型的ELISA診斷試劑盒，可以用于單克隆抗體的生產(chǎn)。新試劑的出現(xiàn)使得ELISA特異性得以不斷提高。

5 免疫與疫苗

痘病毒可以對(duì)很多的免疫基因進(jìn)行重新編碼，從而使宿主免疫反應(yīng)不起作用或作用較弱。Abu-El-Saad等使用成年瑞士小白鼠實(shí)驗(yàn)，對(duì)小白鼠進(jìn)行SPPV滅活苗或減毒苗接種，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種疫苗12 h后疫苗注射部位的巨噬細(xì)胞功能降低，有利于病毒的入侵。機(jī)體在被SPPV感染后，T細(xì)胞激活并分泌細(xì)胞因子很可能需要5 d時(shí)間[13]；SPPV如何入侵并逃避宿主免疫反應(yīng)，其能力并不是依賴于病毒的感染力，而是病毒入侵之后，改變脾臟的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的活性，使得巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的代償性增強(qiáng)，從而讓宿主免于受到局部免疫抑制而造成的致命后果[14，15]。

在預(yù)防羊感染這類病毒方面，可以使用滅活疫苗或者弱毒疫苗，但是使用前者的效果不好，一般不使用，因?yàn)橹荒軐?shí)現(xiàn)較短時(shí)間的免疫。制備羊痘病毒活疫苗時(shí)可以使用致弱后的病毒毒株，雖然降低了病毒的活性，但是進(jìn)行接種之后，還是會(huì)有較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。其缺點(diǎn)在于，即使接種了弱毒疫苗，還是會(huì)導(dǎo)致羊產(chǎn)生痘疹反應(yīng)，如果情況嚴(yán)重，甚至引起死亡[16]。

被羊痘病毒感染后恢復(fù)健康的羊會(huì)產(chǎn)生終身免疫力，使羊不會(huì)再患上其余的羊痘病毒[17]。目前，研制出更高效更準(zhǔn)確的基因工程疫苗一直是研究人員的目標(biāo)。由于CPV的基因組比一般的病的要大得多，這也增加了外來基因進(jìn)行表達(dá)的能力。利用這一點(diǎn)，可用在GTPV的非編碼區(qū)中把插入外來基因，這樣做的好處在于不會(huì)對(duì)其自身的復(fù)制產(chǎn)生影響，也對(duì)其抗原性無影響，因此，可以利用這個(gè)優(yōu)勢(shì)，生產(chǎn)重組疫苗。如將牛瘟病毒（Rinderpest virus）、小反芻獸疫病毒（Pestedes pttits ruminants virus，PPRV）基因在羊痘病毒載體中進(jìn)行表達(dá)，基于這個(gè)產(chǎn)出的重組單一疫苗，對(duì)牛瘟、羊痘、小反芻獸疫都會(huì)有不錯(cuò)的效果[18，20]。

在發(fā)現(xiàn)羊痘病毒P32蛋白的免疫原性等對(duì)羊痘病毒有很好的防治作用后，P32蛋白仍是近幾年來防治羊痘病的研究熱點(diǎn)，其在預(yù)防CPV感染中也有重要作用[21]。因?yàn)镻32蛋白免疫原性很強(qiáng)大，所以能通過誘導(dǎo)之后產(chǎn)生中和抗體，但由于P32蛋白表達(dá)量低且不穩(wěn)定，關(guān)于P32蛋白的應(yīng)用方法還有待進(jìn)行更多的研究[22]。

如今生命科學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)正蓬勃發(fā)展創(chuàng)新不斷，很多研究學(xué)者都對(duì)羊痘病毒作為活載體疫苗的研究做出了巨大的貢獻(xiàn)。Berhe等[23]人就通過生物科技手段，成功實(shí)現(xiàn)了小反芻獸疫病毒F基因的重組羊痘病毒的構(gòu)建。Aspdcn等[24]也在狂犬病病毒糖蛋白的重組羊痘病毒中取得了巨大的突破。

6 展望

防治羊痘病毒對(duì)羊的侵害應(yīng)該以預(yù)防為主，治療為輔。近年來，畜牧業(yè)遭受羊痘病毒感染而造成經(jīng)濟(jì)損失的報(bào)道仍有發(fā)生，研究出快速、準(zhǔn)確、有效的檢測(cè)和預(yù)防方法勢(shì)在必行。畜牧業(yè)在我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展中起著重要推動(dòng)作用，但我國對(duì)于SPV和GPV的研究仍落后于歐洲等發(fā)達(dá)國家。雖然實(shí)驗(yàn)室中已有用于診斷羊痘病毒的分子和血清學(xué)方法，但市場(chǎng)上，質(zhì)量不同的診斷試劑盒對(duì)診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性仍存在較大的誤差，因此，預(yù)防羊痘病也存在困難。

在生命科學(xué)的分子生物學(xué)領(lǐng)域快速發(fā)展的今天，普通民眾也逐漸加深了對(duì)基因的認(rèn)知，人們對(duì)基因的研究也更加深入，期望以更了解病菌致病的機(jī)制以用于防疫。目前，研究人員對(duì)羊痘病毒的免疫和致病機(jī)制的研究較少，必須加強(qiáng)對(duì)羊痘病毒基因組特性的研究，才能很好地對(duì)羊痘病進(jìn)行預(yù)防和治療，尤其是對(duì)P32蛋白、活載體疫苗的認(rèn)識(shí)要更為全面。