細(xì)胞外基質(zhì)的調(diào)控與腎間質(zhì)纖維化的研究進(jìn)展*

梅昭， 鄭鐵騎， 牟麗云， 邢翔飛△

1三峽大學(xué)人民醫(yī)院，宜昌市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部(湖北宜昌 443000)； 2三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院(湖北宜昌 443002)

腎間質(zhì)纖維化(RIF)是由各種病因?qū)е碌倪M(jìn)行性腎病進(jìn)展至終末期的共同通路，其病理特點(diǎn)是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成增多與降解減少，表現(xiàn)為細(xì)胞與基質(zhì)相互作用失調(diào)，炎性細(xì)胞浸潤和固有細(xì)胞轉(zhuǎn)化[1]。病理狀態(tài)下，促纖維化的細(xì)胞因子表達(dá)增加，過多的ECM在腎間質(zhì)沉積，加上降解酶系調(diào)控減弱是導(dǎo)致RIF的主要原因[2]。因此，抑制引起ECM合成增加的細(xì)胞因子和平衡降解酶系的比例，可延緩和改善RIF的進(jìn)展。本文就促纖維化因子和降解酶系調(diào)控ECM的作用機(jī)制和治療現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，為RIF的防治提供參考。

1 ECM的組成

ECM是細(xì)胞賴以生存的微環(huán)境，由多種不溶性大分子按一定比例和結(jié)構(gòu)構(gòu)建的具有特定物理特性和空間構(gòu)象的動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；其為細(xì)胞提供適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)和機(jī)械信號(hào)，具有連接、支持、抗壓等功能，還與細(xì)胞直接進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)，調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、遷移及凋亡，維持組織的穩(wěn)態(tài)和功能[3]。從組成成分來看，ECM主要由纖維蛋白和多糖蛋白組成：纖維蛋白充當(dāng)基質(zhì)的骨架，分為結(jié)構(gòu)蛋白和黏合蛋白，前者有膠原蛋白(collagen)和彈力蛋白(elastin)，后者有纖維連接蛋白(FN)和層黏連蛋白(LN)；多糖蛋白以高度親水的凝膠狀態(tài)填充在骨架空間，包括蛋白聚糖(proteoglycan)和氨基聚糖(GAG)(硫酸肝素、硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素、透明質(zhì)酸)[4]。從空間結(jié)構(gòu)來看，ECM主要由基底膜(BM)和間隙結(jié)締組織(ICT)構(gòu)成，前者包括Ⅳ、Ⅶ型膠原、LN、蛋白聚糖等，后者有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅸ型膠原、FN及各種蛋白聚糖[5]。

2 ECM的來源

腎臟ECM主要來源于成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞(MF)[6]。生理?xiàng)l件下的成纖維細(xì)胞大多處于靜息狀態(tài)，只有其中一部分產(chǎn)生少量ECM，維持腎間質(zhì)基質(zhì)平衡。MF既有成纖維細(xì)胞的膠原合成能力，又可表達(dá)平滑肌細(xì)胞的特征α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)，是產(chǎn)生ECM的主要效應(yīng)細(xì)胞。正常腎臟中沒有MF，而在RIF中可檢測(cè)到大量的MF[7]。其來源于多條途徑：腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞/內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(EMT/EndoMT)、周細(xì)胞增生、循環(huán)中纖維細(xì)胞浸潤及骨髓來源的巨噬細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化(MTT)[8]。MF以合成和分泌ECM為主，同時(shí)還分泌基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)對(duì)ECM的降解。MF分泌ECM使其組成和含量發(fā)生變化，引起細(xì)胞生物學(xué)行為改變，導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆的病變。

3 ECM的調(diào)控

腎臟ECM 的調(diào)控受到體內(nèi)促纖維化因子和降解酶系統(tǒng)共同作用。ECM的累積取決于促纖維化因子的失衡，促纖維化因子主要包括轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)、血小板衍生因子(PDGF)；ECM的降解主要取決于降解酶系，其中MMPs/TIMPs系統(tǒng)起主要作用。

3.1 促纖維化細(xì)胞因子

3.1.1 TGF-β1 TGF-β是一種主要來源于淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、血小板等，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長與分化的多肽。其由2條分子量12.5 kD 肽鏈構(gòu)成二聚體，每條肽鏈均含112個(gè)氨基酸，是最重要的促纖維化因子。TGF-β有5種亞型，哺乳動(dòng)物中以TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3 3種形式存在，而以TGF-β1最為重要。腎臟中TGF-β1主要分布于腎小球系膜細(xì)胞、腎小管及腎間質(zhì)細(xì)胞[9]，其受體廣泛分布于各種細(xì)胞。TGF-β受體(TβR)有TβRⅠ、TβRⅡ、TβRⅢ三類，其中Ⅰ、Ⅱ類受體(均屬絲/蘇氨酸激酶受體家族)參與TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。TGF-β1通過刺激腎臟固有細(xì)胞增加ECM的合成、抑制MMPs和纖溶酶源激活物(PA)的活性及促進(jìn)TIMPs和纖溶酶源激活物抑制劑(PAI)的合成使ECM降解減少、促進(jìn)細(xì)胞表面ECM受體-整合素的表達(dá)使細(xì)胞與基質(zhì)黏附性增強(qiáng)、誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡或EMT[1]，最終導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化。

TGF-β1主要通過激活下游的Smad和non-Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)參與腎纖維化過程。經(jīng)典的TGF-β/Smad信號(hào)通路中，活化的TGF-β1與TβRⅡ結(jié)合，激活的TβRⅡ募集TβRⅠ，導(dǎo)致Smad2和Smad3磷酸化，活化的Smad2/3與Smad4結(jié)合，使整個(gè)復(fù)合物轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中以增加FN、α-SMA、膠原蛋白基因的轉(zhuǎn)錄[10]。Smads蛋白家族中Smad3是腎纖維化和炎癥損傷的重要致病因子[11]，而Smad2和Smad7具有腎臟保護(hù)作用[12]。TGF-β1還可激活non-Smad信號(hào)通路，包括Wnt/β-catenin信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/ERK信號(hào)通路、PI3K/Akt信號(hào)通路、Notch信號(hào)通路等，參與腎纖維化。

靶向TGF-β1/Smad信號(hào)通路來改善RIF取得一定進(jìn)展。Akagi等[13]早先報(bào)道轉(zhuǎn)染反義寡脫氧核苷酸(ODN)的小鼠腎臟中TGF-β1的mRNA表達(dá)下調(diào)；腎小球腎炎的大鼠體內(nèi)注射抗TGF-β1中和抗體可以明顯減少ECM含量[14]；抗Thy-1 腎炎的大鼠腹腔注射全人抗TβRⅡ單克隆抗體(hTGF-βⅡRAb)后，系膜擴(kuò)張程度減輕，α-SMA、FN及Col Ⅰ顯著減少[15]，說明靶向TGF-β1/Smad信號(hào)通路的各個(gè)節(jié)點(diǎn)，均可改善腎纖維化，但TGF-β1活性廣泛，過度抑制亦會(huì)引起其他病理變化。最近研究的雙特異性抗體TGF-β + FnEDA DVD-Ig或 FnEDA mAb顯示出明顯的優(yōu)勢(shì)，該抗體分子一部分靶向纖維連接蛋白外域A亞單位(FnEDA)，另一部分中和TGF-β1，在阻塞的腎纖維化部位濃度較高，非阻塞部位濃度低，不影響正常部位TGF-β1的活性[16]。

3.1.2 CTGF CTGF又稱CCN2，是CCN蛋白家族(CYP61/CTGF/NOV)中研究最為深入的成員，由349個(gè)氨基酸組成的分子量為34～38 kD的富含半胱氨酸的分泌肽。CCN參與調(diào)控多種重要的生物學(xué)功能，包括細(xì)胞增殖、分化、黏附和血管生成，以及腫瘤發(fā)展和組織纖維化等病理過程[17]。CTGF在人體多種組織中均有表達(dá)，生理?xiàng)l件下，腎小球上皮、近曲小管和間質(zhì)成纖維細(xì)胞均可分泌少量CTGF；在慢性腎疾病進(jìn)展中，CTGF的表達(dá)顯著增加。

CTGF啟動(dòng)子序列-162 bp和-128 bp之間存在TGF-β1的調(diào)控元件，認(rèn)為CTGF是TGF-β1的直接下游信號(hào)。CTGF生物學(xué)特性廣泛：(1)與多種特定受體結(jié)合啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；(2)可結(jié)合細(xì)胞因子，介導(dǎo)與細(xì)胞表面受體結(jié)合和下游信號(hào)通路的啟動(dòng)；(3)CTGF通過與ECM蛋白結(jié)合介導(dǎo)基質(zhì)轉(zhuǎn)化；(4)調(diào)節(jié)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)通路，參與細(xì)胞因子和生長因子活性的調(diào)控[18]。在RIF的進(jìn)展中，CTGF調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和骨形態(tài)生成蛋白(BMP)[19]，與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP6)相互作用，激活Wnt通路和增強(qiáng)胰島素生長因子(IGF)和膠原蛋白表達(dá)而發(fā)揮促纖維化作用[20]。

CTGF結(jié)構(gòu)域4顯示最廣泛的促纖維化活性，用特異性針對(duì)CTGF結(jié)構(gòu)域4的封閉抗體或重組DKK-1(LRP6的內(nèi)源性抑制劑)能有效抑制UUO大鼠腎臟的炎癥和纖維化，說明CTGF結(jié)構(gòu)域4可作為腎纖維化的治療靶標(biāo)[21]。Sirtuin蛋白1(Sirt 1)是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性組蛋白脫乙酰酶，通過促進(jìn)染色質(zhì)沉默和轉(zhuǎn)錄抑制來調(diào)節(jié)各種生物途徑，可抑制纖維化和氧化對(duì)腎臟起保護(hù)作用[22]；SRT1720，一種Sirt1的激活劑，在UUO大鼠模型中可降低氧化應(yīng)激和下調(diào)TGF-β1/CTGF的水平來改善RIF[23]，Sirt1激活劑可能成為下調(diào)CTGF治療腎纖維化的候選藥物。

3.1.3 PDGF PDGF家族包括由PDGF-A/B/C/D 4個(gè)配體及PDGFR-α/β 2種酪氨酸激酶受體鏈，構(gòu)成的二聚體PDGF-AA/BB/CC/DD/AB和PDGFR-αα/ββ/αβ組成[24]。在人體腎臟中，PDGFR-α和PDGFR-β在腎間質(zhì)細(xì)胞，即腎小球系膜細(xì)胞、間質(zhì)成纖維細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)[25]；PDGF亞型在血管平滑肌和系膜細(xì)胞中幾乎都有表達(dá)，PDGF-AA、-CC和-DD在部分腎小管和集合管中表達(dá)，損傷后的PDGF-BB和-DD在腎小管細(xì)胞中高度表達(dá)[26]。PDGF-αα能結(jié)合PDGF-AA/BB/CC，PDGFR-ββ與PDGF-BB/DD有高度親合性[24]。PDGF是重要的促有絲分裂劑，可刺激系膜細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的增殖和ECM的積聚。

PDGF與PDGFR特異性結(jié)合后使受體二聚化和自身磷酸化，致使酪氨酸殘基暴露SH2結(jié)構(gòu)域和底物蛋白分子結(jié)合，引發(fā)下游多條信號(hào)通路：(1)Ras/ERK通路：PDGF與PDGFR結(jié)合后，活化Ras-GTP，啟動(dòng)MAPKs三級(jí)酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)，依次激活Raf1、MEK1/2和ERK1/2，引發(fā)細(xì)胞生長、分化、遷移等過程[27]；(2)PI3K/Akt通路：PDGF與PDGFR結(jié)合，激活PI3K, 使PIP2磷酸化生成PIP3，進(jìn)一步使Akt磷酸化而激活，PDGFR激活的PI3K/Akt通路可促進(jìn)肌動(dòng)蛋白重組，增加細(xì)胞遷移，介導(dǎo)代謝調(diào)節(jié)，刺激細(xì)胞生長和抑制細(xì)胞凋亡[28]；(3)PLC-γ通路：PDGF與PDGFR結(jié)合后，PLC-γ被酪氨酸激酶激活，產(chǎn)生的IP3，促使胞外Ca2+內(nèi)流，胞內(nèi)Ca2+濃度升高促進(jìn)細(xì)胞分裂、增殖[29]；(4)JAK/STAT：活化的PDGFR通過JAK觸發(fā)STAT蛋白的磷酸化，激活STAT5，進(jìn)入細(xì)胞核，激活靶基因，促進(jìn)細(xì)胞生長和分裂[30]。

PDGF亞型中，PDGF-B/D與其受體PDGF-β在RIF發(fā)展中具有關(guān)鍵作用。腎臟疾病模型中，系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腎小管細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中可檢測(cè)上調(diào)的PDGF-B/D受體PDGF-β，特性阻斷PDGF-D介導(dǎo)的PDGFR-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，可顯著降低大鼠系膜細(xì)胞增殖和ECM的積聚[31]，提示PDGF-D可能是對(duì)抗腎纖維化的合適治療靶點(diǎn)。

3.2 ECM降解酶系 腎臟中ECM的降解主要取決于MMPs/TIMPs的動(dòng)態(tài)平衡[32]。MMPs是鈣鋅依賴蛋白水解酶，幾乎能降解ECM的所有成分；目前已明確的有26種，根據(jù)作用底物的差異可以分為六大類[33]：(1)膠原酶(MMP-1/8/13/18)主要水解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原；(2)間質(zhì)溶解酶(MMP-3/7/10/11)可降解FN、LN和Ⅲ、Ⅳ型膠原;(3)明膠酶(MMP-2/9)主要降解Ⅳ型膠原和明膠；(4)彈性蛋白酶(MMP-12)主要降解彈性蛋白和膠原蛋白；(5)膜型基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-14～17)降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原并活化MMP酶原；(6)其他(MMP-19/20)。

MMPs的調(diào)控主要通過轉(zhuǎn)錄水平、酶原激活及內(nèi)源性抑制劑來調(diào)節(jié)[34]。生理情況下的MMPs表達(dá)水平很低，以無活性的酶原形式(pro-MMPs)存在；在炎性因子、生長因子及高糖環(huán)境等因素刺激下可誘導(dǎo)MMPs的表達(dá)。pro-MMPs活化是MMPs發(fā)揮生物學(xué)功能的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其被組織和血漿中的絲氨酸蛋白酶、弗林蛋白酶等去除前肽區(qū)后活化特異性的抑制因子TIMPs抑制MMPs的活化過程，一方面與pro-MMPs形成穩(wěn)定的復(fù)合體阻礙酶原活化；另一方面與活化的MMP以1∶1結(jié)合，抑制其活性。

TIMPs是MMPs內(nèi)源性的抑制劑，通過競(jìng)爭結(jié)合MMP催化結(jié)構(gòu)域活性中心的Zn2+，抑制MMPs的活性。TIMPs在各種細(xì)胞中均有表達(dá)，在人體中發(fā)現(xiàn)有4種，包括TIMP-1/2/3/4：

TIMP-1主要由腎小管系膜細(xì)胞、腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞等分泌，可抑制絕大多數(shù)MMPs；TIMP-2主要抑制MMP-2的活性；TIMP-3可抑制幾乎所有的MMPs成員；TIMP-4在心臟中有較高轉(zhuǎn)錄水平，主要抑制MMP-2活性，阻止新生血管的形成[35]。腎臟中MMPs發(fā)揮抑制作用的主要是TIMP-1/2，TIMP-3僅特定細(xì)胞表達(dá)，認(rèn)為是細(xì)胞分化終末期的標(biāo)志。

明膠酶MMP-2和MMP-9過度表達(dá)時(shí)可破壞對(duì)腎小管基底膜(TBM)完整性而發(fā)生EMT[36]。UUO模型中，MMP-2+/+小鼠ECM的標(biāo)志性蛋白α-SMA顯著增加，而MMP-2-/-小鼠和米諾環(huán)素處理的MMP-2+/+小鼠中ECM的標(biāo)志物表達(dá)減少[37]，對(duì)慢性腎病的犬進(jìn)行腎活檢發(fā)現(xiàn)MMP-2表達(dá)增加[38]，同種異體腎移植后出現(xiàn)的腎纖維化和腎萎縮(IF/TA)中發(fā)現(xiàn)pro-MMP-2/9活性呈上升趨勢(shì)[39]，提示MMP-2/9在RIF中具有致病作用，抑制MMP-2/9可能有益。

4 小結(jié)

ECM的合成與降解由一個(gè)復(fù)雜的體系調(diào)控，這個(gè)過程中促纖維化的細(xì)胞因子活性增強(qiáng)和(或)降解酶系比例失衡，將導(dǎo)致ECM在腎間質(zhì)過度沉積，進(jìn)而形成RIF。目前，人們對(duì)ECM調(diào)控機(jī)制的認(rèn)知并不完全，如ECM來源途徑存在爭議、各種細(xì)胞因子及其形成信號(hào)通路的作用機(jī)制尚未完全闡明。針對(duì)促纖維的細(xì)胞因子和降解酶系的作用節(jié)點(diǎn)，靶向治療可能成為一個(gè)值得研究的方向，防治RIF的研究多集中在某一靶向的抑制劑上，單一靶向抑制只能限制某一細(xì)胞因子或其信號(hào)通路上的作用，而對(duì)其他的細(xì)胞因子和信號(hào)通路促進(jìn)RIF形成的影響未深入探討，為此，多途徑靶向抑制劑的聯(lián)合治療可能是研究的一個(gè)新方向。